一种伏马菌素B1的薄层层析测定方法

摘要

伏马菌素B1的测定方法：准确吸取2mL 1∶1的乙腈－水的混合液加入1mg伏马菌素B1标准品中，使之溶解，该标准溶液为0.5mg/mL，依次逐级配制成每毫升相当于100μg，50μg，25μg，5μg，1μg的标准样；样品加甲醇－水溶液，振荡，离心取上清液水浴蒸发近干，再用甲醇溶解，定容再离心得上清液，用活化SAX柱子过柱，洗柱后用冰乙酸－甲醇洗脱伏为样品液；在硅胶F254或HSG板上用25μg/mL的标准液和样品液点样，点样量为5μL，用体积比为55∶36∶8∶1氯仿∶甲醇∶水∶乙酸混合液展开，以香草醛液显色；与标准品斑点同一Rf值处出现色斑点，鉴定其为伏马菌素B1。

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种真菌产生的毒素的分析测试技术，特别是对饲料、食品，尤其是玉米污染的毒素分析测试技术。

背景技术

伏马菌素是一组主要由串珠镰刀菌产生的真菌毒素，迄今为止，已发现的伏马菌素相关组分包括：FB1、FB2、FB3、FB4；FA1和FA2(分别为FB1、FB2的N-乙酰基衍生物)；FBS的水解产物，FC1、FC2、FC3、FC4和FP1。它们在世界范围内污染饲料和食品，尤其是玉米。伏马菌素毒性大而且在世界范围内分布广泛，它们在食品安全中的意义，已经引起越来越多的关注。国际癌症研究机构已将镰刀菌毒素列为2B类物质，可能的致癌物质。

伏马菌素可引起马脑白质软化症(equine leukoencephalomalacia，ELEM)，用伏马菌素饲料喂马，脑部病理学检查发现有明显的肝病样改变和延髓髓质水肿；引起猪的肺水肿病(porcine pulmonary oedema，PPE)，使猪的胰腺发生病变，肝脏和肺部严重损伤。猪摄入含有伏马菌素的饲科后，最典型的病变为胸膜腔积水和肺水肿，并伴有胰脏和肝脏损伤；对鸡胚具有致病性和致死性，早期鸡胚变化包括脑积水、啄大、颈长，病理改变包括肝、肾、心、肺、肌肉骨骼系统和肠等；对大鼠具有肾脏损伤，包括细胞增生、变性和细胞程序性死亡。在对怀孕大鼠的影响研究中发现，FB1无致畸作用。但可引起母鼠神情淡漠、食欲不振、消瘦、吞食仔鼠、甚至死亡，并使胎仔产前死亡数增加、体重减轻、顶臀长度变短、脑水肿和骨骼异常发生率增加，仔鼠毒性可能与母鼠毒性有关。组织学检查显示肝肾病变，并出现肝细胞质改变和个别肝细胞坏死。

关于伏马菌素B1的检测国外已建立了多种方法，已报道的方法主要有：酶联免疫(ELISA)、高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-质谱联用(LC-MS)、薄层色谱(TLC)、气相色谱(GC)和毛细管电泳。迄今被AOAC(Association ofOfficial Analytical Chemists)接纳为其公定方法的伏马菌素检测方法只有一个，即“液相色谱测定玉米中伏马菌素B1，B2，B3”。

目前国内尚没有成形的薄层层析法检测伏马菌素B1。在伏马菌素的众多检测方法中，国外学者多采用HPLC和LC-MS，这些方法需要昂贵精密的仪器设备，而我国幅员辽阔，各地区经济发展不平衡，大部分基层实验室根本不具备这些条件，使这些方法的推广应用受到限制。薄层层析分析法，方法简单易行，检测成本低廉，适于我国具体国情。

