一株产壳聚糖酶的腐皮镰孢菌突变株及其在制备壳寡糖中的应用

摘要

本发明公开了一株产壳聚糖酶的腐皮镰孢菌突变株(Fusarium solani mut.Hydrochitosans)Fs107，该菌株于2006年05月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国科学院微生物研究所，中国，北京)，其保藏编号为CGMCCNo.1720；本发明还公开了所述的腐皮镰孢菌突变株在制备壳寡糖中的应用，其制备方法包括(1)斜面培养，(2)种子培养，(3)扩大培养，(4)收集发酵粗酶液，(5)酶解底物，(6)分离产物等步骤；该方法具有产酶效率高，酶对底物的专一性作用强，产物中有效组分(二糖、三糖、四糖)含量高，不产生单糖等特点，在壳寡糖的生产方面具有很大的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一株腐皮镰孢菌突变株及其应用，具体地说，涉及一株产壳聚糖酶的腐皮镰孢菌突变株(Fusarium solani mut.hydrochitosans)Fs107及其在制备壳寡糖中的应用。

背景技术

地球上存在的天然有机化合物中，数量最大的是纤维素，其次是甲壳素，而甲壳素同时也是地球上数量最大的含氮有机化合物，其次才是蛋白质。甲壳素是由N-乙酰氨基葡萄糖以β-1，4糖苷键缩合而成，壳聚糖为甲壳素脱乙酰化后的产物，壳寡糖为壳聚糖的降解产物。

甲壳素以其加工方法的不同主要分为以下3个层次的系列衍生产品：A.甲壳素(几丁质)，分子量在100万以上，其吸收能力强，适合工业和环保应用，但不溶于酸碱，也不溶于水，很难被人体吸收。B.壳聚糖，分子量在10万左右，一般仅溶于弱酸，不溶于水，可以被人体吸收，可以作为食品添加剂及保健品原料等。C.壳寡糖，分子量低于5000，具水溶性，非常容易被人体吸收，具有强化免疫、抑制癌细胞，调节胆固醇、降血压、降血糖、调节生理机能等多种功能，广泛应用于医药、保健、食品、日化、农业等领域，是甲壳素系列产品中应用性能最好的产品。

目前，国内外制备壳寡糖的方法主要有化学降解法和酶解法。酶解法具有反应条件温和、壳寡糖得率高、环境污染小等特点，具有较好的发展前景。壳寡糖的酶法制备又分为专一性酶法和非专一性酶法，非专一性酶法主要是混合利用各种水解酶类，包括纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶等，降解壳聚糖产生不同聚合度的壳寡糖。但该方法用酶量大，成本高，且产物成分难以控制。壳聚糖酶是专一性水解酶，利用壳聚糖酶制备壳寡糖的方法，称为壳寡糖的专一性酶法制备。目前已在多种微生物和植物中发现壳聚糖酶，但由于酶活较低，产酶量小等特点，还未有产业化的报道，特别是还未有适合产业化的壳聚糖酶生产菌株应用的报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一株高酶活且适合产业化的产壳聚糖酶的腐皮镰孢菌突变株及其在制备壳寡糖中的应用。

本发明提供的一株能够生产壳聚糖酶的菌株，经过鉴定确认为腐皮镰孢菌突变株(Fusarium solani mut.hydrochitosans)Fs107，该菌株于2006年05月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国科学院微生物研究所，中国，北京)，保藏中心编号为：CGMCC No.1720。

上述腐皮镰孢菌突变株(Fusarium solani mut.hydrochitosans)Fs107 CGMCC No.1720经鉴定，具有如下生物学特征：该菌在PDA(土豆培养基)平皿上4天的生长直径约为4.2cm，气生菌丝绒毛状，褐白色、菌落反面淡褐色或浅红色，分生孢子有大小两型。大型分生孢子无色，镰刀形，有3～4个隔膜，大小30～50μm×4.6μm；小型分生孢子长椭圆形或圆柱形，串生，无色有1-2个隔膜，很少或不产生；厚垣孢子球形或卵圆形，表面光滑或粗糙，顶生或间生，单生或双生，大小8～10μm×7.0～9.5μm。

