同时检测ToRCH感染的免疫层析试纸及制备方法

摘要

本发明提供了一种同时检测ToRCH感染的免疫层析试纸及制备方法。它包括基板，基板上粘接层析膜，在层析膜上包被固定至少两种特定抗原检测线，在层析膜下端依次粘有胶体金结合物垫、样品垫，在层析膜上端为吸收垫，所述检测线以交错排布在层析膜上，吸收垫上有与层析膜上的具体检测线相对应的标识区，本试纸条用来同时检测人是否有ToRCH特异性IgM或IgG感染。本试纸条既克服了单测试纸条一次只能检测一种病原体的缺点，又避免了在一个层析条上同时做几个项目的检测时前面检测线形成的复合物会影响后面的检测，在灵敏度上受到很大限制的缺陷，本试纸条具有操作简便、快速、灵敏、不需要特殊仪器设备、观察结果直观等显著优点，大大方便了临床检测和筛查工作。

说明书

背景技术

本发明涉及一种层析试纸及其制备方法，尤其涉及一种同时检测ToRCH感染的免疫层析 试纸及制备方法。

背景技术

ToRCH是弓形体(Toxoplasma gondii，Tox)、风疹病毒(Rubella Virus，RubV)、巨细胞病毒 (Cytomegalovirus，CMV)、单纯疱疹病毒(Herpes simplex Virus，HSV)的英文名称字头组合，是可 导致先天性宫内感染及围产期感染而引起围产儿畸形的病原体。

孕妇ToRCH感染多无临床症状，为隐型感染，诊断胎儿有无宫内感染应首先确定孕妇是 否感染，孕妇ToRCH感染对优生优育与人口素质构成很大的威胁，因此对孕期进行ToRCH筛 查是十分必要的。目前医院及计划生育服务部门确定孕早期或孕前妇女是否有ToRCH感染， 需要同时检测这四项指标。临床上检测ToRCH感染常用的是ELISA法，其操作程序比较复杂， 检测时间较长，不适应孕妇感染的快速诊断和怀孕人群的筛查。

层析试纸作为一种快速的检测工具，在早孕检测中得到了广泛的应用。受其启发，在一 些其他的疾病检测中人们也采用了层析试纸，而且为了能同时进行多种疾病的检测，人们在 一张层析试纸上依次设置了检测线，通过其变色反应检测疾病。但这种层析试纸它的胶体金 结合物垫上涂的胶体金标记抗体结合物浓度是一定的。若结合物垫涂的过高，用其所装配的 试纸条检测标本，层析膜上的本底颜色会深，并且易发生非特异性反应即检测标本会出现假 阳性结果情况；若涂的过低，用其所装配的试纸条检测灵敏度会达不到要求，标本可能会出 现漏检情况。当在层析膜上同时包被固定两种以上检测项目抗原，包被线长度相同，并间隔 一定距离平行向后排列，固化的层析膜装配成试纸条。当用此试纸条检测含有两种以上病原 体抗体血标本时，胶体金标记抗体结合物与第一条检测线形成复合物后，剩余的胶体金标记 抗体结合物再与下一个检测线反应时，由于浓度下降检测灵敏度会降低，当它“流到”第三 条检测线反应时，由于浓度更低，反应检测灵敏度会更低，标本会出现假阴性情况。

尤其当血标本与第一条检测线呈强阳性反应时，在第一条检测线处形成复合物会多，肉 眼观察表现为检测线红色带更加明显，剩余的胶体金标记抗体浓度就会更少，那么在第二个 检测线反应灵敏度就会更低，标本出现漏检情况就会更严重。

还有人提出将多张层析试纸集成到一个盒体进行检测，但其也存在一定问题，比如当加 样量太少流不到检测区时，它需要在缓冲液加入区(B)处滴2滴缓冲液，该缓冲液在溶解固 相胶体金标记抗人IgG/IgM抗体的同时“冲向”硝酸纤维素膜过程中同时稀释血清，并一起 带入固化层析膜，进行抗原抗体反应。逆向胶体金检测TORCH免疫层析试纸条没有表现出想 要得到的结果，且操作繁琐，需要两步加样。

