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法律状态信息
法律状态
2017-06-30
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):A21D8/04 授权公告日:20100224 终止日期:20160517 申请日:20020517
专利权的终止
2012-10-03
专利权人的姓名或者名称、地址的变更 IPC(主分类):A21D8/04 变更前: 变更后: 申请日:20020517
专利权人的姓名或者名称、地址的变更
2010-02-24
授权
授权
2005-09-21
实质审查的生效
实质审查的生效
2005-07-27
公开
公开
发明领域
本发明涉及生面团加工和麦粉生面团为基础的产品，特别地，不仅仅是，改进生面团的强度和机械加工性能和面包和其它烘焙产品的体积，柔软度和屑结构。
技术背景
为了提高食品的质量，食品工业中广泛使用添加剂。最广泛使用的食品添加剂之一是乳化剂，特别是甘油单酯。
甘油单酯最初作为一-，二-和甘油三酯的混合物被制备。但是，后来发展的技术通过分子蒸馏法制备高度纯化的甘油单酯。常规通过甘油醇解反应制备甘油单酯，其中使用碱性催化剂在200℃以上的高温下使甘油三酯与甘油反应。
作为使用碱性催化剂和高温的替代，进行过很多尝试使用酶例如在甘油单酯的制备中使用脂肪酶。在综述文章中，Bornscheuer(Enzyme and Microbial Technology 17：578-585，1995)提到在存在或不存在溶剂下甘油三酯的酶促甘油醇解，以及在固相中能通过酶促甘油醇解制备甘油单酯。
甘油单酯能被用作很多食品应用的乳化剂。在烘焙工业中，通过与淀粉复合从而延迟支链淀粉的结晶和面包陈腐的开始，甘油单酯被用于提高面包柔软度。
脂肪酶(E.C.3.1.1.3)也被直接用于面包生产。例如，EP 0 585988中，要求保护向生面团加入脂肪酶导致抗陈腐效果的改善。它提出向生面团加入从无根根霉(Rhizopus arrhizus)获得的脂肪酶当与起酥油/脂肪油结合使用时能改善得到的面包的质量。WO94/04035教导通过向生面团加入脂肪酶而不向生面团加入任何附加的脂肪/油能获得改善的柔软度。Castello，P.ESEGP 89-10 Dec.1999Helsinki，证明外源脂肪酶能改变面包体积。因此，已知水解三酰基甘油的脂肪酶(E.C.3.1.1.3)对于在烘焙业中应用是有益的。
WO98/45453中公开了用脂肪酶处理过的生面团中甘油单酯水平只是非常弱地提高，因为向生面团加入的脂肪酶容易使甘油单酯降解成甘油和游离的脂肪酸。这由这样的实事来解释，即脂肪酶识别活性位点的分子的脂肪酸部分，并且因为甘油单酯和甘油二酯更取向于脂肪酶有活性的界面，向含有脂肪/油乳状液的基质中加入脂肪酶期间，甘油单酯和甘油二酯容易降解。即使对于只水解甘油三酯1和3位上的脂肪酸的1.3特异脂肪酶，留下2个甘油单酯作为反应产物，得到的2-甘油单酯容易重排成1-甘油单酯，它能被1.3特异脂肪酶水解。
常规脂肪酶对甘油三酯酶促降解期间，形成甘油单酯，甘油二酯，游离脂肪酸和甘油。
典型地，用一种或多种脂肪酶处理过的生面团中甘油单酯的增加在有或没有加入脂肪或油的情况下小于0.1％(以面粉重量为基础)。但是，例如要在生产的面包的柔软度上得到改善而要求在生面团中加入的甘油单酯常规用量典型地是大约以面粉重量为基础的0.3-0.8％(Krog，N.Cereal Food World，24，10，1979)。因此，根据EP 0 585988和WO94/04035中提出的向生面团中加入常规脂肪酶的任何有益效果都不是单独增加甘油单酯含量的结果。
一些脂肪酶除了具有甘油三酯水解作用之外，能水解极性脂类，如糖脂例如二半乳糖基甘油二酯(DGDG)，和磷脂(参见例如WO01/39602)。
小麦面粉中脂肪酶的底物是2-3％内源小麦脂类，它是极性和非极性脂类的复杂混合物。极性脂类可以分为糖脂和磷脂。用两个脂肪酸和一个极性基团酯化甘油制备这些脂类。极性基团是这些脂类表面活性的原因。酶促裂解这些脂类中脂肪酸中的一个产生具有高得多的表面活性的脂类。众所周知的是具有高表面活性的乳化剂，例如DATEM，当被加给生面团时，发挥非常大的功能。
但是，已经发现，在生面团中使用脂肪酶(E.C.3.1.1.3)在某些条件下可能有有害结果，例如产生跑味，对酵母活性的不利影响，和/或对面包体积的负面影响。对面包体积的负面影响经常被称作配料过量。配料过量能导致面筋弹性降低，这导致生面团太生硬，因此导致体积减小。另外，或者，这样的脂肪酶能降解加给生面团的起酥油，油或乳脂。
发明概述
本发明第一次发现，令人惊奇地，使用一种酶，其在生面团条件下能水解糖脂和磷脂，但是不能，或者基本上不能水解甘油三酯和/或1-甘油单酯，是有益的，并且克服了与使用能水解生面团中非极性脂类的脂肪酶(E.C.3.1.1.3)相关的缺陷。
本发明详细描述
本发明第一方面提供一种制备面粉生面团的方法，所述方法包括向生面团成分加入一种酶，这种酶在生面团条件下能水解糖脂和磷脂，但是不能，或者基本上不能水解甘油三酯和/或1-甘油单酯，并且将生面团成分混合，获得生面团。
本发明第二方面提供一种从生面团制备生面团或烘焙产品的方法，包括：
(a)测试至少一种酶对甘油三酯，1-甘油单酯，磷脂和糖脂的水解活性；
(b)选择一种对磷脂和糖脂有水解活性但是对甘油三酯和/或1-甘油单酯没有或者基本上没有水解活性的酶；和
向生面团加入选择的酶。
本发明第三方面提供一种生面团改进组合物，所述组合物含有对磷脂和糖脂有水解活性但是对甘油三酯和/或1-甘油单酯没有或者基本上没有水解活性的酶，和任选地，另外一种生面团成分。
第四方面，本发明提供根据本发明的方法可获得的生面团。
第五方面，本发明提供根据本发明的方法获得的生面团。
第六方面，本发明提供根据本发明烘焙生面团可获得的烘焙产品。
第七方面，本发明提供根据本发明烘焙生面团获得的烘焙产品。
第八方面，本发明进一步提供从根据本发明的生面团制备的面条产品。
第九方面，本发明提供从根据本发明的生面团制备的意大利面食产品。
第十方面，本发明提供制备生面团改进组合物的方法，其中对磷脂和糖脂有水解活性但是对甘油三酯和/或1-甘油单酯没有或者基本上没有水解活性的酶，任选地，与另外一种生面团成分混合。
第十一方面，根据本发明的选择酶的方法可以包括下面的步骤：
(a)对至少一种酶测试其对甘油三酯，1-甘油单酯，磷脂和糖脂的水解活性；
(b)选择一种对磷脂和糖脂有水解活性但是对甘油三酯和/或1-甘油单酯没有或者基本上没有水解活性的酶。
本发明第十二方面提供制备或开发一种对磷脂和糖脂有水解活性但是对甘油三酯和/或1-甘油单酯没有或者基本上没有水解活性的酶的方法，包括：
(a)选择一种对磷脂，糖脂，甘油三酯和/或1-甘油单酯有水解活性的脂肪酶，
(b)通过一般在活性位点附近或者活性位点在氨基酸序列中插入，缺失或取代至少一个氨基酸进行修饰，以这样一种方式改变脂肪酶的活性，即使得脂肪酶被修饰以不具有或基本上不具有对甘油三酯和/或1-甘油单酯的活性。
第十三方面，本发明提供在生面团条件下能水解糖脂和磷脂的不能或基本上不能水解甘油三酯和/或1-甘油单酯的酶在制备生面团以提供与没有所述酶的生面团相比面包体积加大和/或面筋强度加强的生面团中的用途。
第十四方面，本发明提供从食用油中去除极性脂类的方法，所述方法包括向食用油加入一种能水解糖脂和磷脂的酶，其中所述酶不能或基本上不能水解甘油三酯和/或1-甘油单酯。
第十五方面，本发明提供一种食用油，例如大豆油或菜籽油，它通过根据本发明的方法可获得或获得。
第十六方面，本发明提供一种蛋白质，它在生面团条件下具有下面特征的一项或几项：
i)能水解糖脂和磷脂，其中所述酶不能或基本上不能水解甘油三酯和/或1-甘油单酯；
ii)SDS PAGE分析测得大约57和/或大约87kDa的分子量；其中所述蛋白质能从豇豆(Vigna unguiculata)获得。
第十七方面，本发明提供一种制备面粉生面团的方法，所述方法包括向生面团成分加入一种包含SEQ ID No.12所示氨基酸序列的酶，或者其变体，同源物或衍生物，并且混合生面团成分，得到生面团。
为了方便引用，现在在合适的部分标题下讨论本发明的这些和其它方面。但是，每一部分的教导不必须局限于各个特定部分。
优选实施方案
优选地，能水解糖脂和磷脂的酶，其中所述酶不能或基本上不能水解甘油三酯和/或1-甘油单酯，是脂解酰基水解酶(LAH)(E.C.3.1.1.26)。
请注意根据生物化学和分子生物学国际联盟(InternationalUnion of Biochemistry and Molecular Biology)(IUBMB)推荐的酶命名法(1992)，酶编号为E.C.3.1.1.26的酶称作″半乳糖脂酶″，其也可以对2，3-二-O-酰基-1-O-(6-O-α-D-半乳糖基-β-D-半乳糖基)-D-甘油，和磷脂酰胆碱和其它磷脂起作用。文献中(象，例如，Biochemica et Biophysica Acta 1215(1994)66-73)，落在酶编号E.C.3.1.1.26下的酶被称作脂解酰基水解酶(LAHs)和其它这样的名称。这里使用的术语半乳糖脂酶和脂解酰基水解酶(LAH)被认为是同一种酶的同义词，即落在E.C.分类3.1.1.26下并且对半乳糖脂和磷脂具有活性的酶。
优选地，从可溶性豇豆叶提取物分离和/或从小麦叶类囊体分离能水解糖脂和磷脂的酶，其中所述酶不能或基本上不能水解甘油三酯和/或1-甘油单酯。
