检测乙型肝炎病毒S区“α”决定簇145位点突变株方法的建立及应用研究

摘要

病毒性肝炎是由多种肝炎病毒引起的常见传染病，具有传染性强、传播途径复杂、流行面广泛，发病率较高等特点。临床上主要表现为乏力、食欲减退、恶心、呕吐、肝肿大及肝功能损害，部分病人可有黄疸和发热。有些患者出现荨麻疹、关节痛或上呼吸道症状。病毒性肝炎呈世界性分布，我国是病毒性肝炎的高发区域，其中全国各地人群中乙型肝炎的发病率最高约为50％-70％。乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)感染所至。HBV属嗜肝DNA病毒科，为环状，双股DNA病毒，外层是脂蛋白包膜，含乙肝表面抗原(HBsAg)；内部是核心，含有核酸及乙肝核心抗原(HBcAg)。对人类血清中HBV的电镜检查，显示三种颗粒：即Dane颗粒、球型颗粒和丝状颗粒。HBV感染人体肝细胞后，对肝细胞并无直接致病作用，而是通过细胞免疫和体液免疫造成肝细胞的病毒性免疫损害，并从而引起各种临床表现。大部分患者呈急性发病过程，通常于6个月内痊愈；10％-20％患者可演变成慢性肝炎，继而发展成肝硬化，甚至肝细胞癌；90％以上新生儿感染者成为慢性携带者或慢性肝炎患者。但值得庆幸的是目前已有乙肝疫苗用于预防HBV感染，而且事实证明HB疫苗预防接种已降低了全球流行区人群中HBV的携带率及急性死亡率，且HB疫苗有极好的安全性。 然而随着乙肝疫苗普遍推行，对可逃逸HBV中和抗体的表面抗原基因(S基因)变异株感染逐步有所认识。有研究报道，目前在接受乙肝疫苗免疫和肝移植后接受HB免疫球蛋白治疗的患者中，不断发现HBsAg“α”决定簇突变的病毒，同时研究表明常规预防接种所产生的中和抗体对这些病毒无效。对该变异株进行进一步的测序发现，编码“α”决定簇的核苷酸有点突变(587位G→A)，导致HBVS基因区145位氨基酸由甘氨酸(GLy)→精氨酸(Arg)；突变发生的区域是能与疫苗诱导的抗体相结合的重要的抗原决定簇区，因此突变株不能被中和抗体识别，且五年后机体内依旧可以检测到此突变株，提示这种突变是有复制能力且遗传稳定的。HBsAg“α”决定簇145位变异株不仅流行广泛，而且同野生病毒株一样，具有致病性和传播能力，而且与肝炎的不良预后有关。研究表明，145位点的突变会导致HBsAg抗原性改变，致使临床上广泛使用的HBsAg诊断试剂对其无法检出，造成漏检。更为严重的是，用现行乙肝疫苗接种产生的抗体不能中和该变异株。在大范围人群接种乙肝疫苗后，由HBsAg“α”决定簇145位变异株引起的感染，很可能会成为新的公共卫生问题。因此，及时快速准确地检测出“α”决定簇突变变异株的感染很有意义。 目前，HBV的变异可通过PCR和DNA测序等技术来检测，但这些方法费用较高、技术难度大，尚不适于大量临床标本的分析。HBVS区145位点变异为HBsAg“α”决定基发生率较高的变异，因此研究该位点变异的快速检测方法具有非常重要的意义。在本文中，克隆145位点变异的HBVS基因，制备HBV变异株的诊断抗原，以此制备单克隆抗体，利用单克隆抗体及其多克隆抗体建立了145位突变HBsAg的快速检测方法，该方法具有较高的检测特异性及敏感性，有望解决隐性HBV持续性感染的漏检问题，从而使更多的人免受HBV的侵袭。建立乙肝变异株的快速诊断方法，为开展流行病学调查和相关的遗传进化关系分析奠定基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章HBV S基因的克隆及遗传进化分析

一、引言

二、实验材料与方法

三 结果与分析

四 讨论

第二章HBV S基因的原核表达及表达蛋白的纯化

一、引言

二、实验材料与方法

三、结果与分析

四、讨论

第三章单克隆抗体的制备

一、引言

二、实验材料与方法

三、结果与分析

四、讨论

第四章快速诊断方法的建立

一 引言

二、实验材料与方法

三、结果与分析

四、讨论

结论与创新点

一、结论

二、创新点

参考文献

致 谢

在读期间公开发表论文及著作情况

在读期间参加科研项目情况