一种用高效液相色谱法测定葡萄组织中单体酚含量的方法

摘要

本发明涉及一种用高效液相色谱法测定葡萄组织中单体酚含量的方法，其切换波长使得所测物质均在其最大吸收波长下得到检测，从而在测定层面上客观真实地反映其含量，测定准确，方法简单、灵敏、重现性好。本发明采用的技术方案包括以下步骤：a.采用ZORBAX SB－C18 4.6μm×250μm，5μm色谱柱；b.以1.3％的乙酸水溶液(A)和乙腈(B)为流动相进行梯度洗脱；c.流速0.8ml/min，进样量20μl，柱温30℃；d.确定各目标物质的最大吸收波长，进而切换检测波长使得所有待测物质均在其最大吸收波长下得到检测；e.测定过程中切换检测波长，使得所测物质均在其最大吸收波长下得到检测。

说明书

一、技术领域：

本发明涉及一种色谱检测的方法，具体涉及一种用高效液相色谱法测定葡萄组织中单体酚含量的方法，即一种高效液相色谱切换检测波长同时测定葡萄组织中6种单体酚含量的方法。

二、背景技术：

高效液相色谱法(HPLC)因其检测的有效性和0确性而被广泛应用于农药残留、激素、多酚类物质及有机酸等多个实际测量领域中。通常情况下，利用高效液相色谱法进行样品的测定时需要经过一系列复杂的提取和纯化程序，且大都是在恒定波长下进行检测。对单组分体系而言，在恒定波长下进行测定是行之有效的。但对多组分体系进行测定时，由于各组分的最大吸收波长不尽相同，加之繁琐的前处理过程会使待测物质有一定的损失，因此利用恒定波长法很难全面检测出多组分体系中各组分的真实含量。为了提高多组分体系检测的灵敏度并客观地反映多组分中被测组分的真实含量，应该尽可能地简化样品的前处理步骤并在各物质的最大吸收波长下进行检测，尤其是对微量、痕量物质。

植物多酚(plant polyphenol)是一类存在于植物的皮、根、茎、叶和果实中的具有生物活性的天然化合物，被广泛地应用在化工、医药、林业、食品等领域。众所周知，葡萄富含多种多酚类物质，它是世界上栽培面积最大的水果之一，葡萄多酚已经成为生产实践所需多酚的一个非常重要的来源，能够真实准确地测定不同葡萄组织中多酚含量具有重要的现实意义。

三、发明内容：

本发明的目的在于提供了一种用高效液相色谱法测定葡萄组织中单体酚含量的方法，切换波长使得所测物质均在其最大吸收波长下得到检测，从而在测定层面上客观真实地反映其含量，测定准确，方法简单、灵敏、重现性好。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种用高效液相色谱法测定葡萄组织中单体酚含量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

a、采用ZORBAX SB-C18 4.6μm×250μm，5μm色谱柱；

b、以1.3％的乙酸水溶液(A)和乙腈(B)为流动相，梯度洗脱程序为0.00～0.01min 0～14％B，0.01～6.50min 14％～11％B，6.50～10.00min 11％B，10.00～10.01min 11％～16％B，10.01～30.00min 16％～30％B，30.00～35.00min 30％～0 B；

c、流速0.8mL/min，进样量20μL，柱温30℃；

d、利用二极管阵列检测器和紫外分光光度计确定各目标物质的最大吸收波长，进而切换检测波长使得所有待测物质均在其最大吸收波长下得到检测

e、测定过程中切换检测波长，使得所测物质均在其最大吸收波长下得到检测，波长程序为5.72～6.02min 272nm，7.17～7.60min 260nm，8.58～9.18min 280nm，12.82～13.74min 280nm，20.39～21.22min 275nm，29.59～30.4min 306nm，其余时间段的检测波长均为360nm；

与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：

1、本发明测定准确，方法简单、灵敏、重现性好。

2、线性试验及检测限试验结果表明，在一定浓度范围内，6种单体酚的校准曲线的线性关系良好(r²≥0.9990)；与恒定波长的检测方法相比，在该方法下6种单体酚的检测限(LOD，S/N≥3)均有不同程度的降低，灵敏度得到提高。

3、6种单体酚加标回收率≥89.5％，保留时间及峰面积在日内(n＝10)和日间(n＝10)实验中的相对标准偏差(RSD)分别≤0.3％、2.9％和0.3％、3.1％。

四、附图说明：

图1是混合标样的等高线图(峰序号：1-没食子酸，2-原儿茶酸，3-儿茶素，4-表儿茶素，5-表儿茶素没食子酸酯，6-白藜芦醇。)