合适地，能水解糖脂和磷脂的酶，其中所述酶不能或基本上不能水解甘油三酯和/或1-甘油单酯，可以具有SEQ ID No.1所示氨基酸序列，或者可以是其变体，同源物或衍生物。
合适地，能水解糖脂和磷脂的酶，其中所述酶不能或基本上不能水解甘油三酯和/或1-甘油单酯，可以具有SEQ ID No.1所示氨基酸序列，或者可以具有与SEQ ID No.1至少75％，更优选至少85％，更优选至少90％同源的氨基酸序列。
合适地，能水解糖脂和磷脂的酶，其中所述酶不能或基本上不能水解甘油三酯和/或1-甘油单酯，可以由SEQ ID No.2所示核苷酸序列编码，或者可以是其变体，同源物或衍生物。
合适地，能水解糖脂和磷脂的酶，其中所述酶不能或基本上不能水解甘油三酯和/或1-甘油单酯，可以由SEQ ID No.2所示核苷酸序列编码，或者可以由与SEQ ID No.1至少75％，更优选至少85％，更优选至少90％同源的核苷酸序列编码。
合适地，能水解糖脂和磷脂的酶，其中所述酶不能或基本上不能水解甘油三酯和/或1-甘油单酯，可以是当用SDS-PAGE分析测定时具有大约57kDa和/或大约87kDa分子量并且从豇豆可获得的蛋白质。
优选地，利用这里描述的相同的方法分离具有大约57kDa和/或大约87kDa分子量的蛋白质。
术语″生面团条件下能水解糖脂和磷脂的酶，其中所述酶不能或基本上不能水解甘油三酯和/或1-甘油单酯″包括生面团条件下能水解糖脂和磷脂，但是不水解或基本上不水解甘油三酯和/或1-甘油单酯的酶。
对于一些实施方案，可以加入含有所述酶的组合物形式的酶。
应该加入有效量的酶，使得在生面团条件下或脱胶条件下，酶能水解糖脂和磷脂，而不能或基本上不能水解甘油三酯和/或1-甘油单酯。作为选择或附加，可以或者直接向已经混合的生面团或者作为一种或多种生面团成分中的一种向生面团加入有效量的含有所述酶的组合物。
术语″有效量″在这里指加入酶的足以在生面团或脱胶条件下起作用，可检测程度地水解生面团中存在的一种或多种糖脂和一种或多种磷脂，而加入的酶不影响或者不显著影响甘油三酯和/或1-甘油单酯水平的量。更具体地，该术语涉及加入的酶的量，其不仅导致糖脂和磷脂的可检测水解而且同时基本上不影响甘油三酯和/或1-甘油单酯水平，但是另外导致通过糖脂和磷脂的水解形成酶促终产物，或者由于对甘油三酯和/或1-甘油单酯没有或基本上没有活性而不形成酶促终产物，该水平导致生面团性质改善，或者如果烘焙生面团，则改善烘焙的产品的质量，例如增大面包体积，提高柔软度或者改善面包屑结构或者从食用油去除极性脂类。
术语″基本上不能水解甘油三酯和/或1-甘油单酯″和″对甘油三酯和/或1-甘油单酯基本上没有水解活性″在这里用来指这种酶只是在不显著程度和/或不可检测程度上水解甘油三酯和/或1-甘油单酯。
有利地，生面团中甘油三酯，1-甘油单酯，糖脂和磷脂中至少一种是用于制备生面团的面粉中存在的天然存在的脂类成分。
合适地，磷脂是磷脂酰胆碱(PC)和/或糖脂是二半乳糖基甘油二酯(DGDG)。
在加入极性脂类的情况下，合适地，极性脂类可以是磷脂，例如选自磷脂酰肌醇(PI)，磷脂酰甘油(PG)，磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)的一种或几种。
优选地，生面团是酵母发酵生面团。虽然，优选使用本发明方法制备酵母发酵面包产品例如面包条，面包卷或烤面包，也使用该方法制备通过加入本发明的酶而能改善质量的任何其它类型生面团和以生面团为基础的产品例如面条和意大利面食产品和蛋糕。
优选地，以0.1至1000单位酶/公斤面粉的量加入酶。更优选地，以1至100单位酶/公斤面粉的量加入酶。
优选地，当生面团是面包生面团时，该方法包括另外一个步骤，即烘焙生面团以获得烘焙产品。烘焙面包产品的一个特别期望的性质是实施例中定义的高比体积。因此，加入本发明酶优选导致烘焙产品的比体积相对除了没有加入酶的相同条件下制备的烘焙产品增加至少10％。更优选地，比体积增加至少20％，象至少30％，例如至少40％。或者，生面团选自意大利面食生面团，面条生面团，和蛋糕生面团或稀面糊。
优选地，以导致相对于除了没有加入酶的相同的条件下烘焙的产品来说烘焙产品比体积增加至少10％的量加入酶。
加入本发明的酶优选导致相对于没有加入酶的生面团来说生面团的面筋指数提高至少5％，利用Glutomatic 2200仪测定面筋指数。
利用从Perten Instruments(瑞典)购得的Glutomatic 2200，应用下面描述的方法可以测定面筋指数：醒发之后应该立刻称量15g生面团并且放在Glutamatic 2200中，用500ml 2％NaCl溶液洗涤10分钟。然后应该将洗涤过的生面团转移到Gluten Index Centrifuge2015，并且应该称量两个面筋部分，并且根据下面的等式计算面筋指数：
面筋指数＝(筛中留下的面筋重量×100)/面筋总重量。
发现本发明的酶抗某些糖脂例如半乳糖脂，包括转化为有效表面活性剂二半乳糖甘油单酯(DGMG)的二半乳糖甘油二酯(DGDG)是特别有效的。优选地，水解生面团中最初存在的糖脂的至少25％，并且优选地，水解糖脂中至少35％，更优选至少其50％，至少60％或者至少75％。
另一个方案或者另外，发现本发明的酶抗某些被转化成溶血磷脂的磷脂是有活性的。优选地，生面团中最初存在的磷脂的至少25％被水解，优选磷脂的至少35％被水解，更优选水解至少50％，至少60％或者至少75％。
脂酶对甘油三酯的活性可以取决于底物的pH。优选地，所述酶在4.5-6.5的pH范围内具有对磷脂和糖脂的水解活性，但是没有或者基本上没有对甘油三酯和/或1-甘油单酯的水解活性。
优选地，这里定义的酶不能水解甘油三酯和/或1-甘油单酯。
优选地，所述酶不能或者基本上不能水解甘油三酯和/或1-甘油单酯。优选地，所述酶不能水解甘油三酯和1-甘油单酯两者。或者，所述酶能水解甘油三酯和甘油二酯，但是不能或基本上不能水解1-甘油单酯。合适地，所述酶不能水解1-甘油单酯。
本领域公知除了脂酶之外的酶可以改进生面团性质和烘焙的产品的质量。除了本发明的酶之外，本发明范围内至少另外一种酶可以加给生面团或者存在于生面团改进组合物中。这样的另外的酶包括淀粉降解酶，例如内淀粉酶或外淀粉酶，支链淀粉酶，淀粉降解酶，脱支化酶，半纤维素酶包括木聚糖酶，纤维素酶，脂肪氧化酶和氧化还原酶，例如葡萄糖氧化酶，磷脂酶和己糖氧化酶。
优选地，组合物中另外的生面团成分，当存在一种时，选自谷类面粉，酵母，化学发酵剂，生面团强化剂，乳化剂，糖，酰基甘油，磷脂，糖脂和盐。
合适地，生面团可以是新鲜生面团，任选地在控制气氛下烘焙。生面团可以是冷冻的。
合适地，根据本发明的一种或几种酶可以被加给生面团和/或可以存在于生面团改进组合物中和/或加给食用油。合适地，根据本发明的两种或多种，三种或多种，或者四种或多种酶可以被加给生面团和/或可以存在于生面团改进组合物中和/或加给食用油。
优选地，根据本发明的酶的选择方法可以包括在含有半乳糖脂，磷脂，甘油三酯或1-甘油单酯为底物的琼脂板上筛选酶的活性。选择对磷脂和糖脂有活性但是对甘油三酯和/或1-甘油单酯没有或基本上没有活性的酶。
合适地，在4.5-6.5的pH下进行选择本发明的酶的方法的步骤(a)和/或(b)。
优选地，选择本发明的酶的方法测试的酶是脂肪酶(E.C.3.1.1.3)或者脂类酰基水解酶(E.C.3.1.1.26)。
优选地，在根据本发明的酶的制备或研发方法中，在盖(lid)区和/或接近活性位点和/或在氨基酸序列的C-末端至少一个氨基酸被插入，缺失或取代。
优选地，缺失盖区。
通过修饰脂肪酶(E.C.3.1.1.3)和脂解酰基水解酶(E.C.3.1.1.26)，产生对磷脂和糖脂有活性但是对甘油三酯和/或1-甘油单酯没有或基本上没有活性的酶，来制备合适的酶。
合适的氨基酸取代作用包括改变活性位点周围亲水性质的活性位点中或接近活性位点的氨基酸的取代。只是作为举例，氨基酸取代作用可以增加活性位点中或接近活性位点的极性氨基酸的数目。
优选地，根据本发明制备酶，所述酶在4.5-6.5的pH范围内能水解磷脂和糖脂，并且其中所述酶不能或者基本上不能水解甘油三酯和/或1-甘油单酯。
合适地，本发明的酶与对于磷脂相比可以具有更大的对于糖脂的活性。合适地，生面团中最初的糖脂(即DGDG)的水解百分比％∶生面团中最初的磷脂(即磷脂酰胆碱)的水解百分比％可以是大于10∶1，例如，象大于15∶1，大于20∶1，大于30∶1，或大于40∶1。
或者，本发明的酶与对于糖脂相比可以具有更大的对于磷脂的活性。例如，生面团中最初的糖脂(即DGDG)的水解百分比％∶生面团中最初的磷脂(即磷脂酰胆碱)的水解百分比％可以是大于1∶3，象例如大于1∶5，大于1∶8，大于1∶10，或大于1∶15。
大多数谷物面粉含有非极性脂类包括甘油三酯和极性脂类包括磷脂和糖脂。极性脂类可以作为本发明的酶的底物。因此，在方法的一个实施方案中，至少一种糖脂，例如半乳糖脂，包括二半乳糖基二甘油酯(DGDG)，和一种磷脂，例如磷脂酰胆碱(PC)，是生面团使用的面粉中存在的天然存在的(或内源)脂类成分。
但是，面粉生面团也可以不含有足量的本发明的酶的这些脂类底物。因此，用糖脂或磷脂中至少一种补充生面团以提供足够的酶的底物也在本发明范围内。要明白术语″足够底物″意味着这些脂类都不受限制获得如上所述的改善生面团的或者改善烘焙产品的作用。
