含有与色氨酸的生物合成有关的突变基因的大肠杆菌突变体和用所述突变体生产色氨酸的方法

摘要

本发明涉及产生色氨酸的大肠杆菌突变株CJ285(KCCM－10534)，该突变株含有与色氨酸的生物合成有关的一个或多个突变基因，和涉及用所述突变株产生色氨酸的方法。更具体地，本发明公开了源自于产生色氨酸的大肠杆菌突变株CJ285(KCCM－10534)并与色氨酸生物合成有关的aroF、aroG、trpR和tyrR的DNA碱基序列和氨基酸序列，并将含有至少一个所述突变基因的大肠杆菌CJ285直接培养在含有葡萄糖的发酵培养基中，由此可在培养基中积累L－色氨酸。

说明书

技术领域

本发明涉及含有一个或多个与色氨酸的生物合成有关的突变基因的产色氨酸的大肠杆菌(E.coli)突变株CJ285(KCCM-10534)和用所述突变株生产色氨酸的方法。更具体地，用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(下文将其称为NTG)进行反复处理，而得知了源自产色氨酸的突变基因CJ285的多种基因的碱基序列和氨基酸序列，如用于编码抗色氨酸异羟肟酸(下文将其称为THX，色氨酸类似物)的DAHP合酶的同功酶的aroF和aroG，用于调节与色氨酸生物合成有关的trp、aroH、mtr、trpR和aroL操纵子的trpR，以及用于调节aroF-tyrA、aroG和aroP操纵子的tyrR蛋白。然后在含有葡萄糖的培养基中对含有一个或多个上述基因的突变株进行发酵，以生产L-色氨酸。

背景技术

色氨酸是必需氨基酸之一，并已经被广泛用于各种领域，包括饲料添加剂，诸如安眠药或镇静剂或林格氏溶液等医药物质，以及健康食品物质。色氨酸的典型生产方法是化学合成、酶反应和用微生物进行发酵。在化学合成的情况中，在高温和高压的空间中进行生产，而且由于D-色氨酸和L-色氨酸一起产生，因此为获得所需的色氨酸需要另外的精制过程。在酶反应(如Matsui Doatsui的日本专利(韩国专利公开号90-005773)的情况中，用作反应底物的吲哚和丝氨酸非常贵，而且酶本身也不安全。

另一方面，采用微生物的发酵涉及各种微生物，如大肠杆菌和棒状杆菌(Corynebacterium)的营养缺陷株和调节突变株。在二十世纪80年代迅速发展的基因重组技术提供了很多有关新陈代谢及其控制机制的信息。许多研究人员通过基因操作，非常成功地开发出了优异的重组株并提高了生产力(Matsui等，1988)。同时，在韩国，很多与通过使用色氨酸抗性或营养缺陷型突变株(韩国专利公开号87-1813、90-8251和92-7405)或重组株(韩国专利公开号90-5772和91-5627)的直接发酵有关的色氨酸生产技术已经公开。这些色氨酸类似物抗性株主要是为了在色氨酸生物合成过程中克服酶的反馈抑制，而且重组株也用来克隆色氨酸生物合成过程中的酶。事实上，该研究已经获得了巨大的成功。例如，使用大肠杆菌的人工突变体的传统L-色氨酸生产的最大特征是使用廉价的培养底物来生产L-色氨酸。然而，生产力或色氨酸的产量极低。因此，为了通过基因重组使色氨酸的产量最大，有必要确保作为亲本菌株的人工突变体优良以及获得其调节已经解除的基因。

发明内容

因此，鉴于上述问题而创造了本发明，本发明的一个目的是鉴定突变基因的碱基序列和氨基酸序列，所述突变基因用于编码aroF和aroG和用于调节与色氨酸合成有关的基因的转录的trpR和tyrR，所述aroF和aroG是用于3-脱氧阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(3-deoxyarabionohep-tulosonate7-phosphate，下文将其称为DAHP)合成的酶，所述DAHP是源自大肠杆菌突变株CJ285的色氨酸的合成过程中的芳香族氨基酸的第一个前体，该DAHP是由磷酸烯醇丙酮酸和赤藓糖4-磷酸(Erythorse 4-phosphate)制得的。

