乙型肝炎病毒“a”决定簇的突变检测基因芯片

摘要

本发明涉及基因检测。特别地涉及用于检测乙型肝炎“a”决定簇突变的基因芯片。本发明还涉及所述基因芯片的制备方法。本发明还涉及所述基因芯片在检测乙型肝炎“a”决定簇突变的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及基因芯片的技术领域。本发明特别地涉及用于检测乙型肝炎“a”决定簇突变的基因芯片及其应用的技术领域。

背景技术

乙型肝炎(简称乙肝)是一种由乙型肝炎病毒(HBV)引起、以肝脏炎性病变为主，并可导致多器官损害的传染病，严重危害人类健康。全世界约有4亿慢性HBV携带者，我国就达1.3亿。目前，慢性乙肝缺乏有效的药物和治疗手段，接种疫苗成为控制该病流行的唯一有效措施。但是，疫苗接种后仍存在约5-10％的免疫失败现象，其中病毒基因突变可能是造成免疫失败的主要原因之一。

HBV是一种突变频率较高的病毒，在同一机体中可能同时存在野生株和突变株，一般认为突变位点多数集中在S区“a”决定簇的126位、144位、145位等氨基酸位点，及“a”决定簇外影响双环结构的位点。“a”决定簇抗原性发生改变，可能导致疫苗保护失败。突变株在人群中主要是劣势株，对其检测比较困难。目前有多种检测“a”决定簇突变株的方法，但尚无令人满意的检测方法。

基因芯片技术是随着人类基因组计划的逐步实施及分子生物学相关学科的迅猛发展应运而生的。基因芯片是指在固相载体上按照特定的排列方式固定上大量序列已知的DNA片段，形成DNA微矩阵。其检测原理仍是基于碱基互补的核酸分子杂交技术(Southem blot杂交)，即在一定条件下，载体上的DNA分子可以与样品序列互补的核酸片段杂交，如果把样品中的核酸片段进行标记，在专用芯片扫描仪上就可以检测到杂交信号。如果载体上的DNA分子与待测DNA完全匹配则显示较强的杂交信号，否则，杂交信号将较低，据此可判断出待测DNA是否发生了突变。

基因芯片以其高通量、微量化、自动化等特点，在病毒的鉴定、突变检测和耐药性基因诊断等方面有着广阔的应用前景。目前，基因芯片已成功应用于乙肝病毒的快速鉴定，并能对YMDD突变进行检测，但还未见到应用于“a”决定簇突变株检测的报道。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明提供了一种用于检测HBV“a”决定簇突变位点的基因芯片，其包括作为探针的SEQ ID NO.1-59的核苷酸序列。

在本发明的一个实施例中，本发明提供了一种用于检测HBV“a”决定簇突变位点的基因芯片，其中每张芯片上含有10个阵列，右边五个阵列相同，可检测126、144和145突变，每个阵列为11×4个探针点，探针在每个11×4阵列中排布；左边五个阵列相同，可检测124、129、133、141、142和147突变，每个阵列为8×8个探针点，探针在每个8×8阵列中排布。

在本发明的一个实施例中，本发明还提供了所述基因芯片的制备方法。其中将已构建的乙肝全基因组野生型DNA质粒为模板，采用定点诱变法，或本领域技术人员熟知的其他方法构建突变型重组质粒，将其作为标准模板筛选探针、优化芯片杂交条件、确定结果判断标准。

在本发明的另一个实施例中，本发明还提供了所述基因芯片在检测HBV“a”决定簇突变位点中的应用。所述基因芯片可特异地检测出HBV“a”决定簇序列，且其检测的灵敏度高于PCR产物直接测序。

在本发明的另一个实施例中，所述基因芯片可重复地检测出HBV“a”决定簇序列，其变异系数小于15％。

在本发明的另一个实施例中，所述基因芯片可检测出劣势株大于10％的混合感染。

本发明还提供了用于制备所述基因芯片的特异性探针。在本发明的另一个实施例中，本发明还提供了灵敏度和特异性均较好的探针，其序列如表1所示。其检测的灵敏度高于PCR产物直接测序。