图2为儿茶素的光谱图。

图3是白藜芦醇(RES)的加标定性色谱图，其中a为加标样，b为不加标样。

图4为韧皮部中6种单体酚在不同色谱条件下的比较图，其中a为切换检测波长，b为恒定检测波长。

五、具体实施方式：

本发明为一种高效液相色谱切换检测波长同时测定葡萄组织中6种单体酚含量的方法，具体出峰顺序为没食子酸(Gallic acid)、原儿茶酸(Protocatechuic acid)、儿茶素((+)-Catechin)、表儿茶素((-)-Epicatechin)、表儿茶素没食子酸酯((-)-Epicatechin-3-0-gallate)和白藜芦醇(Trans-Resveratrol)。切换波长使得所测物质均在其最大吸收波长下得到检测，从而在测定层面上客观真实地反映其含量。

通过考察不同的试验参数进行了大量的反复比较试验，最终选用了最佳时色谱条件。与恒定检测波长的方法相比，该方法明显地降低了被测物质的检出限，并且在测定实际样品中得到了基线平稳、分离效果和峰形皆好的色谱图。

下面以具体实施例进一步解释本发明，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。

实施例一，色谱条件的建立及样品检测

仪器：LC-2010A_HT型配备自动进样装置的高效液相色谱仪，LC-6AD型高效液相色谱仪型配备SPD-10MA_VP二极管阵列检测器(DAD)，所有部件均由岛津CLASS-VP 6.12工作站控制，UV-1700型紫外分光光度计(日本岛津公司)。

试剂：没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯和白藜芦醇等标样均购自Sigma和Fluka公司；甲醇和乙腈为色谱纯(美国TEDIA公司)；乙酸为国产分析纯。

采用ZORBAX SB-C18 4.6μm×250μm，5μm色谱柱；

流速0.8 mL/min，进样量20μL，柱温30℃；

流动相的选择对不同酸浓度的甲醇和乙酸水溶液，乙腈和乙酸水溶液作为流动相进行考察，经过多次试验后，发现以1.3％的乙酸水溶液(A)和乙腈(B)为流动相效果较佳。梯度洗脱程序为0.00～0.01min 0～14％B，0.01～6.50min 14％～11％B，6.50～10.00min 11％B，10.00～10.01min 11％～16％B，10.01～30.00min 16％～30％B，30.00～35.00min 30％～0 B；

检测波长的选择  利用紫外二极管阵列检测器对6种单体酚混标溶液在190～800nm范围内进行扫描得到各物质最大吸收波长带(图1)，然后用紫外分光光度计确定各物质的最大吸收波长(图2)。没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯及白藜芦醇的最大吸收波长分别为：272nm、260nm、280nm、280nm、275nm及306nm。根据相对保留时间选择合适的切换波长时间点，其余检测时间段均为恒定波长360nm(在360nm下可以避免溶剂峰及许多杂质峰的出现)。机器运行过程中，在190～370nm以内任意切换检测波长，波长的响应及稳定时间不超过0.1秒(此数据为仪器的性能参数，由日本岛津公司提供)，本发明选择在0.01min内切换波长，并得到很好的效果。波长程序为5.72～6.02min 272nm，7.17～7.60min 260nm，8.58～9.18min 280nm，12.82～13.74min 280nm，20.39～21.22min 275nm，29.59～30.4min 306nm，其余时间段的检测波长均为360nm；

定性实验

利用相对保留时间法及添加标准物质法定性。比对混标溶液和样品供试液在相同的色谱条件下的色谱图和相对保留时间；在样品中分别加入适量的各种标准物质，比较相同色谱条件下不加标样品及加标样品的色谱图。如图3所示，在样品中加入标样前后，白藜芦醇(trans-Resveratrol，缩写为RES)出峰的位置是一致的。

标准曲线和相关系数

精确称取6种标样各5mg，用甲醇定容在10mL的棕色容量瓶中，依次稀释20、40、100、200和400倍，混标溶液密封保存于-20℃冰箱中备用。将混合标样溶液按浓度由低到高设置自动进样，每个浓度重复进样3次，以各单体酚的平均峰面积(A)对浓度(C)绘制校准曲线，并计算相关系数(见表1)。

