一种快速检测食品、农副产品中兽药残留物的检测方法

摘要

本发明提供了一种检测农副产品、食品中兽药残留物的检测方法，属有毒物质检测的技术领域。本快速检测食品、农副产品中兽药残留物的检测方法包括以下步骤：将多种兽药偶联抗原按照微阵列点在固相载体上并对其进行包被；其中固相基质上固定着兽药抗原；将经过稀释液稀释的生物素化抗体和待测样品混合，与固相载体上固定的多种兽药包被抗原的进行竞争免疫反应，洗涤液洗涤；加入亲和素标记的胶体金进行放大和染色，通过扫描仪获得灰度结果。本发明采用免疫竞争法检测与现有技术的检测相比，主要具有灵敏度高、特异性强、操作简便的特点。免疫竞争法检测所需试剂品种少，加样程序简单、反应时间短；同时，测量和数据处理易于实现自动化。

说明书

技术领域

本发明属有毒物质检测的技术领域，尤其涉及一种检测农副产品、食品中兽药残留物的检测方法。

背景技术

我国是农产品生产和消费大国，农产品中兽药残留物的检测直接关系到我国农产品生产、出口和居民食品消费安全。特别是我国农产品出口因兽药残留物近年连续遭遇国外技术性贸易壁垒，仅浙江省农产品一年出口被禁上亿美元。近年来，食品安全问题已成为国家关注的重点内容之一，因有毒残留物质超标造成的食品污染事件以及出口受阻频频发生，已引起了国家有关部门的高度重视，并连续启动了无公害农产品及食品安全等行动计划以及农产品市场准入制度，研制开发食品中各种有害物质的快速检测技术及产品成为很重要的需求。

检测食品中兽药残留的方法，主要有微生物学方法，理化分析法(色谱法，色质联用、气质联用法)，免疫学方法(放射免疫法、酶联免疫法)等。微生物检测方法费用低廉，但是操作复杂费时，结果容易误判，特异性差。免疫学方法(酶免法)近年来有较多的应用，基本符合操作简便、高灵敏度的特点，且已经有相关的试剂盒商品使用。理化分析方法主要用来确证实验，需要昂贵的仪器配套。如中国专利申请(01105023.3)该专利申请涉及一种多指标并行检测蛋白的方法，包括：将结合了多个可与体内指标特异性结合的蛋白B的固相载体与含目标蛋白A的待测液接触，形成稳定复合物B-A；进一步与多蛋白混合液中对应标记的A的特异结合蛋白C-labelled反应，形成稳定B-A-C-labelled，标记是化学发光法的标记物；产生化学发光反应及信号检测。该专利申请还提供了一种蛋白芯片的制备方法，及用于多指标并行检测的蛋白芯片、试剂盒。该专利申请主要是沿用酶联免疫吸附测定(ELISA)的原理，存在着特异性弱、灵敏度低、应用范围窄、操作复杂的缺点。

又如中国专利申请(02137940.8)涉及一种氯霉素(CAP)酶免疫检测试剂盒及其检测方法，属于酶免疫分析技术领域。该发明配制的试剂盒，采取酶免疫吸附(ELISA)竞争法检测CAP，利用CAP和牛血清白蛋白(BSA)偶连物作为CAP抗原免疫小鼠，获得含有CAP抗体的单克隆CAP抗血清，经分离、提纯、稀释后包被在酶标板上，温育、洗涤，加入样品稀释液及酶标抗原，使两者进行反应、洗涤，加酶底物显色。虽然该专利对样品前处理简单，是一种简便、快速、灵敏、准确、廉价的检测方法，但是由于本身的局限性必然造成其检测分析过程不能实现连续化、集成化、微型化、高通量的要求。

发明内容

本发明针对现有技术所用的检测方法存在特异性差、灵敏度低、应用范围窄、操作复杂的缺点，提供一种样品前处理简单，检测简便、快速、灵敏、准确的检测兽药残留的方法。

本发明的技术问题是通过以下技术方案来解决的：一种快速检测食品、农副产品中兽药残留物的检测方法，包括以下步骤：

(1)、将多种兽药偶联抗原按照微阵列点在固相载体上并对其进行包被；其中固相基质上固定着兽药抗原；

(2)、将经过稀释液稀释的生物素化抗体和待测样品混合，与固相载体上固定的多种兽药包被抗原的进行竞争免疫反应，洗涤液洗涤；反应过程中如果待测样品不含兽药，则抗体和固相载体上固定的多种兽药包被抗原结合；如果待测样品含兽药，则生物素标记的抗体会与待测样品中的兽药结合，而被洗脱；

