一种活蝎蛋白液抗氧化活性组分制备方法及其应用

摘要

一种活蝎蛋白液抗氧化活性组分，通过对活蝎蛋白液用超滤法进行分离，提取出具有抗氧化活性的组分，并将此组分应用于肝脏疾病的治疗，疗效显著。此种制备方法简便，分离后的不同组分有不同性质，将其有针对性地进行应用，不但极大的节约了原料，而且极大地减小了药物的毒副作用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物制品领域，具体地说是涉及一种活蝎蛋白液抗氧化活性组分制备方法及其应用。

背景技术

蝎子又名全蝎、全虫，全世界共有600多种，我国有记录的达16种，其中东亚钳蝎分布最广。蝎子的药用，历代医药古籍均有记载，如始载于五代《蜀本草》称“主薄虫”。宋·《开宝本草》记载：“蝎出青州，形紧小者良。味甘、辛，性平、有毒。主治诸风疹及中风半身不遂、口眼歪斜、语涩、手足抽搐。”元·李果日：“蝎乃治风要药，俱宜为而用之。”

蝎子味甘、辛，性平、有毒。在医学的应用中虽然有一定的疗效，但同时也有一定的毒副作用。通过研究发现，蝎子真正的营养和药用价值在于蝎子体内的活性蛋白，其功效是传统全蝎药材的几十倍。全蝎入药较蝎活性蛋白利用率低，效果缓慢，而且全蝎入药某些有效成分得不到充分的利用，造成资源的浪费。另外，蝎蛋白能够去除蝎的毒性，使用更加安全可靠。

为了提高蝎子这一名贵药材的利用度，本公司已经发明了一种方法，从活蝎体内直接提取活性蛋白液(申请号：02121022.5)。该蛋白液我们称之为原液，原液是一种具有抗癫痫、抗氧化等药理学活性的主要成分为蛋白质的多组分混合物。

经动物试验证明，蝎活性蛋白中不同组分的作用和效果不同。

蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。盐析法容易引起蛋白质变性；层析和电泳通常用于分析而非制备，或样品经粗分级后，体积小，杂蛋白大部分己被除去，进一步提纯用；结晶是蛋白质分离提纯的最后步骤，只有在某种蛋白质在溶液中数量占优势时才能形成结晶；超速离心不但要求昂贵的设备，人为操作影响因素多，更要花上3、4天的时间，而且受离心容量的限制，不易放大规模。

目前，用全蝎配制的中成药已有30多种，如吉林制药厂生产的回春再造丸，武汉制药厂生产的大活络丸，以及“七珍丸”、“牵正散”、“止疼散”、“中风回春丸”等。随着医学研究的深入，还研制出新的用全蝎配制的中成药，如吴以岭用蝎子及蜈蚣、水蛭等为原料做成的中成药，在胃痛、关节性疾病上有良好的疗效基础上、在国内用其对冠心病进行治疗，临床结果表明：可逐渐减少或停用冠心病患者正在服用的硝酸甘油类药物，纠正缺血性心电图，并能抑制心律失常，解除胸闷、胸痛，心慌气短，乏力出汗等症状，可明显缩小脑血栓患者梗塞面积，恢复脑细胞的功能。但是蝎子，特别是蝎子蛋白用于治疗和预防肝脏疾病的情况未见报道。

发明内容

本发明的一个目的是针对蝎子活性蛋白液，克服现有技术中存在的不足之处，提供一种活蝎蛋白液抗氧化活性组分及制备方法。

发明的另一个目的是提供上述活蝎蛋白液抗氧化活性组分的应用。

为实现上述目的，本发明的一个技术方案提供了一种活蝎蛋白液抗氧化活性组分，该抗氧化活性组分是从中国专利02121022.5中所述的活蝎蛋白液中，提取出分子量低于10,000Da的组分。