附图说明

图1表示126A的探针筛选结果。当2号探针与PCR产物完全匹配时，杂交信号值高于其它探针，并且特异性也较好，因此检测126A突变时选用2号探针(即探针P3)。

图2和图3分别表示基因芯片右边或左边阵列排布及其外观示意图。

图4表示质粒特异性实验结果。

图5表示HBV阴性血清样本的特异性实验结果。

图6表示126S-1突变型质粒和野生型质粒混合液芯片检测结果。

图7表示126S-1突变型质粒和野生型质粒混合液检测结果。

具体实施方案

实施例1：标准模板的构建

选择20种“a”决定簇常见突变株作为检测对象，分别为：124位C突变为Y，126位T/I突变为A、126位T/I突变为S(a[c/t]t突变为agt或tct，分别记作126S-1和126S-2)、129位Q突变为L、129位Q突变为R、129位Q突变为H(caa突变为cac或cat，分别记作129H-1和129H-2)、133位M突变为T、141位K突变为E、142位P突变为S、142位P突变为L、141位和142KP突变为ES、141位和142KP突变为EL、144位D突变为A、145位G突变为R、145位G突变为E、144位和145位DG突变为AR、144位和145位DG突变为AE、147位C突变为Y。以已构建的乙肝全基因组野生型DNA质粒为模板，所述全基因组野生型DNA的序列见GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)AF473543，采用定点诱变法构建突变型重组质粒，将其作为标准模板筛选探针、优化芯片杂交条件、确定结果判断标准。具体为利用PCR技术从1例武汉乙肝患者的血清中扩增出HBV全长基因，胶回收PCR产物，将纯化的PCR产物与Promega公司的pGEM-T easy载体连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，挑选单菌落进行细菌扩增，提取重组质粒DNA。最后质粒送北京华大中生科技发展有限公司测序，测序结果证明该质粒为野生型HBV。将质粒保存于-70℃。

实施例2：探针筛选

从GenBank核酸数据库中检索HBV“a”决定簇基因序列，利用DNAStar进行比对得到碱基对齐图，因为待测突变位点两端存在正常的变异，所以使用Primer5.0等软件分别设计针对待测突变和野生序列的简并探针。由于计算软件的预测与实际的杂交反应存在偏差，故本发明针对这20个突变以及它们所在位置的野生序列先后设计了不同长度及序列的探针。探针送军事医学科学院二所九室合成。探针采用标准亚磷酰胺化学方法在DNA自动合成仪上合成。合成完毕用浓氨水55％作用15小时脱保护/切割，OPC柱纯化。固定探针在3’端以氨基修饰，氨基与探针序列之间以间隔臂(spacer，聚乙二醇亚磷酰胺试剂)相连。利用分光光度法测定探针浓度。以突变型和野生型质粒作为标准模板，将它们扩增出的PCR产物与含有备选探针的寡核苷酸芯片进行杂交，根据杂交结果，对探针序列进行经验性的调整优化，选择灵敏度和特异性均较好的探针。选择探针的标准为：在保证探针与PCR产物完全匹配时杂交信号值较强的情况下(即模板为10⁶copies/μL时杂交信号值大于3000，模板为10⁵copies/μL时杂交信号值大于2000)，优先选择与PCR产物单碱基错配时杂交信号值较低(即特异性较好)的探针。另外，为了监控杂交反应中的非特异性杂交，特设立阴性对照。该阴性对照为一段与待检靶基因无关的寡核苷酸片段。

其中126A的探针筛选结果如图1所示：(当2号探针与PCR产物完全匹配时，杂交信号值高于其它探针，并且特异性也较好，因此检测126A突变时选用2号探针(即P3探针))。

通过反复实验我们发现简并探针检测的特异性和信号强度均较理想，并且可以减少所需检测探针的数量，利于优化实验条件。经过实验筛选，最终确定25条特异性和信号强度均较理想的简并探针用于制备HBV“a”决定簇突变基因检测芯片(表1)。

表1筛选出的简并探针序列(下划线处为待测突变)