另外或者替代之的另一个方案中，可以加入补充的非极性脂类例如酰基甘油。根据本发明，可以使用各种各样的这样的脂类，例如植物油，植物脂肪，动物油，动物脂肪，象例如黄油，和起酥油。与此相关，特别有用的脂类是从谷物衍生的油或脂肪例如燕麦油。燕麦油除了甘油三酯之外一般含有5-25％磷脂和5-12％糖脂。能将燕麦油分级分离，得到有高含量极性脂类的级分(E.G.Hammond in Lipid inCereal Technology，P.J.Barnes编著，科学出版社)。
因此，本发明的方法的一个方面是一种或多种磷脂能被加给生面团。与此相关，有用的磷脂包括磷脂酰肌醇(PI)，磷脂酰甘油酯(PG)，磷脂酰胆碱(PC)，卵磷脂和磷脂酰乙醇胺(PE)。
甘油三酯，1-甘油单酯，糖脂和磷脂中至少一种可以被加给生面团。
令人吃惊地发现，加入能水解糖脂和磷脂的酶，其中所述酶不能或基本上不能水解甘油三酯和/或1-甘油单酯和糖脂，特别是二半乳糖基甘油二酯(DGDG)，导致改善的面包体积和/或面包屑结构。酶加糖脂发现的改善甚至大于单独使用酶而发现的改善。因此，合适地，可以和糖脂联合使用具有这里定义的特殊性质的酶。
食用油，例如植物油，例如大豆油或油菜籽油，一般包括带有低含量极性脂类的甘油三酯，例如磷脂和糖脂。为了提供清澈的高品质油产品，经常期望从植物油中去除极性脂类。去除极性脂类的过程经常被称作脱胶。因此，根据本发明的第十五方面，通过应用本发明的酶可以将食用油例如植物油脱胶。脱胶是从食用油去除极性脂类例如磷脂的精制过程的第一步。脱胶一般通过水法和湿法进行。例如，通过酶催化水解将磷脂转化为水溶性溶血-磷脂，然后通过离心从油中分离水溶性溶血-磷脂。酶脱胶的油中残留的磷含量可以象2ppm磷这样低。
优选地，根据本发明的第十四和十五方面的食用油是一种植物油。
本发明的优点
本发明的优点在于本发明的酶，它具有对糖脂和磷脂的活性，但是它不能或者基本上不能水解甘油三酯和/或1-甘油单酯，当在生面团中使用时，产生多不饱和脂肪酸，因为内源小麦糖脂和磷脂含有高水平(＞70％)的亚油酸(C18:2)和亚麻酸(C18:3)。这些脂肪酸是脂肪氧化酶的底物并且有助于提高面筋强度和减少碎屑。
本发明的另一个或另外的优点是内源极性脂类能被修饰而不产生过量的脂肪酸。因此，防止生面团变得太硬和/或增加得到的面包体积，和/或能减少面粉脱落和/或能减轻或克服对酵母活性的负面影响。本发明的另一个或另外的优点是加给生面团的起酥油，油或乳脂不被水解。
本发明的详细描述
本发明的酶
具有这里定义的性质的酶可以来自各种各样的来源，包括植物，动物和微生物，象细菌和真菌物种，包括酵母物种。本发明的酶可以来自天然产生这种酶的生物体或者可以通过用编码这种酶的基因转化合适的宿主细胞而重组制备。所述酶可以是这样一种酶，其本身包括其所有的酶活性的活性位点，但是通过合成或者通过利用DNA重组技术，它也可能构建具有这里定义的酶活性的杂交酶。
或者，为了提供具有这里定义的性质并且具有期望的底物特异性的酶，例如通过改变其氨基酸序列，能修饰至少开始不具有这里定义的特定性质的酶。本领域公知通过随机诱变来修饰酶(US4,814,331，WO93/01285和WO95/22615)和通过定点诱变修饰脂解酶(WO97/04079)，来获得其改进的性能。一般使用的概念是在所研究的脂解酶的氨基酸链的结构部分中插入，缺失或取代氨基酸。用于修饰的合适的酶是能水解酯键的酶。这样的酶包括例如脂肪酶，象三酰甘油脂肪酶(E.C.3.1.1.3)，脂蛋白脂肪酶(E.C.3.1.1.34)，甘油单酯脂肪酶(E.C.3.1.1.23)，溶血磷脂酶，阿魏酸酯酶和酯酶(E.C.3.1.1.1，E.C.3.1.1.2)和脂解酰基水解酶(E.C.3.1.1.26)和磷脂酰肌醇脱酰酶(E.C.3.1.1.52)。
用于修饰的合适的酶可以来自各种各样的来源，包括植物，动物和微生物，象细菌和真菌物种，包括酵母物种。用于修饰的合适的酶的例子是假单胞菌脂肪酶，例如来自洋葱假单胞菌(P.cepacia)(US5,290,694)，荚壳假单胞菌(P.glumae)(Frenken N等(1992)Appl.Envir.Microbiol.58 3787-3791)，类产碱假单胞菌(P.Pseudoalcaligenes)(EP 0 334 462)或假单胞菌菌株SD 705(WO95/06720，EP0 721 981，WO96/27002，EP0 812 910)。或者，用于修饰的合适的酶可以是例如真菌脂解酶，例如腐质霉属家族(Humicola)和接合菌属家族的脂解酶和真菌角质酶。脂解酶的腐质霉属家族由来自H.Lanuginosa菌株DSM 4109的脂肪酶和与这种脂肪酶具有50％以上同源性的脂肪酶构成。EP0 258 068和EP0 305 216描述了这种来自H.lanuginosa(Thermomyces lanuginosus的同义词)的脂肪酶，并且具有US5,869,438的SEQ ID NO.2的位置1-269所示的氨基酸序列。
Withers-Martinez等(Structure 1996，4：1363-1374)研究了豚鼠胰脂肪酶相关的蛋白质2(GPLRP2)，其对半乳糖脂和磷脂具有活性并且对甘油三酯有降低的活性。给出了这种酶的晶体结构，并且与只对甘油三酯有活性的人胰腺脂肪酶(HPL)和由GPLRP2的催化结构域和HPL的C-末端结构域构成的脂肪酶相关蛋白质2(GPLRP2)的嵌合突变体(GPLRP2/HPL)相比较。突变体GPLRP2/HPL对磷脂和半乳糖脂具有活性，但是与GPLRP2酶相比较还对甘油三酯有降低的活性。为了比较，还分析了大黄蜂毒液(PLA1)。Withers Martinez等(Structure1996 Nov 15；4(11)：1363-74)研究了位于豚鼠胰脂肪酶相关蛋白质2，人胰脂肪酶和来自大黄蜂毒液的磷脂酶A1的活性位点上的环，并且发现环构型和对甘油三酯和磷脂的活性之间的相关性。
与HPL相比较，在GPLRP2中，盖结构域大小减小，并且只有β9环是保守的，因此发现活性位点周围有较小的疏水性表面。这可以解释GPLRP2和GPLRP2/HPL与HPL相比对甘油三酯的降低的活性。
只是为了举例，通过在脂肪酶的催化位点或者周围取代特异氨基酸可以获得对甘油单酯没有活性的脂肪酶变体。例如可以改变欧洲专利公开No.0 977 869中教导的SEQ ID No.4中所示核苷酸序列编码的具有SEQ ID No.3中所示氨基酸序列的来自塔宾曲霉(Aspergillustubingensis)的脂肪酶，得到用于本发明的用途的这样一种脂肪酶变体。
SEQ ID No.3的催化三联体是丝氨酸173(Ser173)，天冬氨酸228(Asp228)和组氨酸285(His285)。合适地，这个催化三联体的这些氨基酸中的一个或多个可以被取代，以改变该催化三联体的亲水性质。
SEQ ID No.3的催化位点中或周围的以下氨基酸中的一个或多个可以被取代，以改变该活性位点周围的亲水性质：
Phe107-Phe123；Gly171-Gly175；Tyr198-Ile203；Thr224-Gly239；Ser270-Leu297。
例如，用于突变“母体”脂肪酶以提供根据本发明的改变的底物活性的脂肪酶变体的方法可以包括下面的步骤。
A.表达载体构建
通过用组成型启动子，ADHp，置换诱导型启动子，Gallp，可以构建一种载体，例如pYEL，并且通过在啤酒糖酵母(S.cerevisiae)中体内重组，可以插入脂肪酶基因(例如如EP0 977 869中教导的来自塔宾曲霉的脂肪酶基因)。图11说明从pYES2衍生的这样一种表达载体。
B.易错聚合酶链式反应(EP-PCR)随机诱变
然后例如使用两种EP-PCR操作，GeneMorph PCR诱变试剂盒和DiversifyTMPCR随机诱变试剂盒，可以制备随机诱变文库，所述两种操作分别被称作Genemorph和Diveresify。
为了获得每个脂肪酶基因例如每个LipA基因1-2个氨基酸取代，可以优化突变频率。通过改变Genemorph EP-PCR操作中模板DNA的初始量(大约0.65-40ng)和通过改变Diversify EP-PCR操作中MnSO4(O-640μM)和dGTP(40-120μM)的浓度，可以进行诱变频率的优化。优化的EP-PCR操作可以包括：Genemorph EP-PCR操作中，0.65ngDNA模板，2.5U Mutazyme DNA聚合酶，125ng各种引物，lxMutazyme反应缓冲液和200μM dNTP混合物。Diversify EP-PCR操作中，使用1ng DNA模板，2U钛TM Taq DNA聚合酶，10μM各种引物，3.5mM MgCl2，480μM MnSO4 200μM dNTP混合物和40μM dGTP。两种EP PCR操作都在50微升总体积中进行。
下面表中给出了对两种EP-PCR操作设计的引物。引物JOM1另外诱导起始密码子的三个A′s(下划线)上游。
引物 核苷酸序列 Tm 引物位点[bp]
[℃]
JOM1 5′CAAGCTATACCAAGCATA 77.6 380-398 SEQ ID No.5
CAATCAACTCCAAAATGTT (ADHp)→
CTCTGGACGGTTTG3′ 1-20(LipA)
JOM2 5′CAAACCTCTGGCGAAGAA 69.3 400→428 SEQ ID No.6
GTCCAAAGCTG3′ (ADH3)
使用可编程热循环仪用下面的条件可以进行EP-PCR；GeneMorphTM PCR诱变试剂盒：94℃30秒，接着94℃30秒，55℃30秒和72℃2分钟进行30个循环。最后在72℃进行10分钟另外的延伸。DiversifyTM PCR随机诱变试剂盒：94℃30秒，接着94℃30秒，和68℃1分钟进行25个循环。