在上述技术方案中，提取通过超滤来进行。

该活蝎蛋白液抗氧化活性组分制备方法主要步骤如下：

1.提取活蝎蛋白液；

2.分离出活性蛋白液中分子量低于10,000道尔顿的组分。

本发明活蝎蛋白液抗氧化活性组分制备方法的优选条件：操作温度控制在0～10℃。

本发明活蝎蛋白液抗氧化活性组分制备方法的更优选条件：操作温度控制在2～4℃。

活蝎蛋白液抗氧化活性组分制备方法，其步骤如下：

(1)、提取活蝎蛋白液；

(2)、分离出活性蛋白液中分子量低于10,000道尔顿的组分：控制操作温度在-5～15℃；

①将原液通过100,000MWCO超滤包；

②将得到的滤出液通过10,000MWCO超滤包；

将得到的分子量低于10,000的滤出液冷冻干燥。

提取活蝎蛋白液的方法：

①活蝎消毒：利用现有技术，对活蝎的腹部进行消毒杀菌；

②提取蛋白液：将针头插入位于活蝎腹部中间位置的体内蛋白囊内，抽出活蝎蛋白原液。

提取活蝎蛋白液的优选方法：

①活蝎消毒：采用擦拭消毒的方法，用消毒液对活蝎的腹部进行消毒杀菌；

②提取蛋白液：将小型注射器的针头插入位于活蝎腹部中间位置的体内蛋白囊内，抽出活蝎蛋白原液。

更进一步说明本发明活蝎蛋白液抗氧化活性组分的制备方法：

(1)、提取活蝎蛋白液；

①活蝎消毒：采用擦拭消毒的方法，将酒精含量大于50％的白酒擦在活蝎的腹部，进行消毒杀菌；

②提取蛋白液：将小型注射器的针头插入位于活蝎腹部第三腹节的中间位置的体内蛋白囊内，抽出活蝎蛋白原液；

(2)、分离：控制操作温度在-5～15℃分离蛋白液：

①将原液通过100,000MWCO超滤包，保留上部的大分子组分，冷冻干燥，留作他用。

②将得到的滤出液通过10,000MWCO超滤包，保留上部的大分子组分，冷冻干燥，留作他用。

③将得到的滤出液，冷冻干燥。

(3)、检测：抽样检测，所得组分的分子量小于10,000Da。

本发明还涉及以上制备的活蝎蛋白液抗氧化活性组分的应用：在治疗和预防肝脏疾病上的应用。

本发明一种活蝎蛋白液抗氧化活性组分具有很好的抗氧化性，可以直接作用在自由基，或是作用在铁和铜离子等，减少其与自由基发生进一步反应，通过抗脂质过氧化而提高肝细胞膜系统的稳定性，使肝细胞变性和坏死减轻，从而达到保护肝细胞减轻肝损伤的作用。

自由基的定义为“任何含有不成对电子而能单独存在的物质”，自由基与疾病的发生关系极为密切，自由基对许多疾病的致病性更是近年来极为热门的研究，目前较为确定与自由基有关的疾病，包括：肾脏病、动脉硬化、缺血性心脏病、器官移植、糖尿病、发炎性疾病、癌症、许多神经系统之疾病、高血压、败血症、急性外伤、眼睛疾病如白内障、药物毒性、许多肺部疾病、血液疾病等等。自由基的毒性在于其可攻击附近的分子造成细胞的死亡，其中最容易受到攻击的是细胞膜及脂蛋白中的多元不饱和脂肪酸，导致所谓的脂质过氧化(Lipid peroxidation)，细胞也可能因此而死亡。

抗氧化物之定义为“任何以低浓度存在就能有效抑制自由基之氧化反应之物质”，人体抗氧化能力低下，会引起早衰。氧应激/脂质过氧化引起细胞膜受损，是造成肝损伤的重要原因之一，是肝脏炎性损伤发展至纤维化的桥梁。保肝降酶药通过抗脂质过氧化而提高肝细胞膜系统的稳定性，使肝细胞变性和坏死减轻，从而达到保护肝细胞减轻肝损伤的作用。药物的抗氧化活性可以通过其保肝降酶的作用得到体现。