发明内容

本发明的目的在于提供一种既简单易行又经济可靠的测试伏马菌素B1方法。

本发明的技术方案为：

(1)制作标准溶液：准确吸取2mL乙腈-水(1∶1，V/V)的混合溶液加入1mg伏马菌素B1标准品中，轻轻振摇，使之溶解，避光，置于-4℃冰箱保存。该标准溶液为0.5mg/mL。准确吸取0.2mL标准溶液于1mL离心管中，加乙腈-水(1∶1，V/V)混合液至刻度，混匀。此溶液每毫升相当于100μg伏马菌素B1；按此法逐级配制成每毫升相当于50μg，25μg，5μg，1μg；

(2)制作样品溶液：称取50g粉碎并通过120目筛的样品，置于250mL具塞锥形瓶中，加入100mL甲醇-水(3∶1，V/V)混合溶液，在瓶塞上涂上一层水，盖严防漏。振荡30min后，离心混合液(3000r/min，10min)，取上清液50mL，于40～60℃水浴蒸发近干，用甲醇溶解，定容至5mL，3000r/min离心10min，过滤得上清液。将SAX柱安装到铁架台上，依次用5mL甲醇、5mL甲醇-水(3∶1，V/V)活化柱子；取3mL滤液过柱(流速≤2mL/min)，然后依次用5mL甲醇-水(3∶1，V/V)、3mL甲醇洗柱，不要让柱子干。用3mL冰乙酸-甲醇(1∶99，V/V)洗脱伏马菌素(流速≤1mL/min，应特别注意控制)，洗脱液收集于5mL离心管中，作为玉米样品分析液；

(3)测试：可在两种硅胶板上测试：①在硅胶HSG板上，点样，点样量为5μL，用氯仿∶甲醇∶水∶乙酸(55∶36∶8∶1)作展开剂，展开后FB1的Rf值为0.53。用香草醛溶液作为显色剂，显色后，伏马菌素FB1(以下简称FB1)的斑点呈淡灰色～紫红色，检出限为5μg/mL，5μL，即25ng；②在硅胶F254板上，点样，点样量为5μL，用氯仿∶甲醇∶水∶乙酸(55∶36∶8∶1)展开后，FB1的Rf值为0.39。用香草醛溶液作为显色剂，显色后，FB1的斑点呈淡灰色～兰紫色，检出限为1μg/mL，5μL，也就是5ng。标准样和分析样同时点样，可测试样品是否含有FB1。

本发明所述的香草醛溶液为1％香草醛硫酸乙醇溶液，制备方法为：在烧杯中加入19mL无水乙醇，小心量取1mL浓硫酸沿杯壁缓缓倒入，边加边搅拌，待烧杯放凉后，称取0.2g香草醛溶于此乙醇溶液中，置棕色瓶中避光保存。使用时需临用现配。

本发明所述的显色过程为：将显色剂喷于板上，立即挥干(可用电吹风)。

目前国内尚没有成形的薄层层析法检测伏马菌素B1。在伏马菌素的众多检测方法中，国外学者多采用HPLC和LC-MS，这些方法需要昂贵的精密仪器，而我国大部分基层实验室根本不具备这些条件，使这些方法的推广应用受到限制。薄层层析法与其相比，虽然精密度以及最低检测限不如采用HPLC等方法，但是薄层层析方法无需精密仪器设备，可以准确检测出各种粮食食品中的伏马菌素B1的存在，既简单易行又经济可靠。经过大量的与HPLC方法对比实验，薄层层析法检测结果与HPLC检测结果相一致，可知对于粮食食品中的伏马菌素B1检测，薄层层析法的准确度和可靠性良好。

具体实施方式

实施例1

标准溶液配制及在两种硅胶板上测试：

①准确吸取2mL乙腈-水(1∶1，V/V)的混合溶液加入1mg伏马菌素B1(北京百灵威公司)标准品中，轻轻振摇，使之溶解，避光，置于-4℃冰箱保存。该标准溶液为0.5mg/mL。