C.转化和表达
通过改变例如pYES2方案(Catalog no.V825-20，Invitrogen，CA，USA)中描述的转化操作可以制备转化的和感受态细胞。啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)CEN.PK113-5D的单一菌落可以接种在20mL YPD中并且以200RPM摇速下在30℃生长过夜。用YPD将过夜培养物稀释至OD600为0.2-0.3，并且在200RPM和30℃下再温育3小时。通过以4750g在20℃离心5分钟可以收获细胞。将沉淀重新悬浮于1mL 1xTris EDTA(1xTE)，pH8.0中洗涤，并且以10000g离心5分钟。通过加入0.5mL的IxTE和100mM乙酸锂，pH7.5使得细胞成为感受态。
通过轻轻混合100微克DNA和50微升感受态啤酒糖酵母细胞，5μL Yeastmaker Carrier DNA和300微升的100mM乙酸锂，40％聚乙二醇3350和1xTE可以进行转化。混合物以1000RPM在30℃下摇动温育30分钟接着在42℃下温育15分钟。然后将细胞转移给冰，然后以11300g沉淀5秒。该沉淀重新悬浮于1mL YPD中并且在30℃和200RPM下温育45分钟。将150微升悬浮液体积转移给含有SC-ura的平板并且在30℃下温育3天。利用体内重组，进一步将对于感受态啤酒糖酵母细胞的转化用于克隆目的，其中可以用50ng的BamHI线性化pYEA共同转化100ng的脂肪酶(例如LipA)或者其变体。
D.DNA分离
使用高纯度质粒分离试剂盒通过碱性水解可以从大肠杆菌分离质粒DNA。
可以如下从啤酒糖酵母分离质粒DNA：通过以1100g离心15分钟将细胞沉淀并且重新悬浮于1mL STET和1.5mL玻璃珠(425-600微米)。另外，加入1mL STET并且将混合物在100℃温育5分钟。然后以6500g将溶液离心15分钟，并且将上清液转移给Eppendorf试管，将该试管以27000g再离心15分钟。使用来自质粒微量纯化试剂盒的Qiagen-tip 20可以从上清液提取和纯化DNA。
E.DNA测序
根据双脱氧链终止剂操作[Sanger等，1977]可以对脂肪酶(例如LipA)变体测序。使用改进的质粒微量纯化试剂盒可以制备用于测序的质粒DNA。因此可以进行标准碱性水解代替使用Qiagen-tip 20a。当使用PCR扩增的DNA用于测序时，通过WizardPCR Preps DNA纯化系统可以分离DNA。
分别用500ng和3.2pmol的DNA模板和引物浓度，使用ABIPrismBigDyeTM Terminators v3.0循环测序试剂盒(DaniscoBiotechnology)或ABI Prism dRhodamine Terminator CycleSequencing Ready Reaction试剂盒(AAU)可以进行测序反应。使用可编程热循环控制装置用下面的条件可以进行测序反应：96℃30秒，50℃15秒和60℃4分钟进行25个循环。通过乙醇沉淀可以进行PCR产物的纯化，并且沉淀可以再悬浮于12微升的HIDI甲酰胺(DaniscoBiotechnology)或12微升模板抑制试剂(AAU)中，并且可以被转移给有间隔的Genetic Analyser样品管。在ABI Prism3100遗传分析仪(Danisco Biotechnology)或ABI Prism310遗传分析仪(AAU)上分析样品。下面表中给出了用于对变体LipA测序的合适的引物。这些引物在LipA内部退火。
引物 核苷酸序列 引物位点[bp] Tm
[℃]
JOM3 5′GCTCGTGGTCGCCTTCCGGGG 3′ 306-326(LipA) 68.2
(SEQ ID No.7)
JOM4 5′GCCGGTGCAGAGGTCGTCG 3′ 399-381(LipA) 58.1
(SEQ ID No.8)
JOM5 5′CCTCGAATCGGAAACTATGCGC 3′ 601-632(LipA) 61.6
(SEQ ID No.9)
JOM13 5′TGTCACGGCGTCGGATATCG 3′ 768-787(LipA) 78
(SEQ ID No.10)
JOM14 5′CTCATCCAACGTGGAAGTCG 3′ 108-89(LipA) 77
(SEQ ID No.11)
F.筛选脂肪酶(合适地，脂肪酶3)变体：改变的底物特异性
可以鉴定显示DGDG和磷脂酶活性，但是没有甘油三酯活性的变体，例如，利用初步高通量平板筛选后定量筛选，其中证实和定量提高状况。
G.改良变体的制备和纯化
选择的变体的单一菌落可以接种到50mL的SC-ura培养基中并且在30℃和250rpm下温育2天，然后将25mL转移给500mL YPD培养基并且在30℃和200rpm下再温育2天。通过离心15分钟可以从培养物分离产生的脂肪酶。进一步使用之前，上清液可以贮存在-18℃下。
疏水性相互作用色谱
可以用(NH4)2SO4平衡250mL上清液，获得最终浓度为1.0M的(NH4)2SO4。将悬浮液注入SOURCE15PHE柱子，所述柱子含有苯基疏水性配体，该配体偶联于15μm单分散刚性聚苯乙烯/二乙烯基苯基质。装填柱子至5.1mL最终柱床体积。使用20mM NaAc缓冲液pH5.5和1.0M-0M(NH4)2SO4的线性递降梯度以5mL/分钟的速度洗脱20分钟。
通过对含有合适的底物的平板上的孔施加15微升的各种级分来筛选磷脂酶活性，半乳糖脂酶活性和甘油三酯水解酶活性，可以鉴定根据本发明的含有脂肪酶(例如脂肪酶3)及其变体的级分。
脱盐
含有最终床体积是8.3mL的Sephadex G-25基质的PD-10脱盐柱可以将选择的级分脱盐。施加2.5mL样品体积之后，可以用20mMTEA缓冲液pH7.3将柱子预平衡。也可以通过施用3.5mL的20mM TEA缓冲液pH7.3进行洗脱。
阴离子交换色谱
向含有与15μm单分散的刚性聚苯乙烯/二乙烯基苯基质偶联的季铵配体的SOURCE15Q柱子注入选择的级分。柱子可以装填至5.1mL最终柱床体积。使用20mM TEA缓冲液pH7.3和0M-1.0M NaCl的线性递增梯度以2mL/分钟的速度洗脱20分钟。
H.改良的变体的表征
SDS-PAGE/天然凝胶
使用1x洗脱缓冲液，12％分离凝胶和根据Laemmli(1970)制备的4％堆积凝胶，通过SDS-PAGE，根据大小可以分离蛋白质。
等当量的样品和含有2-巯基乙醇的SDS样品缓冲液可以在95℃下温育5分钟。作为标准物，使用含有0.64微克磷酸化酶b，0.83微克牛血清白蛋白，1.47微克卵清蛋白，0.83微克碳酸酐酶，0.88微克大豆胰蛋白酶抑制剂和1.21微克α-乳清蛋白的低分子量范围标记。使用CoommasieG250染色观察蛋白质泳带。
对于天然PAGE：通过其中没有使用SDS的天然PAGE，根据迁移率，可以分离蛋白质。
先前没有人将只对半乳糖脂和磷脂有活性的脂肪酶用于烘焙。这些类型的脂肪酶只是在文献中提到过。但是，Matos A.R.等(FEBSLett 2001 Mar 2；491(3)：188-92)从杆状病毒系统中表达的干旱胁迫的豇豆分离了43KDa蛋白质。这种酶优先表现出半乳糖脂酰基水解酶活性和一定的磷脂活性，但是对三酰基甘油(甘油三酯)没有活性。SEQ ID No.1中给出了这种酶的氨基酸序列，SEQ ID No.2中给出了编码这种酶的核苷酸序列。这些类型的酶不同于正常脂肪酶(EC.3.1.1.3)，并且术语脂解酰基水解酶(LAH)(E.C.3.1.1.26)通常适用这些酶，这些酶只是在植物界描述过。Matos等描述的半乳糖脂酰基水解酶适合用于本发明。
本发明的酶可以是脂肪酶(E.C.3.1.1.3)或脂解酰基水解酶(E.C.3.1.1.26)，只要它具有特定性质。
Sahsah等(Biochem Biophys Acta 1994 Nov 17；1215(1-2)：66-73)从可溶性豇豆叶子提取物分离了脂解酰基水解酶。这种酶对不同底物的水解活性表现出下面的相对活性，二半乳糖基甘油二酯＞单半乳糖基甘油二酯＞磷脂酰胆碱＞磷脂酰甘油。该酶对三酰基甘油(甘油三酯)没有活性。Sahsah等公开的酶适用于本发明。
O′Sullivan等(J.Plant Physiol.Vol.131，pp393-404 1987)公开了与小麦叶的类囊体相关的膜结合半乳糖脂酶。
上面的例子详细说明只对磷脂和半乳糖脂有活性的脂肪酶或脂解酰基水解酶，虽然显然少见，但是存在于自然界中并且可以用于本发明。另外或者还有对磷脂和半乳糖脂有活性但是对甘油三酯和/或1-甘油单酯没有活性的脂肪酶的其它制备方法。
如上所述，Withers-Martinez(Structure 1996，4：1363-1374)证明豚鼠脂肪酶相关蛋白质2(GPLRP2)对磷脂和半乳糖脂有活性并且对甘油三酯有降低的活性。它还指出活性位点周围的亲水性能控制对甘油三酯的活性。这开启了活性位点中或活性位点附近氨基酸取代的可能性，它通过改变活性位点周围的亲水性而进一步降低甘油三酯活性。
通过改变酶中特定氨基酸能改变脂肪酶的特异性这一点是公知的。Cordle等(J.Lipid Res.1998 Sep 39(9)：1759-67)用更有极性的天冬氨酸取代了酪氨酸并且获得对长链脂肪酸的降低的活性。
Carriere等(Biochemistry 1997 Jan 7 36(1)：239-48)为了消除界面活化作用而去除了人胰脂肪酶的盖区，并且发现其对甘油三酯的特异活性被大大减小。这篇文章还报道了人胰脂肪酶的C-末端对于界面稳定性是重要的。