本发明涉及的产壳聚糖酶的腐皮镰孢菌突变株(Fusarium solani mut.hydrochitosans)Fs107在制备壳寡糖中的应用。

上述的产壳聚糖酶的腐皮镰孢菌突变株(Fusarium solani mut.hydrochitosans)Fs107在制备壳寡糖中的应用方法，主要涉及的步骤顺序如下：

(1)菌种选择：腐皮镰孢菌突变株(Fusarium solani mut.hydrochitosans)Fs107CGMCC No.1720；

(2)斜面培养：将菌种接种于土豆培养基，其中添加质量体积比为1.5～2.0％的琼脂，20～30℃条件下，静止培养24～72小时；

(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于100～300ml含有质量体积比1～3％的葡萄糖，0.05～0.15％蛋白胨，0.05～0.15％酵母粉，pH值为5.0～7.0的基本无机盐培养基中，20～30℃条件下，振荡培养24～72小时，制得种子液；

(4)扩大培养：以5～10％的体积比的接种量将种子液接种于含有质量体积比为1～3％的葡萄糖，0.05～0.15％蛋白胨，0.05～0.15％酵母粉，0.05～0.15％干酪素，pH值为5.0～7.0的基本无机盐培养基中，20～30℃条件下，振荡培养48～96小时；

(5)收集发酵粗酶液：将步骤(4)所得的发酵液过滤除菌体，收集除菌体后的发酵液，即为壳聚糖酶粗酶液；

(6)酶解底物：将步骤(5)所得的壳聚糖酶粗酶液加水稀释至酶活为50mu/ml，加入壳聚糖底物，使底物终浓度质量体积比为0.5～4.5％，于40～60℃，pH值为5.0～7.0条件下，反应4～10小时，制得壳寡糖溶液粗产品；

(7)分离产物：将步骤(6)所得壳寡糖溶液粗产品，于真空旋转蒸发仪中蒸发除去水分，烘干，得壳寡糖产物。

其中，步骤(2)、(3)、(4)中所述的菌体培养温度优选是23～27℃。

其中，步骤(3)、(4)中所述的葡萄糖的浓度优选质量体积比为1.5～2.5％，蛋白胨的浓度优选质量体积比为0.08～0.12％，酵母粉的浓度优选质量体积比为0.08～0.12％。

其中，步骤(3)中所述的菌体培养时间优选是44～50小时。

其中，步骤(3)、(4)中所述的菌体培养pH值优选是5.2～6.2。

其中，步骤(4)中所述的干酪素的浓度优选质量体积比为0.08～0.12％，菌体振荡培养时间优选是50～70小时。

其中，步骤(6)中所述的底物终浓度体积比优选是0.8～2.2％；酶解温度优选是52～58℃；酶解pH值优选是5.2～5.8；酶解时间优选是5～8小时。

在上述利用产壳聚糖酶的腐皮镰孢菌突变株(Fusarium solani mut.Hydrochitosans)Fs 107制备壳寡糖的方法中，步骤(2)、(3)、(4)中所述的菌体培养使用添加葡萄糖、蛋白胨和酵母粉的液体基本无机盐培养基(Basal Salts Medium，BSM)，配方为：

每1000ml蒸馏水中添加：葡萄糖20g、蛋白胨1g、酵母粉1g、KCl 0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、NaNO₃ 2g、FeSO₄·7H₂O 0.02g、K₂HPO₄ 1g。

上述固体斜面培养基优选为添加质量体积比为1.6％琼脂粉的土豆培养基。

上述步骤(2)、(3)、(4)中所述的菌体培养基于115℃条件下灭菌20分钟后使用。

经试验鉴定，本发明的产壳聚糖酶的腐皮镰孢菌突变株(Fusarium solani mut.hydrochitosans)Fs107具有产壳聚糖酶的酶活较高，产酶量大，酶为组成型分泌等特点，且酶解时间较短，产物用有效成分高，不含单糖，适合产业化应用。

利用本发明所述的腐皮镰孢菌突变株(Fusarium solani mut.hydrochitosans)Fs107CGMCC No.1720可以高产在医药、保健、食品、日化、农业等许多领域具有重要用途的壳寡糖产品，产物中有效组分(二糖、三糖、四糖)含量高，具有极大的应用前景。