(3)、加入亲和素标记的胶体金进行放大和染色，通过扫描仪获得灰度结果。

本发明采用免疫竞争法的原理：采用免疫竞争法检测多种兽药残留，其工作原理是利用样品中的残留兽药与固定在载体上的兽药偶联抗原针对抗体进行竞争免疫反应，通过生物素一亲和素放大系统并通过纳米金染色对极微量的残留兽药作定量分析，其中被测的残留兽药与固定在基质上的抗生素对标有生物素的抗体均具有相同的结合能力，所以在标有生物素的抗体有限时，这种结合就会出现相互竞争，彼此制约。具体反应式如下：

在标有生物素的抗体量一定时，固定在基质上的兽药和被测的残留兽药与标有生物素的抗体结合的量取决于二者浓度比，P1结合量，将随着P2的增加而减少，这说明了被测的残留兽药抑制了固定在基质上的兽药与标有生物素的抗体的结合。由于抗体上标记有生物素，可与亲和素结合，亲和素上有胶体金，通过扫描仪(CCD)获得灰度结果。图像越黑则待测样品的抗生素含量越低，反之，则越高！

此外，还可以得到定量检测的效果，其中通过标准样本来考察三个指标的剂量-反应曲线，并采用合适的数学模型拟合。浓度与灰度值之间的关系符合y＝a(x)b+c或者其他函数的模式，其中y和x分别表示指标输出浓度和检测灰度，a和b，c是常数，不同指标有各自的a、b值。剂量-反应曲线的相关系数g2应不低于0.97，将上述剂量-反应曲线方程、种类、指标数量、指标信息等基本参数，设置在软件的数据库文件中，用光盘刻录机将该文件刻录在光盘上。检测时，数据通过光盘由软件自动调用，通过灰度即可知道浓度值，定量检测抗生素浓度，实现了检测分析过程连续化、集成化、微型化、高通量的优点，而且检测操作只需要10分钟，胶体金结果比较荧光稳定，减少环境污染。

在上述的检测方法中，所述的经过稀释液稀释的生物素化抗体与样本的混合比例为2∶5～1∶6，其中经过稀释液稀释的生物素化抗体与样本混合后发应的时间为5～20min，反应的温度为30℃～38℃。

表1：生物素化抗体与样本混合比例的优化

  生物  素化抗体  与样本的  混合比例  通过质  谱分析抗生  素标准液的  含量(ppb)  固相载体中包被抗原浓度(mg/ml)  0.2  0.4  0.6  1∶1  0  1.191  1.313  1.444  1.207  1.33  1.429  平均  1.199  1.322  1.437  6.25  1.367  1.611  1.752  1.286  1.5  1.701  平均  1.327  1.556  1.727  2∶5  0  1.246  1.437  1.435  1.302  1.484  1.496  平均  1.274  1.461  1.465  6.25  1.12  1.33  1.536  1.189  1.322  1.634  平均  1.154  1.326  1.585  1∶3  0  1.265  1.567  1.678  1.325  1.532  1.693  平均  1.345  1.550  1.686  6.25  1.158  1.274  1.387  1.124  1.212  1.313  平均  1.141  1.243  1.350  1∶4  0  1.403  1.62  1.686  1.303  1.555  1.659  平均  1.303  1.555  1.673  6.25  1.097  1.179  1.234  1.058  1.136  1.193  平均  1.078  1.158  1.214  1∶5  0  1.413  1.664  1.718  1.314  1.51  1.628  平均  1.364  1.587  1.673  6.25  1.078  1.137  1.187  1.029  1.06  1.131  平均  1.054  1.099  1.159  1∶6  0  1.301  1.471  1.625  1.286  1.437  1.551  平均  1.294  1.454  1.588  6.25  1.034  1.004  1.101  1.05  1.08  1.146  平均  1.042  1.062  1.124