通过改变对于甘油三酯活性的最佳pH也能获得对磷脂和半乳糖脂有活性但是对甘油三酯没有活性的用于烘焙的优选的脂肪酶。生面团中正常条件的pH在4.5-6.5范围内。Ching T.Hou(Journal ofIndustrial Microbiology，13(1994)242-248)筛选了很多不同的脂肪酶，并且发现大量的在pH7.5具有甘油三酯活性但是在pH5.5不具有活性的脂肪酶。
通过选择在pH5.5下不具有活性的脂肪酶，并且通过定点或定域随机诱变修饰活性位点周围的区域来改变活性位点周围表面的亲水性质和通过定点或定域随机诱变修饰盖区，有可能获得对磷脂和半乳糖脂有活性并且在pH7.5或以上保留甘油三酯活性，但是在pH6.5或更低例如在pH5.5下没有活性的脂肪酶。
脂肪酶可以有不同类型的特异性(Inform Vol.8，No.6 640-650)。脂肪酶的脂肪酰基特异性对产生的脂肪酸的类型有影响。一些脂肪酶对不饱和脂肪酶是非常特异的，这在生面团体系中是优选的，因为多不饱和脂肪酸是内源或加入的脂肪氧化酶的底物。优选地，根据本发明的酶优先水解不饱和脂肪酸。合适地，在根据本发明的酶的制备或研发方法中，插入，缺失或取代改变酶的脂肪酰基特异性，使得该酶优先产生脂类部分中的多不饱和脂肪酸。
下面实施例部分给出对磷脂和糖脂有水解活性但是对甘油三酯和/或1-甘油单酯没有或基本上没有水解活性的酶的合适的例子。
克隆编码本发明的酶的核苷酸序列
可以从生产所述酶的任何细胞或生物体分离具有这里定义的特定性质的酶或适合修饰的酶的编码核苷酸序列。各种方法是核苷酸序列分离领域公知的。
例如，使用来自产生这种酶的生物体的染色体DNA或信使RNA可以构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果这种酶的氨基酸序列是已知的，可以合成标记的寡核苷酸探针并且用于从生物体制备的基因组文库鉴定编码酶的克隆。或者，含有与另一种已知的酶基因同源的序列的标记寡核苷酸探针能被用来鉴定编码酶的克隆。在后一种情况下，使用低严格性的杂交和洗涤条件。
或者，通过向表达载体例如质粒插入基因组DNA片段，用得到的基因组DNA文库转化酶-阴性细菌，然后在含有酶底物(即磷脂或半乳糖脂)的琼脂上将转化的细菌铺板，从而使得表达这种酶的克隆被鉴定，这样能鉴定编码酶的克隆。
在另一个实施方案中，通过确定的标准方法，例如Beucage S.L.等(1981)Tetrahedron Letters 22，p 1859-1869描述的亚氨膦酸盐方法，或者Matthes等(1984)EMBO J.3，p 801-805描述的方法，可以合成制备编码酶的核苷酸序列。在亚氨膦酸盐方法中，在例如自动DNA合成仪中合成寡核苷酸，纯化，退火，连接并且在合适的载体中克隆。
核苷酸序列可以是根据标准技术连接合成的，基因组或cDNA来源(合适的)片段制备的混合的基因组和合成来源，混合的合成和cDNA来源，或混合的基因组和cDNA来源。各个连接片段相应于整个核苷酸序列的不同的部分。使用特异引物，例如US4,683,202或Saiki R K等(Science(1988)239，pp 487-491)描述的，通过聚合酶链式反应(PCR)也可以制备DNA序列。
核苷酸序列
本发明还包括编码具有这里定义的特定性质的酶的核苷酸序列。这里使用的术语″核苷酸序列″指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，其变体，同源物，片段和衍生物(例如其部分)。核苷酸序列可以是基因组或合成来源或重组来源，不管是以有义或反义链表示，它可以是双链或单链的。
与本发明相关的术语″核苷酸序列″包括基因组DNA，cDNA，合成DNA，和RNA。优选地，它意指编码本发明序列的DNA，更优选cDNA。
在优选的实施方案中，当与其天然相关的、也在它/它们的天然环境中的序列连接时，编码具有这里定义的特定性质的酶的核苷酸序列本身不包括其自然环境中的天然核苷酸序列。为了便于参考，我们应该称这种优选的实施方案为″非天然核苷酸序列″。这样说来，术语″天然核苷酸序列″意指天然环境中的并且当与其天然相关的整个启动子操作连接时，该启动子也在其天然环境中的整个核苷酸序列。因此，其天然生物体中的核苷酸序列能表达本发明的酶，但是其中核苷酸序列不处于那种生物体中与其天然相关的启动子的控制下。
优选地，所述酶不是天然酶。就此来说，术语″天然酶″意指在其天然环境中的并且当其天然核苷酸序列表达它时的整个酶。
典型地，应用重组DNA技术制备编码具有这里定义的特定性质的酶的核苷酸序列(即重组DNA)。但是，在本发明的另一个实施方案中，应用本领域公知的化学方法(参见Caruthers MH等(1980)Nuc AcidsRes Symp Ser 215-23和Horn T等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser225-232)，能合成全部或部分的核苷酸序列。
氨基酸序列
本发明还涉及具有这里定义的特定性质的酶的氨基酸序列。
如这里使用的，术语″氨基酸序列″是术语″多肽″和/或术语″蛋白质″的同义词。在某些情况下，术语″氨基酸序列″是术语″肽″的同义词。在某些情况下，术语″氨基酸序列″是术语″酶″的同义词。
氨基酸序列可以从合适的来源制备/分离，或者可以合成制备或者可以通过重组DNA技术制备。
合适地，通过标准技术可以从这里教导的分离的酶获得氨基酸序列。
测定来自分离的酶的氨基酸序列的一种合适的方法如下：
可以将纯化的酶冷冻干燥，并且将100微克冷冻干燥的物质溶解于50微升的8M脲和0.4M碳酸氢铵，pH8.4的混合物中。通入氮气并且加入5微升45mM二硫苏糖醇之后，溶解的蛋白质可以在500℃下变性和还原15分钟。冷却至室温之后，可以加入5微升的100mM碘代乙酰胺，在室温避光氮气下将半胱氨酸残基衍生化15分钟。
向上述反应混合物加入135微升的水和5H1水中5微克内源蛋白酶Lys-C，然后在37℃下氮气中进行24小时消化作用。
通过在VYDAC C18柱(0.46×15cm；10ym；The Separation Group，加利福尼亚，USA)上使用溶剂A：0.1t TFA水溶液和溶剂B：0.1k TFA乙腈水溶液可以分离得到的肽。在N-末端测序之前，使用相同的溶剂体系在Develosil C18柱子上可以将选择的肽再进行层析。使用Applied Biosystems 476A测序仪使用脉冲液体快速循环，根据厂商说明(Applied Biosystems，加利福尼亚，USA)可以进行测序。
变体/同源物/衍生物
本发明还涉及具有这里定义的特定性质的酶的任何氨基酸序列的变体，同源物和衍生物的用途，或者编码这种酶的任何核苷酸序列的用途。这里，术语″同源物″意指与本发明氨基酸序列和本发明核苷酸序列具有一定同源性的实体，这里，术语″同源性″等同于″同一性″。
变体，同源物和衍生物氨基酸序列和/或核苷酸序列应该提供和/或编码保留酶的功能活性和/或加强酶的活性的酶。
在本发明上下文中，同源序列包括与主体序列具有至少75，85或90％同一性，优选具有至少95或98％同一性的氨基酸序列。典型地，同源物包括和主体氨基酸序列一样的活性位点等。虽然同源性也可以被认为是相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)，在本发明上下文中优选以术语序列同一性表达同源性。
在本发明上下文中，同源序列包括与编码本发明的酶的核苷酸序列(主体序列)具有至少75，85或90％同一性，优选具有至少95或98％同一性的核苷酸序列。典型地，同源物包括和主体序列一样的编码活性位点等的序列。虽然同源性也可以被认为是相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)，在本发明上下文中优选以术语序列同一性表达同源性。
通过肉眼，或者更通常地，借助容易获得的序列比较程序，能进行同源性比较。这些商业上可获得的计算机程序能计算两个或多个序列之间的同源性百分数。
可以对连续的序列计算同源性百分数，即一个序列与另一个序列比对，并且将一个序列中每一个氨基酸直接与另一个序列的相应的氨基酸相比较，一次一个残基。这称为″没有空位″的比对。典型地，这样的没有空位的比对只对相对小数目的残基进行。
虽然这是非常简单和一致的方法，但是它没有考虑，例如，在本来应该相同的序列对中，一个插入或缺失将引起后面的氨基酸残基无法比对，因此当进行全局比对时可能导致同源性百分数的大大降低。因此大多数序列比较方法被设计成产生最佳比对，考虑到可能的插入和缺失，而不对总的同源性评分过度罚分。这通过在序列比对中插入″空位″来实现，试图将局部同源性最大化。
但是，这些更复杂方法将“空位罚分”分配给比对中存在的各个空位，这样，对于相同数目的相同氨基酸，空位尽可能少的序列比对-反映两个被比较序列之间的更高的相关性-将获得比具有很多空位的那个更高的分。一般使用″亲族空位损耗″，它使一个空位的存在担负相对高的损耗并且对这个空位中后续的残基有较小的罚分。这是最常使用的空位评分系统。高空位罚分当然产生具有较少空位的最佳化比对。大多数比对程序使得空位罚分被改变。但是，当使用这样的软件用于序列比较时，优选使用默认值。例如，当使用GCG Wisconsin Bestfit软件包时，对于一个空位对于氨基酸序列的默认空位罚分是-12，对于每一个延伸是-4。