本发明的另一个目的是提供含有上述一个或多个突变基因的生产L-色氨酸的大肠杆菌突变株。

本发明的另一个目的是提供通过将所述突变株直接培养在含有葡萄糖的发酵培养基中来生产高浓度和高产量的L-色氨酸的方法。

附图说明

根据以下详述内容并结合附图，将可以更清楚地理解本发明的上述和其它的目的、特征和其它优点，其中：

图1显示了一个突变基因，其中aroF基因的内部序列中的CCT被突变为[TCT]，结果导致第280位氨基酸即脯氨酸变为丝氨酸；

图2显示一个突变基因，其中aroG基因的启动子区域中的T碱基被突变为[C]碱基，该基因的内部序列中的GTG被突变为[GCG]，TGC被突变为[CGC]，结果分别导致第57位氨基酸即缬氨酸变为丙氨酸，和第61位氨基酸即半胱氨酸变为精氨酸；

图3显示一个突变基因，其中trpR基因的内部序列中第704位的G碱基被删掉了，结果导致蛋白翻译过程中的框架发生变化，并且相对于野生型基因[cgattgattttgtaggcctgataagacgtggcgcatcaggcatcgtgcaccgaatgccggatgcggcgtga]，其增加了23个氨基酸；和

图4显示一个突变基因，其中tyrR基因的内部序列中的GGC被突变为[GAC]，而CTG被突变为[CTA]，结果导致第25位氨基酸即甘氨酸变为天冬氨酸，并且使第86位氨基酸即亮氨酸变为无义突变。

具体实施方式

技术问题

根据本发明的一个方面，上述和其它的目的可以通过提供含有与色氨酸生物合成有关的突变基因的大肠杆菌突变株来实现，其中用NTG对大肠杆菌CJ181(KFCC 10902，产生色氨酸的亲本菌株)进行反复处理，以在其中引起突变，并且使突变体(CJ285)具有色氨酸类似物THX抗性，由此使突变株相对于亲本菌株，其色氨酸产量得到显著提高。同时，为了分析DNA碱基序列和氨基酸序列，克隆了编码以下物质的基因：aroF和aroG，所述aroF和aroG为色氨酸生物合成过程中合成芳香族氨基酸的第一个前体DAHP的酶；用于调节与色氨酸生物合成有关的trp、aroH、mtr、trpR和aroL操纵子的trpR蛋白；以及用于调节aroF-tyrA、aroG、aroP操纵子的tyrR蛋白；并将DNA碱基序列与野生型基因的碱基序列进行比较。通过这种方式，就可以对基因突变进行定位。然后，将含有aroF、aroG、trpR和tyrR中的至少一个的CJ285菌株直接培养在含有葡萄糖的发酵培养基中。相对于亲本菌株，CJ285生成的色氨酸要多得多。

也就是说，通过基因重组技术，大肠杆菌CJ285菌株可以用来使色氨酸产率最大，并且该菌株是从未公开的新菌株。

技术方案

本发明提供L-色氨酸的生产方法，其中该方法包括以下步骤：通过聚合酶链式反应(PCR)扩增基因的引物，所述基因为编码涉及3-脱氧阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)的合成的酶的基因，编码用于调节与色氨酸生物合成有关的trp、aroH、mtr、trpR和aroL操纵子的trpR蛋白的基因，和编码用于调节aroF-tyrA、aroG和aroP操纵子的tyrR蛋白的基因，通过pCR2.1-TOPO载体克隆所述基因以寻找与预期大小的条带反应的质粒克隆；利用含有上述4个基因的质粒克隆作为模板，根据双向碱基序列分析，测定aroF、aroG、trpR和tyrR基因的碱基序列，由所述碱基序列确定氨基酸序列，并将所述基因的碱基序列与野生型基因的碱基序列进行比较以对突变进行定位；和将含有一个或多个突变基因aroF、aroG、trpR和tyrR的大肠杆菌突变株CJ285在含有葡萄糖的发酵培养基中进行发酵，由此生产L-色氨酸。