由以上结果表明，0ppb和6.25ppb的反应结果灰度差异明显的为生物素化抗体与样本混合比例为2∶5～1∶6。

表2：生物素化抗体与样本混合后的反应时间对灰度的影响

  37度  反应时间  (min)  通过  质谱分析  抗生素标  准液的含  量(ppb)  固相载体中包被抗原浓度(mg/ml)  0.2  0.4  0.6  0  0  1.23  1.453  1.518  1.265  1.47  1.619  平均  1.248  1.462  1.569  3  1.175  1.311  1.439  1.193  1.342  1.437  平均  1.184  1.327  1.438  5  0  1.37  1.661  1.779  1.379  1.52  1.713  平均  1.375  1.591  1.746  3  1.267  1.431  1.571  1.191  1.407  1.537  平均  1.229  1.419  1.554  10  0  1.332  1.624  1.746  1.397  1.638  1.876  平均  1.365  1.631  1.811  3  1.262  1.447  1.587  1.206  1.387  1.567  平均  1.234  1.417  1.577  20  0  1.45  1.663  1.817  1.454  1.726  1.761  平均  1.452  1.695  1.789  3  1.261  1.478  1.617  1.22  1.427  1.608  平均  1.241  1.453  1.613

以上结果表明：在5～20min之间整体的灰度值差异不太大，所以采用的温育5～20min，采用的温育温度一般为37℃。但是在30℃～38℃之间处理整体的灰度值差异也不大。

其中所述的经过稀释液稀释的生物素化抗体的标记方法为：用DMF将BNHS配成0.8～1.2mg/mL溶液，用0.08～0.12mol/L，pH8.2～9.2NaHCO3将纯化的抗体稀释为1～3mg/mL，按BNHS∶IgG的容积比为1∶8～1∶15混合，室温搅拌下反应1～5h，装入透析袋，加入0.01mol/L～1mol/L，pH7.0～7.6PBS溶液，4℃透析过夜。结合物内加等体积甘油，小量分装，-30℃冻存备用。

在上述的检测方法中，所述的生物素化抗体的标记方法优化配方为：用DMF将BNHS配成1mg/mL溶液，用0.1mol/L，pH9.0NaHCO3将纯化的抗体稀释为2mg/mL，按BNHS∶IgG的容积比为1∶10，室温搅拌下反应2～4h，装入透析袋，加入0.05mol/L，pH7.2PBS溶液，4℃透析过夜。

其中亲和素标记方法(样品洗涤液配方)为：

①用0.08～0.12mol/L碳酸盐调节金溶胶的pH为8.5～9.5；

②于金溶胶中加入(按体积百分比)为1％～4％蛋白质溶液，搅拌1～4分钟；

③加入(按体积百分比)4.5％～5.5％的浓度为0.8～1.2％PEG20000溶液；

④于转速为10000g～100000g的超速离心机中离心30～60分钟，吸去上清液；

⑤将沉淀悬浮于含0.2～0.5mg/ml PEG20000的缓冲液中，转速为10000g～100000g的超速离心机离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，浓度以A 1cm/540nm＝1.5左右为宜，以0.2～0.8mg/ml叠氮钠防腐，置4℃保存。

在上述的检测方法中，所述的亲和素标记方法步骤一中碳酸盐为碳酸钾。

在上述的检测方法中，所述的亲和素标记方法步骤一为：用0.08mol/L～0.12mol/L K₂CO₃调节金溶胶pH至8.8～9.2。

在上述的检测方法中，在金溶胶中加入最佳标记量的蛋白质溶液按体积百分比为2％～3％，搅拌2～3分钟。

在上述的检测方法中，加入的PEG20000溶液为总体积的4.8％～5.2％，其浓度为1％。

在上述的检测方法中，将沉淀悬浮于一定体积含0.2～0.3mg/ml PEG20000的缓冲液中，转速为10000g～100000g的超速离心机离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，浓度以A1cm/540nm＝1.5为宜，以0.3～0.6mg/ml叠氮钠防腐，置4℃保存。

本发明采用免疫竞争法检测与现有技术的检测相比，主要有以下优点：(1)灵敏度高，现有技术检出极限为mg，ug水平，而采用免疫竞争法检测分析通常为ng，pg，甚至可达到ag水平；(2)特异性强，能分辨出化学结构上非常相似的物质，甚至能识别立体结构；(3)操作简便，免疫竞争法检测所需试剂品种少，加样程序简单，反应时间短，测量和数据处理易于实现自动化。