因此，计算最大同源性百分数首先要求产生一个最佳比对，考虑到空位罚分。进行这样的比对的合适的计算机程序是GCG WisconsinBestfit软件包(Devereux et al 1984 Nuc.Acids Research 12p387)。能进行序列比较的其它软件的例子包括但不限于，BLAST软件包(参见Ausubel等，1999 Short Protocols in Molecular Biology，第四版-18章)，FASTA(Altschul等1990 J.Mol.Biol.403-410)和GENEWORKS程序组比较工具。BLAST和FASTA都可进行脱机和联机检索(参见Ausubel等1999，7-58至7-60页)。但是，对于一些申请，优选使用GCG Bestfit程序。一种新工具，称作BLAST2Sequences也可用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMS MicrobiolLett 1999 174(2)：247-50；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1)：187-8和tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)。
虽然用同一性能测定最终的同源性百分数，比对方法本身一般不以全部-或-零对比较为基础。取而代之的是，通常使用量化相似性评分矩阵，其以化学相似性或进化距离为基础对逐对进行的比较评分。通常使用的这样一个矩阵的例子是BLOSUM62矩阵-BLAST程序组程序的默认矩阵。GCG Wisconsin程序通常使用公用默认值或者如果提供的话，使用常规符号比较表(更详细信息参见使用者手册)。对于一些应用，对于GCG软件包优选使用公用默认值，或者在其它软件情况下，使用默认值矩阵，例如BLOSUM62。
一旦软件产生最佳比对，就可能计算同源性百分数，优选序列同一性百分数。软件一般作为序列比较的一部分做这些工作并且产生数字结果。
序列还可以有氨基酸残基的缺失，插入或取代，这产生沉默改变并且产生功能等价物质。以残基的极性，电荷，溶解性，疏水性，亲水性和/或两亲性质为基础可以精确进行氨基酸取代作用，只要保留该物质的第二结合活性。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值带有不带电荷的极性首基的氨基酸包括亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，甘氨酸，丙氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，苯丙氨酸，和酪氨酸。
例如根据下面的表可以进行保守取代。第二栏中相同格中优选第三栏相同行中的氨基酸可以彼此取代：
本发明还涉及可以发生的同源取代(取代和置换在这里都用来指用另一个残基交换一个存在的氨基酸残基)，即类似与类似取代作用，例如碱性取代碱性，酸性取代酸性，极性取代极性等。也可以发生非同源取代，即用一类残基取代另一类或者涉及包含非天然氨基酸例如鸟氨酸(下文称作Z)，二氨基丁酸鸟氨酸(下文称作B)，正亮氨酸鸟氨酸(下文称作O)，吡啶基丙氨酸，噻吩基丙氨酸，萘基丙氨酸和苯基甘氨酸。
非天然氨基酸也可以进行置换，包括；α*和α二取代*氨基酸，N-烷基氨基酸*，乳酸*，天然氨基酸的卤化物衍生物，例如三氟酪氨酸*，p-Cl-苯基丙氨酸*，p-Br-苯基丙氨酸*，p-I-苯基丙氨酸*，L-烯丙基-甘氨酸*，β-丙氨酸*，L-α-氨基丁酸*，L-γ-氨基丁酸*，L-α-氨基异丁酸*，L-ε-氨基己酸#，7-氨基庚酸*，L-蛋氨酸砜#*，L-正亮氨酸*，L-正缬氨酸*，p-硝基-L-苯丙氨酸*，L-羟基脯氨酸#，L-硫代脯氨酸*，苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物，例如4-甲基-Phe*，五甲基-Phe*，L-Phe(4-氨基)#，L-Tyr(甲基)*，L-Phe(4-异丙基)*，L-Tic(1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸)*，L-二氨基丙酸#和L-Phe(4-苄基)*。符号*用于上面讨论的目的(与同源取代或非同源取代相关)，表明衍生物的疏水性，而#被用来指明衍生物的亲水性，#*指两亲特性。
变体氨基酸序列可以包括序列的任何两个氨基酸残基之间可以插入的合适的间隔基团，除了氨基酸间隔基团如甘氨酸或β-丙氨酸残基之外还包括烷基如甲基，乙基或丙基。本领域技术人员非常明白变异的其它形式，包括类胨形式中存在一个或多个氨基酸残基。为了避免疑问，″类肽(peptoid)形式″用来指变体氨基酸残基，其中α-碳取代基在残基的氮原子上而不是α-碳原子上。制备类肽形式的肽的方法是本领域公知的，例如Simon RJ等，PNAS(1992)89(20)，9367-9371和Horwell DC，Trends Biotechnol.(1995)13(4)，132-134。
编码具有这里定义的特定性质的酶的核苷酸序列其中可以包括合成的或修饰的核苷酸。对寡核苷酸的多种各种各样类型的修饰是本领域公知的。这些包括磷酸甲酯和硫代磷酸酯主链和/或在分子的3′和/或5′端加吖啶或多赖氨酸链。为了本发明的目的，明白这里描述的核苷酸序列可以用本领域可获得的任何方法加以修饰。为了提高核苷酸序列的体内活性或有效期，可以进行这样的修饰作用。
本发明还涉及与这里讨论的序列互补的核苷酸序列或者其任何衍生物，片段或衍生物的用途。如果序列与其片段互补，则那个序列能被用作鉴定其它生物体等中相似的编码序列的探针。
与本发明的序列的同源性不是100％但是落在本发明范围中的多核苷酸能以很多方式获得。例如，通过探测一定个体范围例如来自不同人群范围的个体制得的DNA文库可以获得这里描述的序列的其它变体。另外，可以获得其它病毒/细菌，或细胞同源物，特别是哺乳动物细胞(例如大鼠，小鼠，牛和灵长目动物细胞)中发现的细胞同源物，并且这样的同源物及其片段一般能选择性地与序列表中所示序列杂交。通过探测其它动物物种制成的cDNA文库或者来自其它动物物种的基因组DNA文库，并且用包括所附的序列表中任何一个序列的全部或部分的探针在中等至高严格性条件下探测这样的文库。类似的条件适用于获得本发明的多肽或核苷酸序列的物种同源物和等位变体。
利用简并PCR也可以获得变体和菌株/物种同源物，所述PCR使用对编码本发明序列中保守氨基酸序列的变体或同源物中的靶序列设计的引物。通过例如比对几种变体/同源物的氨基酸序列能预知保守序列。使用本领域公知的计算机软件能进行序列对比。例如广泛使用GCGWisconsin PileUp程序。
简并PCR中使用的引物包含一个或多个简并位置，并且在低于用于使用已知序列的单一序列引物克隆序列的那些严格性条件下使用。
或者，通过对表征的序列的定点诱变可以获得这样的多核苷酸。在例如要求沉默密码子序列改变以对表达这个多核苷酸序列的特定宿主细胞优化密码子偏好的情况下这是有用的。为了引入限制性酶识别位点，或者为了改变多核苷酸编码的多肽的性质或功能，其它序列改变可以是所期望的。
本发明的多核苷酸(核苷酸序列)可以用来制备引物，例如PCR引物，用于供选择的扩增反应的引物，例如通过常规方法使用放射性或非放射性标记物标记的带有暴露标记物的探针，或者多核苷酸可以被克隆到载体中。这样的引物，探针和其它片段长度至少是15，优选至少20，例如至少25，30或40个核苷酸，并且包括在这里使用的术语本发明的多核苷酸的范围内。
根据本发明的多核苷酸例如DNA多核苷酸和探针可以重组制备，合成制备，或者通过本领域技术人员可获得的任何方法制备。也可以通过标准方法克隆。
一般情况下，通过合成方法制备引物，包括一次一个核苷酸逐步制备期望的核酸序列。用自动化技术完成该方法的技术是本领域容易获得的。
一般利用重组方法制备更长的多核苷酸，例如利用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术。这涉及制备期望克隆的脂质靶向序列区侧翼引物对(例如大约15至30个核苷酸)，使引物接触从动物或人细胞获得的mRNA或cDNA，在使期望的区扩增的条件下进行聚合酶链式反应，分离扩增的片段(例如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)和回收扩增的DNA。可以设计引物使其包含合适的限制性酶识别位点，这样能将扩增的DNA克隆到合适的克隆载体中。
杂交
本发明还包括与本发明的序列互补的序列或者能与本发明的序列或与本发明的序列互补的序列杂交的序列。
这里使用的术语″杂交″应该包括″核酸链通过碱基配对与互补链连接的方法″以及实施聚合酶链式反应(PCR)技术的扩增方法。
本发明还涉及能与与这里讨论的主题序列互补的序列或者其任何衍生物，片段或衍生物杂交的核苷酸序列的用途。
术语″变体″也包括与能与这里讨论的核苷酸序列杂交的序列互补的序列。
杂交条件以核苷酸结合复合体的解链温度(Tm)为基础，有关这一点的教导见Berger和Kimmel(1987，Guide to Molecular CloningTechniques，Methods in Enzymology，Vol.152，Academic Press，San Diego CA)，并且如下文解释的带来定义″严格性″。