应用南京建成生物工程研究所生产的总抗氧化能力测试盒和超氧化物岐化酶(SOD)测试盒，初步检测分离产物的抗氧化活性和超氧化物岐化酶的活性。

    蛋白原液  0.074±0.002    5.6±0.03    ＞100,000Da  0.075±0.001    1.8±0.01    10,000Da～100,000Da  ——    ——    ＜10,000Da  6.94±0.03    22.5±0.03

检测后发现，分子量大于100,000Da的组分总抗氧化能力和超氧化物岐化酶的活性均处于较低水平，而10,000-100,000Da的组分没有检测到，只有分子量小于10,000Da的组分具有很强的抗氧化能力和超氧化物岐化酶的活性。

本发明一种活蝎蛋白液抗氧化活性组分应用于肝脏疾病的治疗：

经动物试验证明：MDA为脂质过氧化的最终产物，可严重破坏细胞膜结构，导致细胞肿胀、坏死。本发明一种活蝎蛋白液抗氧化活性组分对CCl₄造成的小鼠实验性肝损伤具有保护作用，能降低实验性肝损伤小鼠血清ALT和AST活性，而MDA的含量则显著降低。

本发明的有益效果在于：蝎活性蛋白中不同组分的作用和效果也有不同，通过对活蝎蛋白液用超滤法进行分离，提取出具有抗氧化活性的组分，并将此组分应用于肝脏疾病的治疗，疗效显著。此种制备方法简便，分离后的不同组分有不同性质，将其有针对性地进行应用，不但极大的节约了原料，而且极大地减小了药物的毒副作用。

超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，液体在一定压力下(氮气压或真空泵压)通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻保留，这是近年来发展起来的新方法，最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活性，回收率高。在超滤的过程中，虽然截流的大分子被浓缩，但是滤过的溶质分子仍保持初始的浓度。因此，整个过程中不会损失任何有效的成分。

冷冻干燥通过升华作用避免液态过程而实现干燥，在很大程度上保持了各个组份原有的生物活性。

下面结合动物实验对本发明的有益效果进行进一步说明：

本实验是为了观察本发明活蝎蛋白液抗氧化活性组分对实验性肝损伤的疗效，并与现有技术领域中常用的双虎清肝，维生素E进行对比而进行的试验。

(一).试验材料

受试药：蛋白原液                         编号：4A1-1；

        蝎蛋白液抗氧化活性组分           编号：4A1-2

测试药物4A1-1口服试剂，4A1-2口服试剂，4A1-2腹腔注射剂

配制方法：用生理盐水稀释。

阳性对照药

双虎清肝：北京华神制药有限公司产品，生产批号：030303E；

配制方法：用蒸馏水稀释，灌胃剂量为正常人剂量的10倍(8mg/0.3/只)。

维生素E：北京双鹤药业现代医药技术有限责任公司产品，生产批号：030602；

配制方法：用蒸馏水稀释，灌胃剂量为正常人剂量的10倍(0.1mg/0.3/只)。

实验动物

品种：ICR小鼠；动物级别：二级；动物合格证号：SLXK(京)2002-0001；

动物来源：购自北京大学医学部实验动物科学部提供。

用药剂量：

表1：抗氧化用药剂量：

低剂量(mg/只)中剂量(mg/只)高剂量(mg/只)    模型组蒸馏水0.3ml/只蒸馏水0.3ml/只蒸馏水0.3ml/只    双虎清肝组8mg/0.3ml/只8mg/0.3ml/只8mg/0.3ml/只    维生素E组0.1mg/0.3ml/只0.1mg/0.3ml/只0.1mg/0.3ml/只    SP-4A1-1灌胃18mg/0.3ml/只36mg/0.3ml/只72mg/0.3ml/只    SP-4A1-2灌胃5mg/0.3ml/只10mg/0.3ml/只20mg/0.3ml/只    SP-4A1-2腹腔注射5mg/0.3ml/只10mg/0.3ml/只20mg/0.3ml/只

