一种无花果蛋白酶的制备方法

摘要

本发明涉及一种无花果蛋白酶的制备方法，属于生物技术领域。选新鲜无花果青果洗净，加入200～500mL 0.9％的NaCl溶液，匀浆，浸泡，除渣过滤，离心10分钟，向上清液中缓缓加入鞣酸溶液，4℃放置1～2小时，离心10分钟后，弃上清液，收集沉淀缓冲液溶解，离心，弃去上清液，重复两次，磷酸缓冲液溶解，冷冻干燥。优点在于，提供一种工艺简单，产率高，安全无污染，可大量生产的制备无花果蛋白酶的方法。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及利用生物技术制备具有高蛋白酶活性的无花果蛋白酶。

背景技术

无花果蛋白酶(Ficin：EC 3.4.22.3)属于蛋白水解酶，主要存在于无花果树树胶、无花果青果(Brunswike，Ficus Carica)和叶中。无花果蛋白酶是含多种组分的复合酶。无花果蛋白酶与木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶类似，属于巯基蛋白酶，其活性中心部位含有必需的巯基，能为半胱氨酸等多种还原剂激活。无花果蛋白酶(复合酶)分子量25000-26000左右；等电点9.0。它能以广泛的专一性水解各种天然蛋白质及合成底物的肽键、脂键和酰胺键。可用于食品工业的面点改良、肉类软化、乳制品凝固；畜牧业营养饲料的改良剂；在医药工业方面，作为消炎剂、消化促进剂、驱虫剂等；同时也是生命科学研究中的常用试剂。因此，无花果蛋白酶具有巨大的应用潜力。

1938年Walti首先从无花果树胶中获得无花果蛋白酶结晶。1964年Wong和Liener确定了酶活性中心巯基附近的氨基酸序列，发现其与木瓜蛋白酶(Light)和菠萝蛋白酶(Murachi)具有高度的同源性。1968年Englund取F.Glabrata树胶，经CM-cellulose交换层析分离得到多种具蛋白酶活性的组分，并测定了无花果蛋白酶组分III的氨基酸组成；N末端氨基酸为Leu，分子量为25500±750。

1969年Williams将树胶液分离，经硫酸铵、氯化钠盐析后，经CM-cellulose离子交换层析得到多种组分的无花果蛋白酶。1974年Kortt研究发现，F.glabrata树胶中含至少有6种组分的无花果蛋白酶，通过硫酸铵盐析、CM-cellulose离子交换层析、Sephadex G-75分离得到3种无花果蛋白酶(Ficin)。同年Anderson采用亲和层析方法，分离得到两种无花果蛋白酶。

九十年代，国内有研究者用乙醇沉淀、超滤获得无花果蛋白酶的复合酶。还有研究者用乙醇分段抽提、沉淀后经丙酮脱水得到无花果蛋白酶的复合酶。

相关资料表明，有关无花果蛋白酶分离提取，国外多使用盐析、柱层析的方法获得无花果蛋白酶，由于其制备工艺复杂，周期长，总酶活损失较大，因此这些方法仅限于实验室制备，不适用于大规模生产；国内文献报道无花果蛋白酶制备，多采用有机溶剂分段抽提、沉淀及超滤膜过滤来获得目标产品。这些方法产率低，成本高。若大规模生产无花果蛋白酶，需回收乙醇、丙酮等有机溶剂，浪费人力物力，且有机溶剂易燃易爆，用于工业生产将有重大的安全隐患。

发明内容

本发明提供一种无花果蛋白酶的制备方法，以解决现有生产方法中存在的产率低，成本高，需回收乙醇、丙酮等有机溶剂，浪费人力物力，且有机溶剂易燃易爆，用于工业生产将有重大的安全隐患的问题。本发明采取的技术方案是：