本发明中所用的基因操作遵照分子克隆实验室手册(MolecularCloning Laboratory Manual，T.Maniatis E.F.，Flitch，J.Sambrook)。

在含有0.3g/l的THX(色氨酸类似物)的基本培养基的平板中将产生色氨酸的亲本菌株大肠杆菌CJ181(KFCC 10902)恒温培养5天。为了提高生长速度并解除CJ181对THX的敏感性，向培养基中加入500μg/ml的致突变物NTG。首先，选择在含有0.3g/l THX的基本培养基中生长的任何菌株，并将这些经选择的菌株再次培养在含有0.5g/l THX的基本培养基中。最后，选择到了对THX具有高度抗性的菌株，并将其命名为CJ285。基本培养基的成分如下表1所示，分别往培养基中添加100mg/l的辅源氨基酸。

表1  大肠杆菌基本培养基(M9培养基)的组成

  葡萄糖基本培养基(M9培养基)  成分  含量(g/l)  葡萄糖  2  NaHPO₄  6  KH₂PO₄  3  NaCl  0.5  NH₄Cl  1  MgSO₄  0.5  CaCl₂  0.01  酪氨酸  0.1  pH 7.0

在37℃将本发明的突变株CJ285在LB培养基中摇动培养12小时。LB培养基(pH＝7.4)含有1％的细菌用胰蛋白胨(Bacto-Trypton)、0.5％的细菌用酵母提取物和1％的NaCl。从培养基收集地衣共生菌(mycobiont)，并利用Quiagen染色体DNA分离试剂盒获得染色体DNA。将如此获得的染色体DNA浸在乙醇中并干燥纯化。以所述经纯化染色体DNA为模板进行PCR。使用Quiagen凝胶提取试剂盒，从1％琼脂糖凝胶中分离到分别约为1.3kb、2kb、530bp和1.9kb的aroF、aroG、trpR和tyrR突变基因，并纯化所述基因片段以用作克隆的遗传资源。利用TOPO克隆试剂盒(由Invitrogen公司生产)，将源自于CJ285菌株的这些突变基因片段克隆到pCR2.1-TOTO载体中，结果鉴定到含有所述基因的克隆。

为了测定编码aroF、aroG、trpR和tyrR蛋白的基因的碱基序列和氨基酸序列，分离和纯化包含突变基因的质粒，并测定包括启动子后的序列、遗传密码区，蛋白合成终止密码子在内的整个基因序列。为了测定本发明的基因的DNA碱基序列，将先前分离纯化的质粒DNA与测序引物和聚合酶混合，并通过PCR进行扩增。将经如此扩增的质粒DNA浸在乙醇中进行纯化并与Hi-Di溶液混合。结果，质粒DNA被转换成含有单链的双链DNA(dsDNA)，并用碱基序列测序仪ABI 3100(由Applied Biosystem制造)进行DNA碱基序列分析。根据美国NCBI(National Center for BiotechnologyInformation)网站中的BLAST(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)检索程序和ExPasy网站中的Tools PROGRAM(http：//us.expasy.org/tools/dna.html)进行DNA碱基序列分析。然后将经如此测定的基因碱基序列与野生型基因的碱基序列进行比较，以检查是否发生任何突变，并通过翻译来鉴定突变氨基酸。

将包含突变基因aroF、aroG、trpR和tyrR中的至少一个的CJ285突变株在含有葡萄糖的发酵培养基中直接发酵，以生产L-色氨酸。更具体地，在有氧条件(以200rpm～300rpm摇动瓶子或以400rpm～1000rpm摇动发酵罐，并且气流量＝0.5vvm～1.5vvm)下培养所述突变株，发酵温度＝30℃，pH＝6.0～8.0，所生成的L-色氨酸积累在培养基中。在使用瓶子的情况中，在30℃和220rpm将突变株培养48小时～60小时，所生成的L-色氨酸积累在培养基中。在使用发酵罐的情况中，采用补料分批培养法。于是，另外多次补充葡萄糖来生产L-色氨酸。发酵培养基各成分列于下表2中。