发明人从2002年开始了壳聚糖酶产生菌的筛选，得到具有自主知识产权的壳聚糖酶产生菌两株，其中本发明所述的此株腐皮镰孢菌突变株(Fusarium solani mut.hydrochitosans)Fs107所产生的壳聚糖酶酶活(240mU/ml)比另外一株已经报道的腐皮镰孢菌的壳聚糖酶酶活(100mU/ml)高出很多，比日本报道的Fusarium solani f.sp.phaseoli SUF386也要高，而且本发明酶解底物壳聚糖后不产生单糖。

附图说明

本发明提供的菌株腐皮镰孢菌突变株(Fusarium solani mut.hydrochitosan)Fs107已于2006年05月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市海淀区中关村北一条13号，邮政编码：100080，其保藏编号为CGMCC No.1720。

图1壳寡糖产物薄层层析图

其中：1是氨基葡萄糖；2是壳聚糖；3、4、5是国内益丰公司产品，6、7是实施例4所得壳寡糖产物

具体实施方式

实施例1：腐皮镰孢菌突变株(Fusarium solani mut.hydrochitosans)Fs107 CGMCC No.1720的筛选。

从德州、聊城、菏泽、枣庄等地的大豆农田土壤中取样，经过平板透明圈法筛选得到八株产壳聚糖酶较高的菌株，接着进行UV诱变，平板透明圈法筛选，得到两株高产壳聚糖酶的腐皮镰孢菌突变株。随后进行摇瓶发酵培养和小型发酵罐培养，在培养温度为25℃，发酵培养基pH为5.6，转速为150rpm，通气量为2.0vvm的条件下进行发酵。其中经筛选后的本发明的腐皮镰孢菌突变株(Fusarium solani mut.hydrochitosans)Fs107 CGMCC No.1720具有很好的产酶活性，酶活达到240mU/ml。

上述平板透明圈法使用固体基本无机盐培养基，添加质量体积比为2％的葡萄糖，0.1％的蛋白胨，0.1％的酵母粉，0.5％的壳聚糖和1.6％的琼脂粉。

上述产壳聚糖酶的发酵培养基使用液体基本无机盐培养基，添加质量体积比为2％的葡萄糖，0.1％的蛋白胨，0.1％的酵母粉和0.1％的干酪素。

上述基本无机盐培养基的配方为：

每1000ml蒸馏水中添加：葡萄糖20g、蛋白胨1g、酵母粉1g、KCl 0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、NaNO₃ 2g、FeSO₄·7H₂O 0.02g、K₂HPO₄ 1g。

实施例2：腐皮镰孢菌突变株(Fusarium solani mut.hydrochitosans)Fs107 CGMCCNo.1720菌株的形态学特性。

经过形态学观察的特征为：该菌在PDA平皿上4天的生长直径约为4.2cm，气生菌丝绒毛状，褐白色、菌落反面淡褐色或浅红色，分生孢子有大小两型。大型分生孢子无色，镰刀形，有3～4个隔膜，大小30～50μm×4.6μm；小型分生孢子长椭圆形或圆柱形，串生，无色有1-2个隔膜，很少或不产生；厚垣孢子球形或卵圆形，表面光滑或粗糙，顶生或间生，单生或双生，大小8～10μm×7.0～9.5μm。

根据形态学观察，筛选到的本发明所述产壳聚糖酶的菌株确定为镰孢霉属的菌株。

实验比较结果，其产酶活性比诱变前的出发菌株要高很多(约15mU/ml)，因而这种高产壳聚糖酶的腐皮镰孢菌属于腐皮镰孢菌突变株。

实施例3：利用腐皮镰孢菌突变株(Fusarium solani mut.hydrochitosans)Fs107 CGMCCNo.1720制备壳寡糖。其中发酵温度为20℃

(1)菌种选择：腐皮镰孢菌突变株(Fusarium solani mut.hydrochitosans)Fs107CGMCC No.1720；

(2)斜面培养：将菌种接种于土豆培养基，其中添加质量体积比为1.6％的琼脂，20℃条件下，静止培养72小时；

(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于200ml含有质量体积比2％的葡萄糖，0.1％蛋白胨，0.1％酵母粉，pH值为5.6的基本无机盐培养基中，20℃条件下，振荡培养48小时，制得种子液；