最大严格性一般发生在大约Tm-5℃(低于探针的Tm 5℃)；高严格性低于Tm大约5℃至10℃；中等严格性低于Tm大约10℃至20℃；低严格性低于Tm大约20℃至25℃。本领域技术人员明白，最大严格性杂交能被用来鉴定或检测相同的核苷酸序列，而中等(或者低)严格性杂交能被用来鉴定或检测相似或相关的多核苷酸序列。
优选地，术语″变体″包括能在高严格性条件或中等高严格性条件下与编码具有这里定义的特定性质的酶的核苷酸序列杂交的序列互补的序列。
更优选地，术语″变体″包括能在高严格性条件(例如65℃和0.1×SSC{1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M Na-柠檬酸pH7.0})下与编码具有这里定义的特定性质的酶的核苷酸序列杂交的序列互补的序列。
本发明还涉及能与这里讨论的核苷酸序列(包括这里讨论的那些的互补序列)杂交的核苷酸序列。
本发明还涉及能与这里讨论的核苷酸序列(包括这里讨论的那些的互补序列)杂交的序列的互补核苷酸序列。
本发明范围内还包括能在中等至最大严格性条件下与这里讨论的核苷酸序列杂交的多核苷酸序列。
在优选的一方面，本发明包括能在严格条件(例如50℃和0.2×SSC)下与这里讨论的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，或其互补序列。
在更优选的一方面，本发明包括能在高严格性条件(例如65℃和0.1×SSC)下与这里讨论的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，或其互补序列。
定点诱变
一旦分离了编码酶的核苷酸序列和/或酶的氨基酸序列，为了制备具有本发明的期望的性质的酶或者为了增强酶的天然性质，期望对序列进行突变。
使用合成的寡核苷酸可以引入突变。这些寡核苷酸包含期望的突变位点侧翼的核苷酸序列。
Morinaga等(Biotechnology(1984)2，p646-649)公开了合适的方法，其中在携带酶基因的载体中产生单链DNA空位，即编码酶的序列。然后将携带期望的突变的合成的核苷酸退火成单链DNA的同源部分。然后用DNA聚合酶I(Klenow片段)补充残留的空位，并且使用T4连接酶连接构建体。其它合适的方法包括Sarkar G & Sommer S.S.(1990 BioTechniques I 8，404-407)的mega prima诱变方法和Papworth等(1985 Nucleic.Acids Res.13：8765-8785)的QuickChange方法。
US4,760,025公开了通过进行盒的较小的改变引入编码多个突变的寡核苷酸。但是，通过上述Morinaga方法甚至一次能引入更多个突变，因为能引入各种长度的多个寡核苷酸。
Nelson和Long(Analytical Biochemistry(1989)，180，p147-151)描述了向编码酶的核苷酸序列引入突变的另一种方法。该方法包括包含通过使用化学合成的DNA链作为PCR反应中的一个引物引入期望的突变的PCR片段的3-步骤产生法。从PCR-制备的片段，通过用限制性内切酶裂解可以分离携带突变的DNA片段并且再次掺入到表达质粒中。
此外，Sierks等(Protein Eng(1989)2，621-625和Protein Eng(1990)3，193-198)描述了对曲霉葡糖淀粉酶的定点诱变。
合适地，可以对编码脂肪酶(E.C.3.1.1.3)或脂解酰基水解酶(E.C.3.1.1.26)的核苷酸序列在盖区和/或活性位点附近和/或在氨基酸序列的C-末端进行定点诱变。
优选地，可以对编码脂肪酶(E.C.3.1.1.3)或脂解酰基水解酶(E.C.3.1.1.26)的核苷酸序列在活性位点附近进行定点诱变以改变活性位点周围表面的亲水性。
随机诱变
能进行易错PCR，例如通过使用CLONTECH提供的DiversifyTM PCR随机诱变试剂盒。
定域随机诱变
可以合成诱变引物(寡核苷酸)，它相应于要诱变的DNA序列的部分，除了相应于要被诱变的氨基酸密码子的核苷酸。该引物，在5′和3′端，包含相应于要诱变的序列周围的序列的核苷酸。在要诱变的密码子中，各位置存在不同百分比的四种不同的核苷酸，对密码子给出选择的位置中不同氨基酸的可能性。
接着，可以在使用合适的相反引物的PCR反应中使用得到的诱变引物。可以克隆得到的PCR片段，可能是在一些另外的修饰之后，克隆到包含感兴趣的基因的编码区的其余部分的合适的载体中。
合适地，可以对编码脂肪酶(E.C.3.1.1.3)或脂解酰基水解酶(E.C.3.1.1.26)的核苷酸序列在被盖区和/或接近活性位点和/或在氨基酸序列的C-末端进行定域随机诱变。
优选地，可以对编码脂肪酶(E.C.3.1.1.3)或脂解酰基水解酶(E.C.3.1.1.26)的核苷酸序列在活性位点附近进行定域随机诱变以改变活性位点周围表面的亲水性。
酶的表达
编码具有这里定义的特定性质的酶的核苷酸序列能被插入到重组能复制的载体中。载体可以被用来在相容的宿主细胞中和/或从相容的宿主细胞复制和以酶形式表达核苷酸序列。使用包括启动子/增强子和其它表达调节信号的调控序列可以控制表达。可以使用原核细胞启动子和在真核细胞中起作用的启动子。可以使用组织特异或刺激特异启动子。也可以使用包括来自上述两个或多个不同的启动子的序列元件的嵌合启动子。
根据使用的序列和/或载体，可以分泌宿主重组细胞通过核苷酸序列表达而产生的酶或者可以包含在胞内。可以设计带有指导物质编码序列通过特定原核或真核细胞膜分泌的信号序列的编码序列。
表达载体
术语″表达载体″意指能体内或体外表达的构建体。
优选地，在生物体的基因组中掺入表达载体。术语″掺入″优选包括向基因组中稳定掺入。
优选地，本发明的载体包括根据本发明的构建体。或者另一种表达是，优选地，编码具有这里定义的特定性质的酶的核苷酸序列存在于载体中，并且其中核苷酸序列与调节序列操作连接，这样调节序列能提供合适的宿主生物体对核苷酸序列的表达，即载体是表达载体。
本发明的载体可以如下所述被转化到合适的宿主细胞中，提供具有这里定义的特定性质的多肽或酶的表达。因此，另一方面，本发明提供用于根据本发明的接下来的用途的多肽的制备方法，包括在提供编码多肽的编码序列的载体表达的条件下培养用如上所述表达载体转化或转染的宿主细胞，并且回收表达的多肽。
载体可以是例如，质粒，病毒或噬菌体载体，其中含有复制来源，任选地，含有用于表达所述多核苷酸的启动子，和任选地含有启动子的调节序列。载体的选择经常取决于要将它引入其中的宿主细胞。
载体可以包含一个或多个可选择标记基因。用于工业微生物的最合适的选择系统是选择标记物组形成的不要求在宿主生物体中突变的那些。合适的选择标记物可以是来自枯草芽孢杆菌(B.Subtilis)或地衣芽孢杆菌(B.Licheniformis)的dal基因，或者带来抗生素抗性例如氨苄西林，卡那霉素，氯霉素或四环素抗性的那种。另外的选择标记物可以是曲霉选择标记物，象amdS，argB，niaD和sC，或者使潮霉素抗性提高的标记物。其它真菌选择标记物的例子是ATP合成酶，亚基9(oliC)，乳清酸核苷-5′-磷酸-脱羧酶(pvrA)，腐草霉素和苯菌灵抗性(benA)的基因。非真菌选择标记物的例子是细菌G418抗性基因(这也可以在酵母中使用，但是不能在丝状真菌中使用)，氨苄西林抗性基因(大肠杆菌)，新霉素抗性基因(芽孢杆菌)和大肠杆菌uidA基因，它编码β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)。其它合适的选择标记物包括来自枯草芽孢杆菌(B.Subtilis)或地衣芽孢杆菌(B.Licheniformis)的dal基因。或者，可以通过共同转化完成选择(如WO91/17243所述)。
可以体外使用载体，例如用于制备RNA或者用于转染或转化宿主细胞。
因此，编码具有这里定义的特定性质的酶的核苷酸序列能被掺入到重组载体(一般是能复制的载体)，例如克隆或表达载体中。载体可以被用来在相容宿主细胞中复制核酸。因此，在另一个实施方案中，本发明提供通过将编码这样一种酶的核苷酸序列导入能复制的载体中，将载体导入相容宿主细胞中，并且在使载体复制的条件下生长宿主细胞，来制备偏码具有这里定义的特定性质的酶的核苷酸序列的方法。可以从宿主细胞中回收载体。下面与表达载体相关描述合适的宿主细胞。
用来连接编码具有这里定义的特定性质的酶的本发明的DNA构建体和调节序列，和用来将它们插入到包含复制所必需的信息的合适的载体中的方法是本领域技术人员公知的(例如参见Sambrook等Molecular Cloning：A laboratory Manual，第二版(1989))。
载体可以进一步包含能让载体在所研究的宿主细胞中复制的核苷酸序列。这样的序列的例子是质粒pUC19，pACYC177，pUB110，pE194，pAMB1和pIJ702的复制起点。
调节序列
在一些应用中，编码具有这里定义的特定性质的酶的核苷酸序列可以与例如通过选择的宿主细胞提供核苷酸序列表达的调节序列连接。作为举例，本发明涉及包含与这样的一个调节序列操作连接的本发明的核苷酸序列的载体，即载体是表达载体。
术语″操作连接″指一种并置，其中描述的成分是使得它们以它们想要的方式发挥功能的关系。与编码序列″操作连接″的调节序列是以这样的一种方式连接的，使得在与调控序列相容的条件下实现编码序列的表达。
术语″调节序列″包括启动子和增强子和其它表达调节信号。
术语″启动子″以本领域通常的意义使用，例如一种RNA聚合酶结合位点。
编码具有这里定义的特定性质的酶的核苷酸序列的增强表达也可以通过异源调节区，例如启动子，分泌前导序列和终止子区的选择来实现，它们提高表达，并且如果期望，提高感兴趣的蛋白质从选择的表达宿主的分泌水平和/或提供具有这里定义的特定性质的酶的表达的可诱导控制。在真核细胞中，聚腺苷酸化序列可以与编码这种酶的核苷酸序列操作连接。