具体实施方式

实施例1

蜂蜜样品的前处理：取1g蜂蜜，放入离心管中，加入2mL蒸馏水溶解；加2mL乙酸乙酯振荡10min；室温3000g离心10min；移取1mL上层乙酸乙酯(相当于0.5g样品)至另一试管中，60℃下N2吹干；残留物用0.5mL缓冲液1溶解；取50uL分析。过的样品，放入离心管中，加入6mL乙酸乙酯振荡10min；室温3000g离心10min；取出2mL上层乙酸乙酯(相当于1g样品)60℃下N2吹干。

洗涤液的配制：Tris54g，硼酸27.5g，用少量DD-H20溶解，加入20ml 0.5mol/L EDTA-Na2(PH8.0)，加DD-H2O定容至1000ml。加入200ml饱和(NH4)2SO4溶液，40ml Tween-20及480ml DD-H2O，混匀。

试剂生物素化抗体的制备：取生物素1g，混悬于12mlN，N二甲基甲酰胺DMF，加入0.6g N-羟基丁二酰亚胺HOSU和0.8g的二环己基炭二亚胺DCC，置于密闭容器中，室温磁力搅拌作用过夜。过滤液经过过旋转蒸干。加10ml乙醚洗涤，继而加入200ml异丙醇结晶，获得白色粉末状活化生物素晶体。用DMF将BNHS配成0.8mg/mL溶液；将待标记抗体用0.08mol/L，PH值为8.2的碳酸氢钠溶液稀释至1mg/ml，透析后，以1mg/ml BNHS：待标记抗体＝1∶8的比例混合，不时振摇1小时。置透析袋中加入0.01mol/L，pH7.0PBS溶液，4℃透析过夜，使用时稀释至工作浓度。

试剂亲和素胶体金制备：①用0.08mol/L碳酸钾调节1ml胶体金溶液的pH为8.5；②将待标记的蛋白质储存液作系列稀释后，分别取0.1ml(含蛋白质5～40ug)加到1ml胶体金溶液中，搅拌1分钟；③加入(按体积百分比)4.5％的浓度为0.8％PEG20000溶液；④在转速为10000g的超速离心机中离心60分钟，吸去上清液；⑤将沉淀悬浮于含0.2mg/ml PEG20000的缓冲液中，转速为10000g的超速离心机离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，以0.2mg/ml叠氮钠防腐，置4℃保存。使用时另设一管不加蛋白质的对照管，5分钟后加入0.1ml 10％NaCl溶液，混匀后静置2小时，不稳定的金溶胶将发生聚沉，能使胶体金稳定的最适蛋白量再加10％即为最佳标记蛋白量。

取抗体浓度为5.94mg/ml，将抗体生物素化，生物素化抗体原浓度为1.67mg/ml，用PBS稀释液至0.02mg/ml，

取100ul生物素化抗体(0.02mg/ml)与500ul待测样品充分混匀后于30度温育20min，加入洗涤液4滴于上述包被有多种兽药偶联抗原按照微列阵排列的固相载体上，加入亲和素标记的胶体金溶液500ml，充分反应后，加入洗涤液六滴，通过扫描仪上读取结果，其中灰度值和兽药残留量的换算关系见表3

表3：灰度值和兽药残留量的换算关系

  通过质谱  分析抗生素标  准液的浓度  (ng/ml)  固相载体中包被抗原浓度(mg/ml)  0.2  0.4  0.6  0  0.3  0.27ng/ml  0.49  ng/ml  0.98  ng/ml  0.625  0.36ng/ml  0.61  ng/ml  0.86  ng/ml  1.25  2.17ng/ml  2.21  ng/ml  2.65  ng/ml  2.5  5.46ng/ml  6.02  5.81  ng/ml  ng/ml  5  8.80ng/ml  8.70  ng/ml  9.58  ng/ml  10  12.49  ng/ml  13.58  ng/ml  13.41  ng/ml