②准确吸取0.2mL标准溶液(0.5mg/mL)于1mL离心管中，加乙腈-水(1∶1，V/V)混合液至刻度，混匀。此溶液每毫升相当于100μg伏马菌素B1。

③准确吸取0.5mL此稀释液于1mL离心管中，加乙腈-水(1∶1，V/V)混合液至刻度，混匀。此溶液每毫升相当于50μg伏马菌素B1。

④准确吸取0.3mL伏马菌素B1标准溶液(50μg/mL)，置于1mL离心管中，加乙腈-水(1∶1，V/V)混合液0.3mL，混匀。此溶液每毫升相当于25μg伏马菌素B1。

⑤准确吸取0.1mL伏马菌素B1标准溶液(25μg/mL)，置于1mL离心管中，加乙腈-水(1∶1，V/V)混合液0.4mL，混匀。此溶液每毫升相当于5μg伏马菌素B1。

⑥准确吸取0.1mL伏马菌素B1标准溶液(5μg/mL)，置于1mL离心管中，加乙腈-水(1∶1，V/V)混合液0.4mL，混匀。此溶液每毫升相当于1μg伏马菌素B1。

⑦在硅胶HSG、F254板上点样、展开、显色，结果如表1、表2所示：

                  表1 HSG香草醛显色结果

  点样浓度  点样量  斑点颜色  斑点清晰度  5μg/mL  5μg/mL  5μg/mL  5μg/mL  5μg/mL  5μg/mL  5μg/mL  15μL  10μL  5μL  4μL  3μL  2μL  1μL  紫红色  紫红色  淡紫红色  淡灰色  无  无  无  ++++  +++  ++  +  -  -  -

在硅胶HSG上，香草醛的显色效果较好，色差明显，检出限低，可达到5μg/mL ，5μL，也就是25ng，用氯仿∶甲醇∶水∶乙酸(55∶36∶8∶1)展开后，FB1的Rf值为0.53，斑点呈淡灰色～紫红色。

                表2 F254香草醛的显色结果

  点样浓度  点样量  斑点颜色  斑点清晰度  1μg/mL  1μg/mL  1μg/mL  1μg/mL  1μg/mL  5μL  4μL  3μL  2μL  1μL  兰紫色  淡灰色  淡灰色  无  无  ++  +  +  -  -

在薄板F254上，用香草醛显色的检出限为1μg/mL，5μL，也就是5ng。在硅胶F254上，用氯仿∶甲醇∶水∶乙酸(55∶36∶8∶1)展开后，FB1的Rf值为0.39，斑点呈淡灰色～兰紫色。

实施例2

称取50g粉碎过120目筛的玉米样品，置于250mL具塞锥形瓶中，加入100mL甲醇-水(3∶1，V/V)混合溶液，在瓶塞上涂上一层水，盖严防漏。振荡30min后，离心混合液(3000r/min，10min)，取上清液50mL，用旋转蒸发器于45～55℃水浴蒸发近干，用甲醇溶解，定容至5mL，3000r/min离心10min，过滤上清液。

将SAX柱安装到铁架台上，依次用5mL甲醇，5mL甲醇-水(3∶1，V/V)活化柱子，取3mL滤液过柱(流速≤2mL/min)，然后依次用5mL甲醇-水(3∶1，V/V)，3mL甲醇洗柱，不要让柱子干。用3mL冰乙酸-甲醇(1∶99，V/V)洗脱伏马菌素(流速≤1mL/min，应特别注意控制)，洗脱液收集于5mL离心管中，作为玉米样品分析液，进行薄层分析。

取薄层板F254，用FB1标准使用液(25μg/mL)和玉米样品分析液点样，点样量为5μL，用氯仿∶甲醇∶水∶乙酸(55∶36∶8∶1)展开，喷以香草醛显色。

结果表明，与标准品斑点同一Rf值处，出现淡灰色的斑点鉴定其为伏马菌素B1。

实施例3

称取50g粉碎过120目筛的花生样品，置于250mL具塞锥形瓶中，加入100mL甲醇-水(3∶1，V/V)混合溶液，在瓶塞上涂上一层水，盖严防漏。振荡30min后，离心混合液(3000r/min，10min)，取上清液50mL，用旋转蒸发器于45～55℃水浴蒸发近干，用甲醇溶解，定容至5mL，3000r/min离心10min，过滤上清液。

