一株高产核酸酶P1的桔青霉菌及其选育方法

摘要

本发明公开了一株高产核酸酶P1的桔青霉菌及其选育方法。该桔青霉菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.2014。该菌株的选育方法是对桔青霉孢子悬浮液进行低能离子束注入，再将诱变后的孢子转接于平板培养基中培养，挑选单个菌株转接于麦芽汁斜面培养，后经液体发酵培养，筛选出产核酸酶P1酶活高的菌株。该菌株经30代以上传代，得高产性状稳定的菌株。本发明采用低能离子束注入的方法，诱变效果好，正突变率高，且操作安全，菌株经发酵产生的核酸酶P1的酶活提高了3～5倍，高产性状稳定，不易丢失，经3吨发酵罐培养后酶活力仍能保持较高水平，适合大规模工业化生产。

说明书

技术领域

本发明属于微生物诱变技术领域，涉及一种高产核酸酶P1的桔青霉菌及利用离子束注入诱变手段选育该桔青霉菌的方法。

背景技术

从桔青霉发酵液中获得的核酸酶P1是一种能够水解RNA获得四种5’一核苷酸的磷酸二酯酶。5’-核苷酸已广泛应用于食品、生化工业以及制药工业。在食品行业中，已经由最初的食品助鲜剂，扩展为具有提高生物体免疫功能的功能性食品添加剂，可以添加在面包、饼干等食品中，尤其在婴幼儿食品中的使用效果非常明显，能够有效增强婴幼儿抵抗细菌性痢疾的能力，减少腹泻的发生；在医药领域，5’-核苷酸不但能够作为药物使用，而且还是许多抗病毒抗肿瘤药物的生产原料；此外，核苷酸制剂还可以作为动植物生长调节剂，有着明显的增产、增重功效。

核苷酸生产主要采取三种方法：化学合成法、微生物发酵法及酶解法。酶解法由于降解RNA可以一次得到四种核苷酸的混合物，且酶反应收率较高，国内外工业化生产核苷酸均采用此法。在酶解法制备核苷酸中由桔青霉经液体深层发酵生产核酸酶P1，其酶解产物杂质少后续分离工艺简单，国外一般采用该方法进行核苷酸的生产。

桔青霉(Penicillium citrinum)属于不对称青霉组，绒状青霉亚组，桔青霉系。国内桔青霉菌株一般采用紫外诱变和亚硝基胍等方法进行诱变选育。陈信波(湖南农业大学学报，1995，21(4)：382-385)等采用紫外诱变法，酶活为500u/ml。洪亦武等(江西科学，1995，13(4)，224-228)采用亚硝基胍和紫外复合诱变，菌株致死率大于90％，最终酶活为345u/ml。李科德等(微生物杂志，2001，21(3)：28-30)采用紫外诱变与亚硝基胍多次诱变，优化后酶活为1329u/ml。

离子束注入技术作为一种生物品种改良的新技术已在诱变育种、植物转基因、生命起源和进化以及环境辐射与人类健康等方面取得了一些重要研究成果。在微生物诱变育种的研究中，离子束注入已广泛用于对微生物菌种诱变育种，并取得了良好效果。离子束注入与传统诱变源相比，除了具有能量沉积效应外，还有动量传递、质量沉积及电荷的中和与交换效应，是一种将物理诱变和化学诱变特性集于一身的综合诱变方法，能够在低剂量注入、细胞损伤较轻的情况下，诱发强烈地影响生物细胞的生理、生化性能，造成遗传物质的基本单位-碱基的改变，诱发染色体结构变异(余增亮物理1997，26(6)：333-338)。赵洪英(天津理工学院学报，2001，17(1)：14-17)等用N⁺离子注入庆大霉素产生菌成熟孢子，经筛选得到的菌株产抗生素能力提高27.39％。王纪(微生物学杂志，1998，18(4)：25-28)等通过离子注入诱变筛选得到一株遗传性能稳定的高产菌，得率较出发菌株提高55％～60％。将离子注入诱变技术应用于桔青霉生产核酸酶P1方面未见相关专利和文献报道。

发明内容

本发明目的是提供一株高产核酸酶P1的桔青霉菌。

本发明的另一个目的是提供一种利用低能离子束注入诱变手段选育该桔青霉菌的方法。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

一种高产核酸酶P1的菌株，其分类命名为桔青霉(Penicillium citrinum)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.2014。

所述菌株的选育方法，该方法是对桔青霉孢子进行低能离子束注入，然后将诱变后的孢子转接于平板培养基中培养，挑选单个菌株转接于麦芽汁斜面培养，后经液体发酵培养，筛选出产核酸酶P1酶活高的菌株。

所述菌株的选育方法，其中需采用低能离子束注入诱变的桔青霉孢子是取麦芽汁斜面培养的桔青霉孢子用无菌水稀释制成10³～10⁸孢子悬浮液，将0.005～1ml浓度的孢子悬浮液分装于玻璃表面皿中，无菌干燥0.5～2h。

所述菌株的选育方法，其中低能离子为N⁺、Ar⁺、O⁶⁺或C⁶⁺。

所述菌株的选育方法，其中离子注入机靶室内真空度为2×10^-2～2×10^-8，注入能量为0.1kev～1000kev，剂量为5～500×10¹³ions·cm^-2·s^-1。

所述菌株的选育方法，其中经诱变后的孢子悬浮液经无菌水稀释10～1000倍后，取0.01～1.0ml涂布于PDA平板培养基中28～32℃培养5～10d，然后转接于麦芽汁培养基斜面上培养5～10d。