发明内容

本发明的目的就是为了克服目前在一条试纸上进行多种病原体检测时其灵敏度不高等问 题，提供一种具有结构简单，使用方便，灵敏度高等优点的同时检测ToRCH感染的免疫层析 试纸及制备方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种同时检测ToRCH感染的免疫层析试纸，它包括基板，基板上粘接层析膜，在层析膜 上包被固定至少两种特定检测线，在层析膜下端依次粘有胶体金结合物垫、样品垫，在层析 膜上端为吸收垫，所述检测线以交错排布在层析膜上，吸收垫上有与层析膜上的具体检测线 相对应的标识区，本试纸条用来同时检测人是否有特异性IgG或IgM感染。

所述检测线排布时按照阶梯式交错排布。

所述检测线排布时以波浪式交错排布。

一种同时检测ToRCH感染的免疫层析试纸的制备方法，它的步骤为，

1)在层析膜上以交错排布方式包被固定至少两种特定检测线；

2)制作胶体金结合物垫；

3)将固相化的层析膜与胶体金结合物垫、样品垫、吸收垫按比例重叠在一起，装配成试 纸条。

所述步骤1)中，层析膜上包被抗原的制备方法为：用pH＝7.6、0.01mol/L磷酸盐缓冲液 分别将多种检测抗原、胶体金标记抗体的抗抗体稀释到1-2mg/ml作为包被应用液；在硝酸纤 维素膜上端用胶体金标记抗体的抗抗体包被应用液划线，做为质控线即C线，然后在质控线 下方包被与给抗原相对应的检测线Tn，各检测线Tn交错分布，将已包被好的NC膜放置室温 干燥，供装配试纸用。

所述步骤2)中，胶体金结合物垫的制备方法为：

a、将氯金酸配制成0.01％水溶液，取100ml加热煮沸，搅拌下加入1.5-2.0ml的1％柠檬 酸钠溶液，直到溶液颜色稳定成酒红色，即得到胶体金溶液；

b、用0.2mol/L K₂CO3溶液将胶体金溶液调pH值至7.6，搅拌下将抗人IgM或抗人IgG 抗体5ug/ml用量加入胶体金溶液中混合，然后加入10％BSA溶液10ml，将标记好的胶体金结 合物10000-14000r/min离心30-60分钟，弃上清，将沉淀用含1％BSA的磷酸盐(PBS)缓冲 液悬浮，恢复原体积后再离心，如此洗涤2～4次。最后将沉淀悬浮于1/10体积含1％BSA的 PBS缓冲液中，然后将此胶体金结合物溶液均匀涂在玻璃纤维上，冷冻干燥，密封备用。

本发明的试纸条具有一次检测，即可知是否有ToRCH四种病原体感染，在围产期检查中 具有很大的应用价值。本试纸条提供的这种同时检测ToRCH感染的免疫层析试纸，其方法是 将弓形虫抗原、风疹病毒抗原、巨细胞病毒抗原、单纯疱疹病毒抗原分别在硝酸纤维素膜上 的不同位置交错包被成线，通过胶体金标记抗人IgM或抗人IgG显色，来同时检测人血清中 针对抗原的特异性IgM或IgG抗体。本试纸条既克服了单测试纸条一次只能检测一种病原体 的缺点，又避免了在一个层析条上同时做几个项目的检测时前面检测线形成的复合物会影响 后面的检测，在灵敏度上受到很大限制的缺陷。

本发明的有益效果是：它在层析膜上对同时包被至少两种特定检测线，是以交错排布形 式来完成的，避免了上述的缺陷，又克服了单测试纸条一次只能检测一种病原体抗体的缺点， 本试纸条具有操作方法简便、快速、灵敏、不需要特殊仪器设备、观察结果直观等显著优点。

附图说明

图1为本发明第一实施例结构示意图；

图2为本发明第二实施例结构示意图；

图3为本发明第三实施例结构示意图。

其中，1、样品垫，2、胶体金结合物垫，3、固相化层析垫，4、吸收垫。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：

层析试纸条整体外观形式：在一个12*80mm的PVC板上粘着一张12*25mm的层析膜， 层析膜上包被固定有弓形虫抗原、风疹病毒抗原、巨细胞病毒抗原、单纯疱疹病毒II型抗原、 胶体金标记抗体的抗抗体，形成固相化的层析膜3，其上的检测线呈阶梯状交错分布，层析 膜的下端依次粘有胶体金结合物垫2、样品垫1(玻璃纤维)，层析膜的上端粘有吸收垫4(棉 浆板)，吸收垫4上有与层析膜上包被的具体抗原相对应的标识区，如图1所示。