以上是本发明人通过长期研究而自制的灰度值和兽药残留量的换算关系，其中通过质谱分析抗生素标准液的浓度(ng/ml)与现有技术提供的标准液抗生素的含量相差无几。

实施例2：

样品的前处理和洗涤液的配制同实施例1

试剂生物素化抗体的制备：取生物素1g，混悬于12ml N，N二甲基甲酰胺DMF，加入0.6g N-羟基丁二酰亚胺HOSU和0.8g的二环己基炭二亚胺DCC，置于密闭容器中，室温磁力搅拌作用过夜。过滤液经过旋转蒸干。加10ml乙醚洗涤，继而加入200ml异丙醇结晶，获得白色粉末状活化生物素晶体。用DMF将BNHS配成1mg/mL溶液；将待标记抗体用0.10mol/L，PH值为9.0的碳酸氢钠溶液稀释至2mg/ml，透析后，以1mg/ml BNHS∶待标记抗体＝1∶10的比例混合，不时振摇3小时。置透析袋中加入0.05mol/L，pH7.4PBS溶液，4℃透析过夜，使用时稀释至工作浓度。

试剂亲和素胶体金制备：①用0.10mol/L碳酸钾调节1ml胶体金溶液的pH为9.0②将待标记的蛋白质储存液作系列稀释后，分别取0.2ml(含蛋白质5～40ug)加到1ml胶体金溶液中搅拌2分钟③加入(按体积百分比)5.0％的浓度为1％PEG20000溶液。④在转速为50000g的超速离心机中离心45分钟，吸去上清液。⑤将沉淀悬浮于含0.4mg/ml PEG20000的缓冲液中，转速为50000g的超速离心机离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，以0.4mg/ml叠氮钠防腐，置4℃保存。使用时另设一管不加蛋白质的对照管，5分钟后加入0.1ml 10％NaCl溶液，混匀后静置2小时，不稳定的金溶胶将发生聚沉，能使胶体金稳定的最适蛋白量再加10％即为最佳标记蛋白量。

取抗体浓度为6.54mg/ml，将抗体生物素化，生物素化抗体原浓度为1.76mg/ml，用PBS稀释液至0.04mg/ml，

取100ul生物素化抗体(0.02mg/ml)与600ul待测样品充分混匀后于37度温育10min，加入洗涤液4滴于上述包被有多种兽药偶联抗原按照微列阵排列的固相载体上，加入亲和素标记的胶体金溶液500ml，充分反应后，加入洗涤液六滴，通过扫描仪上读取结果。

实施例3

样品的前处理和洗涤液的配制同实施例1

试剂生物素化抗体的制备：取生物素1g，混悬于12mlN，N二甲基甲酰胺DMF，加入0.6g N-羟基丁二酰亚胺HOSU和0.8g的二环己基炭二亚胺DCC，置于密闭容器中，室温磁力搅拌作用过夜。过滤液经过过旋转蒸干。加10ml乙醚洗涤，继而加入200ml异丙醇结晶，获得白色粉末状活化生物素晶体。用DMF将BNHS配成1.2mg/mL溶液；将待标记抗体用0.12mol/L，PH值为9.2的碳酸氢钠溶液稀释至32mg/ml，透析后，以1mg/ml BNHS∶待标记抗体＝1∶15的比例混合，不时振摇5小时。置透析袋中加入0.1mol/L，pH7.6PBS溶液，4℃透析过夜，使用时稀释至工作浓度。

试剂亲和素胶体金制备：①用0.12mol/L碳酸钾调节1ml胶体金溶液的pH为9.5；②将待标记的蛋白质储存液作系列稀释后，分别取0.4ml(含蛋白质5～40ug)加到1ml胶体金溶液中搅拌4分钟；③加入(按体积百分比)5.5％的浓度为1.2％PEG20000溶液；④在转速为100000g的超速离心机中离心30分钟，吸去上清液；⑤将沉淀悬浮于含0.5mg/ml PEG20000的缓冲液中，转速为100000g的超速离心机离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，以0.8mg/ml叠氮钠防腐，置4℃保存。使用时另设一管不加蛋白质的对照管，5分钟后加入0.1ml 10％NaCl溶液，混匀后静置2小时，不稳定的金溶胶将发生聚沉，能使胶体金稳定的最适蛋白量再加10％即为最佳标记蛋白量。

取抗体浓度为6.74mg/ml，将抗体生物素化，生物素化抗体原浓度为1.78mg/ml，用PBS稀释液至0.03mg/ml，

取200ul生物素化抗体(0.02mg/ml)与500ul待测样品充分混匀后于38度温育5min，加入洗涤液4滴于上述包被有多种兽药偶联抗原按照微列阵排列的固相载体上，加入亲和素标记的胶体金溶液500ml，充分反应后，加入洗涤液六滴，通过扫描仪上读取结果。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越权利要求书所定义的范围。