所述菌株的选育方法，其中液体发酵培养基组成及含量为：葡萄糖0.5～50g，蛋白胨0.05～5g，磷酸二氢钾0.01～5g，磷酸氢二钾0.01～5g，硫酸镁0.01～5g，氯化钙0.01～5g，定容至1L，pH5～7。

本发明的有益效果：

本发明采用低能离子束注入的方法对产核酸酶P1的桔青霉菌株进行诱变，与其他诱变方法相比具有一下优点：

1.由于离子束注入诱变是一种集物理和化学诱变特征于一体的综合诱变，具有对生物细胞损伤小的特点，因此采用该法诱变的菌株正突变率高，诱变效果好。

2.采用本发明方法选育出的高产核酸酶P1的桔青霉菌株(保藏号为CGMCCNo.2014)，具有高产性状稳定，不易丢失的优点，经过30代以上转接，酶活还能保持筛选后的水平。

3.采用本发明诱变筛选的菌株在3吨发酵水平发酵，所产的核酸酶P1的酶活仍能保持较高水平，说明该法筛选的菌株有利于大规模工业生产。

菌株保藏信息：

本发明公开的高产核酸酶P1的菌株，编号为YL104，其分类命名为桔青霉(Penicillium citrinum)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所)，保藏号CGMCC No.2014。保藏日期为2007年4月20日。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的描述。

实施例1

取经斜面培养的桔青霉孢子，用无菌水制成10⁵孢子悬浮液，将0.2ml孢子悬浮液分装于玻璃表面皿中，无菌干燥1h，将待处理的含菌培养皿放入离子注入机内进行连续式N⁺离子注入，靶室内真空度为5×10^-5Pa，注入能量为30kev，剂量为50～500×10¹³ions·cm^-2·s^-1。然后将经诱变后的孢子悬浮液经无菌水稀释100倍后，取0.05ml涂布于PDA平板培养基中28～32℃培养7～10d，从中挑选纯菌株在麦芽汁斜面培养5～10d后分别转接于装25ml液体发酵培养基(组分：葡萄糖40g，蛋白胨4g，磷酸二氢钾0.06g，磷酸氢二钾0.06g，硫酸镁0.06g，氯化钙0.04g，定容至1L，pH5～7)的250ml摇瓶中，于28～32℃，250rpm摇床中培养24h，过滤去除菌体，测定发酵液中核酸酶P1的酶活。经过4批次的诱变筛选，突变株正突变率56.9～63.9％，酶活单位比原始菌株提高3.6～5.2倍，结果见表1。

                           表1

  批次  出发菌株酶活  正突变率  诱变后最高酶活  提高倍数

  u/ml  ％  u/ml  1  2  3  4  1134  980  1403  992  15.8  10.2  18.3  19.3  4090  3980  6289  5157  3.6  4.1  4.5  5.2

其中酶活测定方法：

取甲乙两支试管，分别加5％核酸溶液1mL和0.8mL的0.2mol/L，pH为5.0的醋酸盐缓冲液，68℃预热10min，然后甲管加入0.2mL的酶液，继续保温15min后，甲乙两管再分别加入2mL的过氯酸试剂，乙管再补加0.2mL的酶液，两管静置10min后，离心取上清液0.1mL加7.9mL蒸馏水，混匀，再稀释一定的倍数测OD₂₆₀的值。

酶活计算公式：酶活(u/ml)＝(OD₂₆₀甲-OD₂₆₀乙)×80×稀释倍数×5

将诱变后获得的酶活为5157u/ml一株菌株在麦芽汁斜面中进行30代转接培养，经测定酶活高仍达5000u/ml，将该桔青霉菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.2014。

对此菌株进行三级放大发酵培养，验证其大规模工业化应用价值。

一级种培养：将保藏号为CGMCC No.2014的桔青霉菌进行斜面培养，斜面孢子用生理盐水洗下接入三角瓶中，在无菌状态下接入发酵罐中，种子培养基为葡萄糖40g/L，蛋白胨4g/L，磷酸二氢钾0.06g/L，磷酸氢二钾0.06g/L，硫酸镁0.06g/L，氯化钙0.04g/L，pH5～7，种子罐为30升外循环气升式发酵罐，培养温度28～30℃，罐压1.0～1.5MPa，通气量3.0～5.0m³/h，培养时间28～32h。

二级种子培养：经上一级发酵的孢子用无菌压缩空气压入发酵罐中，本级培养基为葡萄糖40g/L，蛋白胨4g/L，磷酸二氢钾0.06g/L，磷酸氢二钾0.06g/L，硫酸镁0.06g/L，氯化钙0.04g/L，pH5～7，二级种子罐为300升外循环气升式发酵罐，培养温度28～30℃，罐压1.0～2.0MPa，通气量20～25m³/h，培养时间28～32h。

发酵工序：经第二级种子罐发酵的孢子用无菌压缩空气压入发酵罐中，本级培养基为葡萄糖40g/L，蛋白胨4g/L，磷酸二氢钾0.06g/L，磷酸氢二钾0.06g/L，硫酸镁0.06g/L，氯化钙0.04g/L，pH5～7，发酵罐为3吨外循环气升式发酵罐，培养温度28～32℃，罐压2.0～3.0MPa，通气量70～80m³/h，培养时间28～32h。

发酵培养到达终点后，测定酶活为5800u/ml。说明该桔青霉菌株在3吨发酵水平发酵，所产的核酸酶P1的酶活仍能保持较高水平，具有大规模工业化应用价值。