(4)扩大培养：以5％的体积比的接种量将种子液接种于400ml含有质量体积比为2％的葡萄糖，0.1％蛋白胨，0.1％酵母粉，0.1％干酪素，pH值为5.6的基本无机盐培养基中，20℃条件下，振荡培养72小时；

(5)收集发酵粗酶液：将步骤(4)所得的发酵液过滤除菌体，收集除菌体后的发酵液，即为壳聚糖酶粗酶液；

(6)酶解底物：将步骤(5)所得的壳聚糖酶粗酶液加水适度稀释至酶活为50mu/ml，加入壳聚糖底物，使底物终浓度质量体积比为1％，于54℃，pH值为5.4条件下，反应4小时，制得壳寡糖溶液粗产品；

(7)分离产物：将步骤(6)所得壳寡糖溶液粗产品，于真空旋转蒸发仪中蒸发除去水分，烘干，得壳寡糖产物。

实施例4：利用腐皮镰孢菌突变株(Fusarium solani mut.hydrochitosans)Fs107 CGMCCNo.1720制备壳寡糖。其中发酵温度为25℃

(1)菌种选择：腐皮镰孢菌突变株(Fusarium solani mut.hydrochitosans)Fs107CGMCC No.1720；

(2)斜面培养：将菌种接种于土豆培养基，其中添加质量体积比为1.6％的琼脂，25℃条件下，静止培养72小时；

(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于200ml含有质量体积比2％的葡萄糖，0.1％蛋白胨，0.1％酵母粉，pH值为5.6的基本无机盐培养基中，25℃条件下，振荡培养48小时，制得种子液；

(4)扩大培养：以7％的体积比的接种量将种子液接种于1000ml含有质量体积比为2％的葡萄糖，0.1％蛋白胨，0.1％酵母粉，0.1％干酪素，pH值为5.6的基本无机盐培养基中，25℃条件下，振荡培养72小时；

(5)收集发酵粗酶液：将步骤(4)所得的发酵液过滤除菌体，收集除菌体后的发酵液，即为壳聚糖酶粗酶液；

(6)酶解底物：将步骤(5)所得的壳聚糖酶粗酶液加水适度稀释至酶活为50mu/ml，加入壳聚糖底物，使底物终浓度质量体积比为1.5％，于54℃，pH值为5.4条件下，反应6小时，制得壳寡糖溶液粗产品；

(7)分离产物：将步骤(6)所得壳寡糖溶液粗产品，于真空旋转蒸发仪中蒸发除去水分，烘干，得壳寡糖产物。所得壳寡糖产物的薄层层析图如图1所示。

实施例5：利用腐皮镰孢菌突变株(Fusarium solani mut.hydrochitosans)Fs107 CGMCCNo.1720制备壳寡糖。其中发酵温度为30℃

(1)菌种选择：腐皮镰孢菌突变株(Fusarium solani mut.hydrochitosans)Fs107CGMCC No.1720；

(2)斜面培养：将菌种接种于土豆培养基，其中添加质量体积比为1.6％的琼脂，30℃条件下，静止培养72小时；

(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于200ml含有质量体积比2％的葡萄糖，0.1％蛋白胨，0.1％酵母粉，pH值为5.6的基本无机盐培养基中，30℃条件下，振荡培养48小时，制得种子液；

(4)扩大培养：以5％的体积比的接种量将种子液接种于3000ml含有质量体积比为2％的葡萄糖，0.1％蛋白胨，0.1％酵母粉，0.1％干酪素，pH值为5.6的基本无机盐培养基中，培养温度30℃，通气量2.0vvm条件下，搅拌培养72小时；

(5)收集发酵粗酶液：将步骤(4)所得的发酵液过滤除菌体，收集除菌体后的发酵液，即为壳聚糖酶粗酶液；

(6)酶解底物：将步骤(5)所得的壳聚糖酶粗酶液加水适度稀释至酶活为50mu/ml，加入壳聚糖底物，使底物终浓度质量体积比为2.0％，于56℃，pH值为5.6条件下，反应8小时，制得壳寡糖溶液粗产品；

(7)分离产物：将步骤(6)所得壳寡糖溶液粗产品，于真空旋转蒸发仪中蒸发除去水分，烘干，得壳寡糖产物。