模型制备：

除正常组外，其余各组分别腹腔注射0.5％CCl₄-橄榄油0.1ml/kg 1次，诱导产生小鼠急性肝损伤模型。

(二).实验结果及数据分析

造模型后36h将小鼠全部处死。处死前15h禁食，但不禁水，小鼠在末次给药后1h取眼球放血处死，分离血清后待测。同时取肝左叶用10％甲醛固定作病理切片。测定方法如下：

①肝功能检测血清丙氨酸转氨酶(alanine transaminase，ALT)，AST活性的测定采用ALT，AST测定试剂盒，在TRACE CB171自动生化分析仪上测定(日本岛津)。

②血清MDA含量的测定  用MDA测定试剂盒检测。

③肝病理组织学观察  取肝左叶同一部位作病理组织切片，用常规石蜡切片，H-E染色，观察肝组织的病理变化。

统计学处理组间比较采用t检验，实验数据用X±s表示

1.测试药物对血清ALT，AST活力变化的影响

小鼠在处死前36h腹腔注射CCl₄诱导小鼠急性肝损伤，并在小鼠末次给药后1h取眼球放血处死，分离血清，检测血清ALT和AST的活性。结果发现，四氯化碳(CCl₄)所致急性肝损伤小鼠血清ALT和AST的活性与正常对照组小鼠比较，ALT和AST的活性明显升高(P＜0.001)；双虎清肝和维生素E组阳性药对照组的ALT，AST活性分别与急性肝损伤模型组比较，降低明显(P＜0.001和P＜0.01)；三种测试药物大、中、小剂量组血清ALT和AST活性，分别较模型组降低明显，其中1-2腹腔注射组降低血清ALT和AST活性比其他组最明显(见表2和表3)。

表2测试药物对血清ALT(U％)活性的影响(n＝10，x±s)

组别  动物数                          大鼠血清ALT(U％)活性    大剂量    中剂量    小剂量  正常组    10    28.20±3.80    32.00±5.20    30.80±2.80  模型组    10    455.20±88.80#    622.70±128.5#    646.25±86.31#  双虎清肝组    10    369.60±29.12*    488.78±58.69*    543.44±37.28*  VE组    10    363.10±29.52*    506.00±81.00*    560.90±23.68*  1-1灌胃组    9    378.78±47.85    493.22±49.26*    556.78±28.15*  1-2灌胃组    9    350.00±57.40*    441.10±108.30*    535.00±52.80*  1-2腹腔注射组9332.11±27.63**436.44±72.62**510.67±84.52**

注：#模型组与正常对照组比较，#P＜0.001；

*用药组与模型组比较*p＜0.05，**P＜0.01

表3测试药物对血清AST(U％)活性的影响(n＝10，x±s)

组别  动物数    大鼠血清AST(U％)活性    大剂量    中剂量    小剂量   正常组    10 85.86±9.88 127.00±6.80  115.20±27.44   模型组    10 508.30±88.56# 507.70±88.44#  494.38±205.13#   双虎清肝组    10 425.60±85.60 414.44±57.19*  296.00±35.56*   VE组    9 417.44±56.62 399.90±74.48  325.90±25.32   1-1灌胃组    9 466.75±57.25 509.25±129.00  305.00±42.22   1-2灌胃组    9 441.80±46.84 408.60±74.40*  364.50±50.401-2腹腔注射组9414.11±29.85*408.11±69.90*298.67±19.93*

注：#模型组与正常对照组比较，#P＜0.001；

*用药组与模型组比较P＜0.05

2.测试药物对血清MDA含量变化的影响

模型组的MDA含量与正常对照组比较，MDA含量升高显著，(P＜0.001)；双虎清肝组和维生素E组与模型组比较，MDA含量下降显著，(P＜0.001和P＜0.01)；四种测试药物大、中、小剂量组血清MDA含量分别较模型组降低明显，其中1-2腹腔注射组降低血清MDA含量比其他组最明显(见表4)。

表4测试药物对血清MDA含量的影响(n＝10，x±s)