   探针编   号   对应核苷酸序列   探针序列   长   度   (bp   )   检测的氨   基酸   P1   P2   P3   P4   P5   P6   P7   P8   P9   P10   P11   P12   P13   P14   P15   P16   P17   P18   P19   P20   P21   P22   P23   P24   P25   SEQ ID NOs1-4   SEQ ID NOs5-8   SEQ ID NOs9-10   SEQ ID NOs11-12   SEQ ID NOs13-14   SEQ ID NO15   SEQ ID NO16   SEQ ID NO17   SEQ ID NO18   SEQ ID NO19   SEQ ID NO20   SEQ ID NOs21-22   SEQ ID NOs23-24   SEQ ID NOs25-26   SEQ ID NOs27-28   SEQ ID NOs29-30   SEQ ID NOs31-32   SEQ ID NOs33-34   SEQ ID NOs35-38   SEQ ID NOs39-42   SEQ ID NOs43-46   SEQ ID NOs47-50   SEQ ID NOs51-54   SEQ ID NOs55-58   SEQ ID NO59   5’CTGCAC[G/A]A[C/T]CCTGCTC   5’ATGCAA[G/A]ACCTACAC[G/A]A   5’CTGCAC[G/A]GCTCCTGCTC   5’TGCAC[G/A]AGTCCTGCTC   5’CTGCAC[G/A]TCTCCTGCTC   5’CTCAAGGAACCTCTATGT   5’CCTGCTCGAGGAACCTC   5’CCTGCTCTAGGAACCTC   5’CTGCTCACGGAACCTCT   5’CCTGCTCATGGAACCTC   5’AACCTCTACGTTTCCCT   5’AAACCT[T/A]CGGACGGAAA   5’GCTGTACAGAACCT[T/A]CG   5’GTACAAAATCT[T/A]CGGAC   5’GTACAAAACTT[T/A]CGGAC   5’CTGTACAGAATCT[T/A]CGGA   5’TGTACAGAACTT[T/A]CGGAC   5’AACCT[T/A]CGGCCGGAAA   5’CCT[T/A]CGGACAGAAA[C/T]TGC   5’CT[T/A]CGGACGAAAA[C/T]TGC   5’CCT[T/A]CGGCCAGAAA[C/T]TGC   5’CCT[T/A]CGGCCGAAAA[C/T]TGC   5’AAA[T/C]TGCAC[T/C]TGTATTCC   5’CGGAAA[T/C]TACAC[T/C]TGTA   5’TGCATGAGGATTTACCG   16   17   17   16   17   18   17   17   17   17   17   17   17   17   17   18   18   16   18   17   18   18   18   17   17   124C+126T   124Y   126A   126S-1   126S-2   129Q+133   129R   129L   129H-1   129H-2   133T   141-145   141E   142S   142L   141E+142S   141E+142L   144A   145R   145E   144A+   144A+145E   147C   147Y   阴性探针

根据所筛选的探针，本发明制备了HBV“a”决定簇热点突变检测芯片，每张芯片上含有10个阵列，右边五个阵列相同，可检测126、144和145突变，每个阵列为11×4个探针点，探针在每个11×4阵列的排布方式及芯片外观如图2所示。左边五个阵列相同，可检测124、129、133、141、142和147突变，每个阵列为8×8个探针点。探针在每个8×8阵列的排布方式及芯片外观如图3所示。

实施例4：质粒的特异性实验结果

取突变型质粒和野生型质粒的PCR扩增产物进行芯片杂交，结果芯片能够特异的检测出“a”决定簇热点突变质粒和野生型质粒。部分芯片结果见图4。

实施例5：HBV阴性血清样本的特异性实验结果

40例HBV阴性血清样本的PCR扩增产物进行芯片杂交，结果显示各探针均无阳性信号产生，表明该芯片对检测HBV“a”决定簇序列特异，部分结果见图5。

实施例6：HBV DNA阳性血清样本的特异性实验结果

取3例HBV DNA阳性样本分别进行芯片检测、PCR产物直接测序和克隆测序(每例样本挑选10个阳性克隆进行测序)，结果见表2，可以看出：对于设计了芯片特异性探针的突变株的检测，芯片均可以检出混杂的毒株，而PCR产物直接测序仅检出优势株(＞50％)；3号样本克隆测序检出1例144A，并发现在144位点后插入一个核苷酸(C)，而芯片检测和PCR产物直接测序均未检出。结果见表2。

表2三种检测方法的结果

  样本编号  PCR产物  直接测序  芯片检测  克隆测序  1  2  3  WT  126S-1  126S-2  WT  126S-1，WT  126S-2，WT，126S-1  WT  126S-1，WT  126S-2，WT，126S-1，

实施例7：基因芯片检测的重复性实验结果

取1例HBV DNA阳性样本，从片内检测差异、片间检测差异、同一样本检测10次三方面进行重复性实验，结果变异系数均小于15％，表明基因芯片检测方法具有较好的重复性。