实施例2：

层析试纸条整体外观形式：在一个12*80mm的PVC板上粘着一张12*25mm的层析膜， 层析膜上包被固定有弓形虫抗原、风疹病毒抗原、巨细胞病毒抗原、单纯疱疹病毒II型抗原、 胶体金标记抗体的抗抗体，形成固相化的层析膜3，其上的检测线呈波浪形交错分布，层析 膜的下端依次粘有胶体金结合物垫2、样品垫1(玻璃纤维)，层析膜的上端粘有吸收垫4(棉 浆板)，吸收垫4对应的抗原区域标明具体的检测抗体名称，如图2所示。

实施例3：

层析试纸条整体外观形式：在一个15*80mm的PVC板上粘着一张15*25mm的层析膜， 层析膜上包被固定有弓形虫抗原、风疹病毒抗原、巨细胞病毒抗原、单纯疱疹病毒I型抗原、 单纯疱疹病毒II型抗原、胶体金标记抗体的抗抗体，形成固相化的层析膜3，其上的检测线 呈阶梯状交错分布，层析膜的下端依次粘有胶体金结合物垫2、样品垫1(玻璃纤维)，层析 膜的上端粘有吸收垫4(棉浆板)，吸收垫4对应的抗原区域标明具体的检测抗体名称，如图 3所示。

本发明试纸的制备方法为：

(一)层析膜包被抗原的制备：

用pH＝7.6 0.01mol/L磷酸盐缓冲液分别将弓形虫抗原、风疹病毒抗原、巨细胞病毒抗原、 单纯疱疹病毒I型抗原、单纯疱疹病毒II型抗原、胶体金标记抗体的抗抗体稀释到1-2mg/ml 作为包被应用液。

在距离硝酸纤维素膜(NC膜)上端6nm处将胶体金标记抗体的抗抗体包被应用液划一条 15mm长的线，做为质控线(C线)，然后在质控线向下4mm处包被一条3mm长的检测线1 (T1)为弓形虫抗原，在T1横线终止处垂直向下间距2mm处再包被一条3mm长的检测线 2(T2)为风疹病毒抗原，在T2横线终止处垂直向下间距2mm处包被一条3mm长的检测线3(T3) 为巨细胞病毒抗原，T3横线终止处垂直向下间距2mm处包被一条3mm长的检测线4(T4) 为单纯疱疹病毒I型抗原，T4横线终止处垂直向下间距2mm处包被一条3mm长的检测线5 (T5)为单纯疱疹病毒II型抗原。将已包被好的NC膜室温放置干燥，供装配试纸用。

(二)胶体金结合物垫的制备：

1、将氯金酸(HAuCl4)配制成0.01％水溶液，取100ml加热煮沸，搅拌下加入1.5-2.0ml 的1％柠檬酸钠溶液，直到溶液颜色稳定成酒红色，即得到胶体金溶液。

2、用0.2mol/L K2C03溶液将胶体金溶液调pH值至7.6，搅拌下将抗人IgM抗体或抗人 IgG抗体5ug/ml用量加入胶体金溶液中混合，然后加入10％BSA溶液10ml。将标记好的胶体 金结合物10000-14000r/min离心30-60分钟，弃上清，将沉淀用含1％BSA的磷酸盐(PBS) 缓冲液悬浮，恢复原体积后再离心。如此洗涤2～4次。最后将沉淀悬浮于1/10体积含1％BSA 的PBS缓冲液中，然后将此胶体金结合物溶液均匀涂在玻璃纤维上，冷冻干燥，密封备用。

(三)免疫层析检测条的制备：

按第一步骤(试纸条整体外观形式)方法将固相化的层析膜与胶体金结合物垫、样品垫、 吸收垫等按一定比例重叠在一起，装配成试纸条。

二、免疫层析检测条的结果判断：

1、取人血清标本200ul加在层析检测条的样品垫上，静置10-20分钟观察结果，若只有 一条红色质控线(C线)出现，则判为阴性；若有一条红色质控线(C线)出现，同时在包被 有Tox、RubV、CMV、HSV-I、HSV-II抗原特定位置出现红色带，则判为阳性，哪个特定位置出 现红色带则判定是什么病原体抗体阳性；若无任何红色带出现则判定本试纸条失效。

2、若胶体金结合物垫中涂的是胶体金标记抗人IgG，那么装配的试纸条是用于检测人血 清中的ToRCH-IgG抗体。

若胶体金结合物垫中涂的是胶体金标记抗人IgM，那么装配的试纸条是用于检测人血 清中的ToRCH-IgM抗体。