组别  动物数                          大鼠血清MDA含量    大剂量    中剂量    小剂量正常组    10    4.71±1.57    4.83±1.12    3.72±0.46模型组    10    10.57±1.66##    10.49±1.86##    19.2±3.29##双虎清肝组    10    6.45±0.99**    6.00±1.09**    6.33±3.17**VE组    9    7.00±1.21*    7.69±1.46*    10.80±5.14*1-1灌胃组    8    7.62±0.83*    7.83±0.94*    6.36±3.18**1-2灌胃组    8    7.39±0.69*    7.00±0.74*    5.89±2.95**1-2腹腔注射组85.66±0.70**5.94±0.70**5.84±2.92**

注：#模型组与正常对照组比较，#P＜0.05；##P＜0.001；

*用药组与模型组比较*p＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

3.肝组织病理变化

肝组织病理切片在光镜下观察到正常对照组肝小叶结构完整，肝细胞无明显病变。两模型组肝细胞普遍浊肿，部分呈气球样变、嗜酸性变和脂肪性变。测试药物大量组肝细胞肿胀、坏死和炎性细胞浸润分别较两模型组明显减轻。

(三).结论

已知组织过氧化损伤是肝损伤和肝纤维化形成中的重要机制之一。CCl₄进入体内经肝酶激活产生自由基和CCl₃，CCl₃和肝细胞内质网膜上的脂质起过氧化反应，引起细胞膜结构和功能的损害。研究证明CCl₄复制的肝损伤可模拟病毒性肝损伤，其表观症状、肝功能检测指标、肝脏病理改变与病毒性肝炎具有相似性。以CCl₄作为降酶药物研究模型，观察药效的最佳时间为24～48h。本实验在给小鼠注射CCl₄造模型36h时，观察到测试药物明显纠正肝损伤所致ALT，AST活性的升高，能减轻急性肝损伤时的肝细胞肿胀，防止肝细胞坏死，减少炎性细胞浸润。

MDA为脂质过氧化的最终产物，可严重破坏细胞膜结构，导致细胞肿胀、坏死。本实验结果表明，测试药物对CCl₄造成的小鼠实验性肝损伤具有保护作用，能降低实验性肝损伤小鼠血清ALT和AST活性，而MDA的含量则显著降低。其中测试药物中1-2灌胃制剂和1-3腹腔注射制剂与模型组比较，ALT和AST活性，以及MDA含量下降最显著。说明测试药物可能通过抗脂质过氧化而提高肝细胞膜系统的稳定性，使肝细胞变性和坏死减轻。测试药物具有保护肝细胞损伤的作用。

具体实施方式：

下面列举实施例，对本发明加以进一步说明，但本发明不只限于这些实施例。

实施例1

(1)、按照中国申请02121022.5中所述的方法现有技术提取活蝎蛋白液；

①活蝎消毒：采用擦拭消毒的方法，将酒精含量大于50％的白酒擦在活蝎的腹部，进行消毒杀菌；

②提取蛋白液：将小型注射器的针头插入位于活蝎腹部第三腹节的中间位置的体内蛋白囊内，抽出活蝎蛋白原液；

(2)、反应控制在2-4℃条件下进行。

①取8000ml活蝎蛋白液通过100,000MWCO超滤包，保留上部的大分子组分，冷冻干燥，留作他用。

②将得到的滤出液通过10,000MWCO超滤包，保留上部的大分子组分，冷冻干燥，留作他用。

③得到约3600ml的滤出液，冷冻干燥。

上述超滤膜包购自德国沙多利斯公司，选用分子量截流相差10倍的超滤包，分离分子量相差10倍的分子组份。

实施例2

操作控制在-5～0℃条件下进行，其它条件及步骤同实施例1

实施例3-7

用和实施例1同样的方法制备活蝎蛋白液抗氧化活性组分，实施例3-7操作温度如下：

实施例3实施例4  实施例5  实施例6  实施例操作温度4～6℃6～8℃10～12℃  12～15℃    0～2℃