表2  发酵培养基的组成

  三角瓶中的发酵培养基  5L发酵罐中的发酵培养基  成分  含量(g/l)  成分  含量(g/l)  葡萄糖  60  葡萄糖  63.16  酵母提取物  2.5  酵母提取物  4  KH₂PO₄  2  KH₂PO₄  1.5  MgSO₄·7H₂O  1  柠檬酸  1.4  (NH₄)₂SO₄  20  MgSO₄·7H₂O  2  柠檬酸钠  5  (NH₄)₂SO₄  7  NaCl  1  酪氨酸  0.8  酪氨酸  0.1  富马酸  1  CaCO₃  40  CaCl₂  0.5

为了了解培养基的地衣共生菌的生长速度，测定了600nm的吸光度。而且，还根据Bertrand法进行糖分析。同时，利用HPLC(高效液相色谱)分析了L-色氨酸的量。

虽然为说明目的而公开了本发明的优选实施方式，但是本领域技术人员应该理解，各种修改、增加和替换都是可能的，其并未脱离如附加的权利要求书所公开的本发明的范围和精神。

有益效果

根据本发明，通过用NTG反复处理大肠杆菌CJ181，开发了新的大肠杆菌突变株CJ285(KCCM-10534)，并且该突变株具有色氨酸异羟肟酸(色氨酸类似物)抗性。通过分析与色氨酸生物合成有关的突变基因aroF、aroG、trpR和tyrR的DNA碱基序列和氨基酸，可鉴定重要的突变，并且可获得在重组菌株开发中使用的适当的突变基因。此外，相对于亲本菌株CJ181，它的包含至少一个突变基因的突变株CJ285能够产生更多的色氨酸(约多10％)。因此，本发明的CJ285非常有利于用作重组菌株开发和氨基酸发酵业和药物制造的适当亲本菌株。

实施例

实施例1  THX抗性突变株CJ285的选择

在37℃将产生色氨酸的亲本菌株大肠杆菌CJ181(KFCC 10902)在LB培养基中摇动培养12小时，并用经消毒的盐水溶液冲洗两次。此处的LB培养基(pH＝7.4)含有1％的细菌用胰蛋白胨、0.5％的细菌用酵母提取物和1％的NaCl。将CJ181稀释在0.1M的柠檬酸钠缓冲液(pH＝5.5)中直到最终OD＝1.0。将CJ181在含有0.3g/l的THX的基本培养基(请参照表1)中培养5天。为了提高生长速度并获得对THX具有抗性的CJ181，将500μg/ml的NTG(致突变物)加到培养基中。将该溶液放在37℃恒温浴中反应30分钟，并在0.1M磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)中漂洗3次。然后将CJ181在含有0.5g/l的THX的基本培养基(请参照表1)中培养5天，结果获得约100个菌落。在瓶子中对如此获得的突变株和原来的亲本菌株进行色氨酸发酵试验。结果可选择到相对于原来的大肠杆菌亲本菌株CJ181具有更优异的色氨酸生产性能特征的大肠杆菌CJ285。从该菌株中分离产生L-色氨酸的最好菌株，并将其放在三角瓶中。在三角瓶中对该菌株进行色氨酸生产试验之后，如以下实施例6中所述，在5L发酵罐中进行发酵实验。

表3  新开发的人工突变株在瓶中的实验结果

  大肠杆菌  地衣共生菌(Mycobiant)  (OD₆₀₀)  L-色氨酸(g/l)  CJ181  30  7.1  CJ285  28  7.9

如表3所见到的，由大肠杆菌突变株CJ285生产的L-色氨酸比原来的亲本菌株大肠杆菌KFCC 10902的高。在2003年11月28日将CJ285保藏在KCCM(韩国微生物保藏中心，Korean Culture Center of Microorganisms)，编号为KCCM-10534。