将SAX柱安装到铁架台上，依次用5mL甲醇，5mL甲醇-水(3∶1，V/V)活化柱子，取3mL滤液过柱(流速≤2mL/min)，然后依次用5mL甲醇-水(3∶1，V/V)，3mL甲醇洗柱，不要让柱子于。用3mL冰乙酸-甲醇(1∶99，V/V)洗脱伏马菌素(流速≤1mL/min，应特别注意控制)，洗脱液收集于5mL离心管中，作为玉米样品分析液，进行薄层分析。

取薄层板F254，用FB1标准使用液(25μg/mL)和花生样品分析液点样，点样量为5μL，用氯仿∶甲醇∶水∶乙酸(55∶36∶8∶1)展开，喷以香草醛显色。

结果表明，与标准品斑点同一Rf值处，出现淡灰色的斑点，鉴定其为伏马菌素B1。

实施例4

称取50g粉碎过120目筛的玉米样品，置于250mL具塞锥形瓶中，加入100mL甲醇-水(3∶1，V/V)混合溶液，在瓶塞上涂上一层水，盖严防漏。振荡30min后，离心混合液(3000r/min，10min)，取上清液50mL，用旋转蒸发器于45～55℃水浴蒸发近干，用甲醇溶解，定容至5mL，3000r/min离心10min，过滤上清液。

将SAX柱安装到铁架台上，依次用5mL甲醇，5mL甲醇-水(3∶1，V/V)活化柱子，取3mL滤液过柱(流速≤2mL/min)，然后依次用5mL甲醇-水(3∶1，V/V)，3mL甲醇洗柱，不要让柱子干。用3mL冰乙酸-甲醇(1∶99，V/V)洗脱伏马菌素(流速≤1mL/min，应特别注意控制)，洗脱液收集于5mL离心管中，作为玉米样品分析液，进行薄层分析。

取薄层板HSG，用FB1标准使用液(25μg/mL)和玉米样品分析液点样，点样量为5μL，用氯仿∶甲醇∶水∶乙酸(55∶36∶8∶1)展开，喷以香草醛显色。

结果表明，与标准品斑点同一Rf值处，出现淡灰色的斑点，鉴定其为伏马菌素B1。

实施例5

称取50g粉碎过120目筛的花生样品，置于250mL具塞锥形瓶中，加入100mL甲醇-水(3∶1，V/V)混合溶液，在瓶塞上涂上一层水，盖严防漏。振荡30min后，离心混合液(3000r/min，10min)，取上清液50mL，用旋转蒸发器于45～55℃水浴蒸发近干，用甲醇溶解，定容至5mL，3000r/min离心10min，过滤上清液。

将SAX柱安装到铁架台上，依次用5mL甲醇，5mL甲醇-水(3∶1，V/V)活化柱子，取3mL滤液过柱(流速≤2mL/min)，然后依次用5mL甲醇-水(3∶1，V/V)，3mL甲醇洗柱，不要让柱子干。用3mL冰乙酸-甲醇(1∶99，V/V)洗脱伏马菌素(流速≤1mL/min，应特别注意控制)，洗脱液收集于5mL离心管中，作为花生样品分析液，进行薄层分析。

取薄层板HSG，用FB1标准使用液(25μg/mL)和花生样品分析液点样，点样量为5μL，用氯仿∶甲醇∶水∶乙酸(55∶36∶8∶1)展开，喷以香草醛显色。

结果表明，与标准品斑点同一Rf值处，出现淡灰色的斑点，鉴定其为伏马菌素B1。