实施例8：基因芯片检测劣势株的结果

126S-1突变型质粒与野生型质粒分别按比例混合，使126S-1突变型质粒分别占混合质粒的0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％。对上述质粒混合物的PCR扩增产物进行芯片检测，结果如图6和图7所示。随着突变株比例的增加，特异性检测126S-1的P4探针的信号逐渐增强，特异性检测126T/I的P1探针的信号逐渐降低。当126S-1突变型质粒在混合质粒中所占的比例大于10％时，其突变检测探针杂交信号值与相应野生序列探针杂交信号值的比值大于0.5，按杂交标准判断为混合感染，亦即当劣势株＞10％，芯片即可检测出。结果参见图6及图7。

序列表

<110>中国药品生物制品检定所

<120>乙型肝炎病毒“a”决定簇的突变检测基因芯片

<130>850741CG

<160>59

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>16

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>1

ctgcacgacc ctgctc                                          16

<210>2

<211>16

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>2

ctgcacgatc ctgctc                                          16

<210>3

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>3

ctgcacaacc ctgctc                                          16

<210>4

<211>16

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>4

ctgcacaatc ctgctc                                         16

<210>5

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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atgcaagacc tacacga                                        17

<210>6

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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atgcaagacc tacacaa                                        17

<210>7

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atgcaaaacc tacacga                                        17

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atgcaaaacc tacacaa                                        17

<210>9

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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ctgcacggct cctgctc                                      17

<210>10

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>10

ctgcacagct cctgctc                                      17

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>11

tgcacgagtc ctgctc                                       16

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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tgcacaagtc ctgctc                                       16

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>13

ctgcacgtct cctgctc                                      17

<210>14

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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ctgcacatct cctgctc                                    17

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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ctcaaggaac ctctatgt                                   18

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<213>Homo sapiens

<400>16

cctgctcgag gaacctc                                    17

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<213>Homo sapiens

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cctgctctag gaacctc                                    17

<210>18

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>18

ctgctcacgg aacctct                                    17

<210>19

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>19

cctgctcatg gaacctc                                   17

<210>20

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>20

aacctctacg tttccct                                   17

<210>21

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>21

aaaccttcgg acggaaa                                   17

<210>22

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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aaacctacgg acggaaa                                   17

<210>23

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<213>Homo sapiens

<400>23

gctgtacaga accttcg                                   17

<210>24

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<213>Homo sapiens

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gctgtacaga acctacg                                    17

<210>25

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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gtacaaaatc ttcggac                                    17

<210>26

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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gtacaaaatc tacggac                                    17

<210>27

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<213>Homo sapiens

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gtacaaaact ttcggac                                    17

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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gtacaaaact tacggac                                    17

<210>29

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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ctgtacagaa tcttcgga                                  18

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>30

ctgtacagaa tctacgga                                  18

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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tgtacagaac tttcggac                                  18

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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tgtacagaac ttacggac                                  18

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<213>Homo sapiens

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aaccttcggc cggaaa                                    16

<210>34

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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aacctacggc cggaaa                                   16

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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ccttcggaca gaaactgc                                 18

<210>36

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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ccttcggaca gaaattgc                                 18

<210>37

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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cctacggaca gaaactgc                                 18

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<213>Homo sapiens

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cctacggaca gaaattgc                                 18

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<213>Homo sapiens

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cttcggacga aaactgc                                   17

<210>40

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<213>Homo sapiens

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cttcggacga aaattgc                                   17

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<213>Homo sapiens

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ctacggacga aaactgc                                   17

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<213>Homo sapiens

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ctacggacga aaattgc                                   17

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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ccttcggcca gaaactgc                                 18

<210>44

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<213>Homo sapiens

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ccttcggcca gaaattgc                                 18

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<213>Homo sapiens

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cctacggcca gaaactgc                                 18

<210>46

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<213>Homo sapiens

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cctacggcca gaaattgc                                 18

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<213>Homo sapiens

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ccttcggccg aaaactgc                                 18

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<213>Homo sapiens

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ccttcggccg aaaattgc                                  18

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<213>Homo sapiens

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cctacggccg aaaactgc                                  18

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<213>Homo sapiens

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cctacggccg aaaattgc                                  18

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>51

aaattgcact tgtattcc                                  18

<210>52

<211>l8

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>52

aaattgcacc tgtattcc                                  18

<210>53

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