实施例2  突变株CJ285的aroF基因的克隆和序列分析

为了利用从CJ285中分离的染色体DNA作为模板通过PCR扩增aroF基因，使用了下列的引物(21mer)。用5′-GTATTTACCCCGTTATTGTC-3′作为正义引物，并用5′-CACTTCAGCAACCAGTTCCAG-3′作为反义引物。为进行PCR，将约30ng的CJ285的基因组DNA和各为25pmol的引物加到含有DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液的Accupower PCR HL-Premix中，直至最终浓度变为20μl。PCR程序运行25次。开始在94℃进行5分钟，然后在94℃进行35秒，55℃进行40秒和72℃进行90秒。最后，在72℃进行最后延伸7分钟。然后通过1％琼脂糖凝胶电泳对其结果进行检测。

为了将基因片段克隆到pCR2.1-TOPO载体中，利用Quiagen凝胶提取试剂盒从1％的琼脂糖凝胶中分离约1.3kb(其对应于aroF突变基因的大小)的基因片段。然后纯化如此获得的基因片段，并将其用作克隆的遗传资源。使用TOPO克隆试剂盒(由Invitrogen公司生产)，将从CJ285菌株获得的突变基因片段与pCR2.1-TOPO载体溶液按1∶4的比率进行混合。然后，往该混合物中加入1μl的盐水溶液，并在室温持续反应20分钟。将反应溶液和40μl的包含在所述试剂盒中的TOP10感受态细胞混合并在冰上放置20分钟。然后在42℃热激30秒，并立即将该溶液放回冰上，放置2分钟。向其中加入250μl的SOC培养基，并将该突变基因于37℃培养1小时。将100μl培养物培养基涂在含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，并在其中于37℃将该突变基因培养约12小时。只选择白色菌落并再次在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中培养约12小时。从中提取质粒，并用EcoRI限制酶处理2小时，然后用1％琼脂糖凝胶电泳进行显影。利用紫外照射仪，鉴定到了含有突变基因的克隆。

为了测定该基因的DNA碱基序列，从先前鉴定的克隆中分离质粒并纯化。将经如此分离纯化的质粒和2pmol能够通过互补氢键与aroF基因结合的序列分析引物、2μl含有聚合酶的Big dye和1μl质粒DNA(约200ng)混合。然后，将PCR运行25次，首先在96℃进行30秒，50℃进行15秒和60℃进行4分钟。将质粒DNA浸在乙醇中纯化，并与10μl的Hi-Di溶液混合。结果，质粒DNA被转换成含有单链的双链DNA，并用碱基序列测序仪ABI3100(由Applied Biosystem制造)进行DNA碱基序列分析。根据美国NCBI(National Center for Biotechnology Information)网站中的BLAST(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)检索程序和ExPasy网站中的ToolsPROGRAM(http：//us.expasy.org/tools/dna.html)进行DNA碱基序列分析。然后将经如此测定的基因碱基序列与野生型基因的碱基序列进行比较以检查是否发生任何突变，并通过翻译来鉴定突变氨基酸。

实施例3  突变株CJ285的aroG基因的克隆和序列分析

为了利用从CJ285中分离的染色体DNA作为模板通过PCR扩增aroG基因，使用了下列的引物(21mer)。用5’-GTATTTACCCCGTTATTGTC-3’作为正义引物，并用5’-ACTCCGCCGGAAGTGACTAA-3’作为反义引物。为进行PCR，将约30ng的CJ285的基因组DNA和各为25pmol的引物加到含有DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液的Accupower PCR HL-Premix中，直至最终浓度变为20μl。PCR程序运行25次。开始在94℃进行5分钟，然后在94℃进行35秒，55℃进行40秒和72℃进行2分钟20秒。最后，在72℃进行最后延伸7分钟。然后通过1％琼脂糖凝胶电泳对其结果进行检测。

为了将基因片段克隆到pCR2.1-TOPO载体中，利用Quiagen凝胶提取试剂盒分离到约2kb(其对应于aroG突变基因的大小)的基因片段。然后纯化如此获得的基因片段，并将其用作克隆的遗传资源。此后的实验程序和碱基序列测定后的碱基序列分析与实施例2中的相同。