选新鲜无花果青果100g洗净，加入200～500mL 0.9％含1～5mMEDTA和1～5mMCys的NaCl溶液，匀浆，浸泡1～3小时，除渣过滤，4000～6000rpm离心10分钟，向上清液中缓缓加入鞣酸溶液至终浓度为0.2～0.5％，4℃放置1～2小时，4000～6000rpm离心10分钟后，弃上清液，收集沉淀用pH7.0，0.1M含1～5mM EDTA和1～5mM Cys的磷酸缓冲液溶解，4000～6000rpm离心10分钟，弃去上清液，重复两次，用30～50mL pH7.0，0.1M含1～5mM EDTA和1～5mMCys的磷酸缓冲液溶解，冷冻干燥。

本发明的优点在于，提供一种工艺简单，产率高，安全无污染，可大量生产的制备无花果蛋白酶的方法。本发明以新鲜无花果青果(Brunswike，Ficus Carica)为原料，采用生物技术，加入适量保护剂，用0.9％氯化钠抽提，以鞣酸沉淀目标产品，经冷冻干燥，获得无花果蛋白酶。该工艺成本低，产率高，周期短，重复性好，对环境无污染，适合大量生产，具有巨大的应用潜力。

附图说明

图1.无花果蛋白酶的SDS----PAGE电泳图谱。

12％分离胶，5％浓缩胶，考马斯亮兰染色。样品自左到右：

1.无花果蛋白酶；2.无花果蛋白酶；3.无花果蛋白酶(美国Sigma)；

4.无花果蛋白酶；5.标准分子量Marker(Pharmacia)。

具体实施方式

实施例1：

选新鲜无花果青果100g洗净，加入200mL 0.9％含5mM EDTA和5mMCys的NaCl溶液，匀浆，浸泡3小时，除渣过滤，6000rpm离心10分钟，向上清液中缓缓加入鞣酸溶液至终浓度为0.2％，4℃放置2小时，6000rpm离心10分钟后，弃上清液，收集沉淀用pH7.0，0.1M含5mM EDTA和5mMCys的磷酸缓冲液溶解，6000rpm离心10分钟，弃去上清液，重复两次，用30mL pH7.0，0.1M含5mM EDTA和5mMCys的磷酸缓冲液溶解，冷冻干燥，获得无花果蛋白酶粉。

实施例2

选新鲜无花果青果100g洗净，加入350mL 0.9％含3mM EDTA和3mMCys的NaCl溶液，匀浆，浸泡2小时，除渣过滤，5000rpm离心10分钟，向上清液中缓缓加入鞣酸溶液至终浓度为0.3％，4℃放置1.5小时，5000rpm离心10分钟后，弃上清液，收集沉淀用pH7.0，0.1M含3mM EDTA和3mMCys的磷酸缓冲液溶解，5000rpm离心10分钟，弃去上清液，重复两次，用40mL用pH7.0，0.1M含3mMEDTA和3mMCys的磷酸缓冲液溶解，冷冻干燥。

实施例3

选新鲜无花果青果100g洗净，加入500mL 0.9％含1mM EDTA和1mMCys的NaCl溶液，匀浆，浸泡1小时，除渣过滤，4000rpm离心10分钟，向上清液中缓缓加入鞣酸溶液至终浓度为0.5％，4℃放置1小时，4000rpm离心10分钟后，弃上清液，沉淀用pH7.0，0.1M含1mM EDTA和1mMCys的磷酸缓冲液溶解，4000rpm离心10分钟，弃去上清液，重复两次，用50mL用pH7.0，0.1M含1mM EDTA和1mMCys的磷酸缓冲液溶解，冷冻干燥。

实验例：无花果蛋白酶的检测

(1)无花果蛋白酶的活性测定

参照美国药典Kunitz方法对无花果蛋白酶进行酶活性检测。酶活性单位定义为：在规定条件下，每分钟使得280nm处吸收值上升0.001定义为一个活性单位，即1U。经测定：

样品酶活为95000～120000U/g固体。

(2)分子量及纯度检测

参照2005版中国药典第三部，采用5％的浓缩胶，12％的分离胶，pH不连续系统进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，以Pharmacia低分子量标准蛋白和美国Sigma公司的无花果蛋白酶为标准对照，考查产品的分子量及纯度。

参见图1，从SDS----PAGE电泳图谱可见，本工艺提取的无花果蛋白酶，图中1，2，4泳道，与美国Sigma公司的无花果蛋白酶分子量一致。