表1  6种单体酚标准曲线的回归分析

    对照品    校准曲线    相关系数    线形范围    没食子酸    原儿茶酸    儿茶素    表儿茶素    表儿茶素没食子酸酸酯    白藜芦醇    A＝0.0001C-9.584    A＝0.0002C-6.093    A＝0.0005C-10.051    A＝0.0005C-2.810    A＝0.0002C-1.346    A＝0.00001C-1.595    0.9991    0.9990    0.9990    0.9992    0.9991    0.9993    1.38～550    1.42～568    1.31～523    1.28～510    1.33～532    1.75～699

加标回收率、精密度、准确度实验

准确称取葡萄果实和冬芽进行加标回收率实验，分别在样品中加入高、中、低3个水平的混合标样，每组重复进样6次，测定其回收率，并计算含量的相对标准偏差(RSD)；对一定浓度的混标溶液进行日内和日间实验，日内连续进样10次，日间每隔1d进样1次并持续10d，计算每一种单体酚的相对保留时间和峰面积的RSD(见表2)。

表2    6种单体酚的加标回收率，方法的精密度和准确度

    单体酚  样品含量添加量  测定量平均回收率含量相对标准偏差相对保留时间的RSD  峰面积的  RSD果实冬芽 果实 冬芽果实冬芽果实冬芽日内日间日内日间    没食子酸0.007 0.006  0.001  0.007  0.011 0.008 0.013 0.017 0.006 0.013 0.01689.5％96.5％99.4％91.4％94.6％96.4％0.5 0.6 0.1 0.1 0.4 0.8    原儿茶酸0.039 0.016  0.014  0.071  0.114 0.052 0.010 0.020 0.029 0.087 0.12898.5％96.3％98.4％89.9％99.4％98.1％0.7 0.6 0.10.1 0.8 0.8    儿茶素  2.08  0.23  0.131  0.654  1.046 2.206 2.728 3.113 0.360 0.874 1.26296.2％99.1％98.8％99.1％98.5％98.7％1.0 1.3 0.1 0.1 2.9 3.1   表儿茶素  1.10  0.708  0.128  0.638  1.064 1.227 1.696 2.120 0.824 1.304 1.72899.5％93.4％95.9％90.9％94.0％98.3％0.9 1.0 0.3 0.3 1.0 1.2表儿茶素没食子    酸酸酯0.139 0.074  0.013  0.067  0.106 0.152 0.203 0.243 0.087 0.139 0.18096.2％95.9％97.9％98.2％99.1％99.8％0.9 0.7 0.1 0.1 0.5 0.7    白藜芦醇  0.01  0.281  0.002  0.009  0.140 0.016 0.023 0.152 0.283 0.289 0.41994.9％98.1％98.6％97.1％98.5％99.0％1.0 1.3 0.1 0.1 1.1 1.3

样品中含量的测定

称取1～2g样品，用液氮研磨至粉末状，加入15mL 95％甲醇搅匀(料液比为1∶10)，迅速转移至套有黑纸的离心管中，于4℃下在超声波机中密封提取15min，10000r/min离心10min(4℃)。重复提取三次，合并提取液，减压浓缩至15mL即为待测液，过0.45μm滤头后进入HPLC检测。结果见表3

表3  葡萄组织中6种单体酚的平均含量(mg/kg)

    单体酚    葡萄果实    冬芽    韧皮部    木质部    没食子酸    原儿茶酸    儿茶素    表儿茶素    表儿茶素没食子酸酯    白藜芦醇    15.11±0.18    13.02±0.08    215.42±0.69    116.42±0.34    15.87±0.26    10.38±0.02    6.63±0.05    18.72±0.12    220.36±0.34    669.33±0.25    72.77±0.02    307.38±0.44    41.49±0.49    162.30±0.82    387.88±0.16    521.78±0.03    27.27±0.01    324.28±0.03    12.41±0.09    58.24±0.11    128.57±0.48    169.15±0.11    83.32±0.09    2005.08±0.08

实施例二切换检测波长与恒定检测波长的比较实验

仪器同实施例一

试剂同实施例一

色谱条件两种方法的色谱条件除波长设置程序不同外，恒定检测波长方法的检测波长为280nm，其他参数均同实施例一

色谱图和最低检出限(LOD)的比较：两种方法下分析相同的样品，以信噪比(S/N)大于3时所检测出各种物质的量为最低检出限，色谱图见图4，检出限见表4

表4  两种条件下6种单体酚的检出限

    对照品    恒定波长下的检出限    切换波长下的检出限    没食子酸    原儿茶酸    儿茶素    表儿茶素    表儿茶素没食子酸酸酯    白藜芦醇    0.54    0.66    0.61    0.93    0.79    0.43    0.27    0.33    0.62    0.93    0.76    0.24