实施例4：突变株CJ285的trpR基因的克隆和序列分析

为了利用从CJ285中分离的染色体DNA作为模板通过PCR扩增trpR基因，使用了下列的引物(21mer)。用5’-CGCCACGGAATGGGGACGTCG-3’作为正义引物，并用5’-CCGCGTCTTATCATGCCTACC-3’作为反义引物。为进行PCR，将约30ng的CJ285的基因组DNA和各为25pmol的引物加到含有DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液的Accupower PCR HL-Premix中，直至最终浓度变为20μl。PCR程序运行25次。开始在94℃进行5分钟，然后在94℃进行1分钟，60℃进行30秒和72℃进行1分钟。最后，在72℃进行最后延伸7分钟。然后通过1％琼脂糖凝胶电泳对其结果进行检测。

为了将基因片段克隆到pCR2.1-TOPO载体中，利用Quiagen凝胶提取试剂盒分离到约530bp(其对应于trpR突变基因的大小)的基因片段。然后纯化如此获得的基因片段，并将其用作克隆的遗传资源。此后的实验程序和碱基序列测定后的碱基序列分析与实施例2中的相同。

实施例5  突变株CJ285的tyrR基因的克隆和序列分析

为了利用从CJ285中分离的染色体DNA作为模板通过PCR扩增tyrR基因，使用了下列的引物(21mer)。用5’-GGATTGACGATGACAAACCT-3’作为正义引物，并用5’-CTGGTGGATGAAATCACCAC-3’作为反义引物。为进行PCR，将约30ng的CJ285的基因组DNA和各为25pmol的引物加到含有DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液的Accupower PCR HL-Premix中，直至最终浓度变为20μl。PCR程序运行25次。开始在94℃进行5分钟，然后在94℃进行1分钟，53℃进行30秒和72℃进行2分钟20秒。最后，在72℃进行最后延伸7分钟。然后通过1％琼脂糖凝胶电泳对其结果进行检测。

为了将基因片段克隆到pCR2.1-TOPO载体中，利用Quiagen凝胶提取试剂盒分离到约1.9kb(其对应于tyrR突变基因的大小)的基因片段。然后纯化如此获得的基因片段，并将其用作克隆的遗传资源。此后的实验程序和碱基序列测定后的碱基序列分析与实施例2中的相同。

实施例6  在5L发酵罐中对突变株CJ285所进行的发酵

将包含具有如实施例2～5所公开的碱基序列的突变基因中的至少一个的大肠杆菌CJ285和亲本菌株CJ181(KFCC 10902)补料分批培养在5L发酵罐(发酵温度＝30℃，培养物pH＝6.9～7.1(pH可以由氨水控制)，空气流量＝0.5vvm～1.0vvm，且搅拌速度＝500rpm～700rpm)中。结果，CJ285的发酵浓度为28.2g/l，亲本菌株CJ181的发酵浓度为25.1g/l。因此，大肠杆菌CJ285的发酵时间稍微减少，从而L-色氨酸生产率每小时提高约10％。

表4  5L发酵罐中CJ285突变株的发酵

  菌株的名称  培养时间(hr)  总糖(g/l)  积累的T-色氨酸的总  量  CJ181  63  243.5  25.1  CJ285  61  243.5  28.2

  申请人或代理机构的案卷号  FCI06KR1341  国际申请号  PCT/KR2004/003030

            有关保藏的微生物或其他生物材料的说明

                    (PCT Rule 13bis)

  A.下面的说明涉及保藏的微生物或其他生物材料，该微生物或其他生物材料描  述于说明书第8页，第8-10行  B.保藏物的鉴定                其他的保藏物在附页□  保藏机构的名称  韩国微生物保藏中心  保藏机构的地址(包括邮编和国家)  名称：韩国微生物保藏中心  地址：361-221，Yurim B/D，Hongje 1-dong，seodaemun-gu  首尔120-091，韩国  保藏日期  2003年11月28日  保藏编号  KCCM-10534  C.附加说明(如果没有，保留空白)   在附加页上继续此信息□  D.进行说明的指定国家(如果该说明不是针对所有指定的国家)  E.单独提供说明(如果没有，保留空白)  以后会将下列的说明提交到国际局(具体表明该说明的一般性质，如“保藏编  号”)  仅供受理局填写  □随国际申请一起收到本页  负责人  仅供国际局填写  □国际局在：收到本页  负责人

表PCT/RO134(1998年7月)