优选地，本发明的核苷酸序列可以与至少一个启动子操作连接。
除编码具有这里定义的特定性质的酶的核苷酸序列的编码基因的天然启动子之外，其它启动子可以被用来指导酶的表达。可以选择启动子指导本发明的核苷酸序列在期望的表达宿主中表达的效率。
在另一个实施方案中，可以选择组成型启动子来指导期望的核苷酸序列的表达。这样一种表达构建体可以提供另外的好处，因为它不需要在含有诱导底物的培养基中培养表达宿主。
优选在真菌表达宿主中使用的强组成型和/或诱导型启动子的例子是可以从木聚糖酶(xlA)，肌醇六磷酸酶，ATP-合成酶，亚基9(oliC)，丙糖磷酸异构酶(tpi)，醇脱氢酶(AdhA)，α-淀粉酶(amy)，淀粉葡糖苷酶(AG-来自glaA基因)，乙酰胺酶(amdS)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpd)启动子的真菌基因的那些。用于在真菌宿主中转录的有用启动子的其它例子是从米曲霉(A.oryzae)TAKA淀粉酶，来自啤酒糖酵母(S.cerevisiae)的TPI(丙糖磷酸异构酶)启动子(Alber等(1982)J.Mol.Appl.Genet.1，p419-434)，Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶，黑色曲霉(A.Niger)中性α-淀粉酶，黑色曲霉酸稳定α-淀粉酶，黑色曲霉葡糖淀粉酶，Rhizomucor miehei脂肪酶，米曲霉碱性蛋白酶，米曲霉丙糖磷酸异构酶或构巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶的编码基因衍生的那些。
强酵母启动子的例子是从醇脱氢酶，乳糖酶，3-磷酸甘油酸酯激酶和丙糖磷酸异构酶的基因可获得的那些。
强细菌启动子的例子是α-淀粉酶和SP02启动子以及来自胞外蛋白水解酶基因的启动子。指导核苷酸序列特别在细菌宿主中转录的其它合适的启动子的例子是大肠杆菌的lac操纵子的启动子，天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂酶基因dagA启动子，地衣型芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)的启动子，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)麦芽淀粉酶基因(amyM)的启动子，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)α-淀粉酶(amyQ)的启动子，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)xylA和xylB基因的启动子。
也可以使用杂交启动子来改善表达构建体的诱导型调节。
启动子可以另外包括保证或提高在合适的宿主中表达的特性。例如，这些特性可以是保守区例如Pribnow盒或TATA盒。启动子甚至可以包含其它序列来影响(例如保持，增强，降低)本发明的核苷酸序列的表达水平。例如，合适的其它序列包括Shl-内含子或ADH内含子。其它序列包括可诱导元件-例如温度，化学，光或胁迫可诱导元件。还有，可以存在增强转录或翻译的合适的元件。后一种元件的例子是TMV5′信号序列(参见Sleat 1987 Gene 217，217-225和Dawson 1993Plant Mol.Biol.23：97)。
构建体
术语″构建体″-它也是术语″偶联物″，″盒″和″杂交体″的同义词-包括直接或间接地与启动子连接的用于本发明用途的具有这里定义的特定性质的酶的编码核苷酸序列。间接连接的一个例子是提供合适的间隔基团，例如内含子序列，象Shl-内含子或ADH内含子，位于启动子和本发明的核苷酸序列中间。与本发明相关的术语″融合″也是一样，包括直接或间接连接。在一些情况下，这些术语不包括普通与野生型基因启动子相关的编码蛋白质的核苷酸序列的天然组合，也不包括它们两者都是自然状态下的情况。
构建体甚至可以包含或表达标记物，它使得在被转移到其中的例如细菌，优选芽孢杆菌属，象枯草芽孢杆菌，或植物中基因构建体被选择。可以使用存在的各种标记物，象例如编码甘露糖-6-磷酸异构酶(特别是对于植物)的那些或者提供抗生素抗性的那些标记物-例如提供抗G418，潮霉素，博莱霉素，卡那霉素和庆大霉素抗性。
对于一些应用，优选地，构建体至少包括与一个启动子操作连接的编码具有这里定义的特定性质的酶的核苷酸序列的构建体。
宿主细胞
与本发明相关的术语″宿主细胞″-包括包含编码具有这里定义的特定性质的酶的核苷酸序列或如上所述表达载体并且在具有这里定义的特定性质的酶的重组制备中使用的任何细胞。
因此，本发明的另一个实施方案提供用表达具有这里定义的特定性质的酶的核苷酸序列转化或转染的宿主细胞。优选地，用于核苷酸序列的复制和表达的载体中携带所述核苷酸序列。选择细胞使其与所述载体相容，并且可以是例如原核细胞(例如细菌)，真菌，酵母或植物细胞。
革兰氏阴性细菌大肠杆菌被广泛用作异源基因表达的宿主。但是，大量异源蛋白质有在细胞内积累的倾向。接着从大量大肠杆菌胞内蛋白质纯化期望的蛋白质有时是困难的。
与大肠杆菌相反，来自芽孢杆菌属的革兰氏阳性菌，象枯草芽孢杆菌(B.Subtilis)，地衣芽孢杆菌(B.Licheniformis)，迟缓芽孢杆菌(B.Lentus)，短芽孢杆菌(B.Brevis)，嗜热脂肪芽孢杆菌(B.Stearothermophilus)，B.alkalophilus，解淀粉芽孢杆菌(B.Amyloliquefaciens)，凝结芽孢杆菌(B.Coagulans)，环状芽孢杆菌(B.Circulans)，灿烂芽孢杆菌(B.Lautus)，巨大芽孢杆菌(B.megaterium)，苏云金芽孢杆菌(B.Thuringiensis)，浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(S.Murinus)，也非常适合作为异源宿主，因为它们能将蛋白质分泌到培养基中。适合作为宿主的其它细菌可以是来自假单胞菌属的那些。
根据编码具有这里定义的特定性质的酶的核苷酸序列的性质，和/或对表达的蛋白质进一步处理的期望程度，真核细胞宿主例如酵母或其它真菌是优选的。一般情况下，酵母细胞比真菌细胞更优选，因为它们更容易操作。但是，一些蛋白质或者从酵母细胞中分泌少，或者在一些情况下处理不当(例如在酵母中超糖基化作用)。在这些情况下，应该选择不同的真菌宿主生物体。
合适的酵母生物体可以选自克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)，糖酵母属(Saccharomyces)或裂殖糖酵属(Schizosaccharomyces)，例如啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或汉逊氏酵母属(Hansenula)(UK专利申请No.9927801.2中公开)。
合适的丝状真菌可以是例如属于曲霉属的种例如米曲霉(Aspergillus oryzae)或黑曲霉(Aspergillus niger)的菌株，或者尖孢镰孢(Fusarium oxysporium)，禾谷镰孢(Fusariumgraminearum)(优选状态称作玉蜀黍赤霉(Gribberella zeae)，以前称作Sphaeria zeae，同义词是Gibberella roseum和Gibberellaroseum f.sp.Cerealis)，或硫色镰孢(Fusarium sulphureum)(优选状态称作虱状赤霉(Gibberella puricaris)，同义词是Fusariumtrichothercioides，杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)，接骨木镰孢(Fusarium sambucium)，玫瑰色镰孢(Fusarium roseum)和玫瑰色镰孢禾谷变种(Fusarium roseum var.graminearum)，Fusarium cerealis(与Fusarium crokkwellnse是同义词)或Fusarium venenatum的菌株。
作为举例，典型的表达宿主可以选自黑曲霉，黑曲霉tubigensis变种，黑曲霉awamori变种，棘孢曲霉(Aspergillus aculeatis)，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)，米曲霉(Aspergillus oryzae)，Trichoderma reesei，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，解淀粉芽孢杆菌(B.Amyloliquefaciens)，乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)，啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)和多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)。
根据赋予本发明的重组表达产物最佳生物学活性的需要，可以对翻译后修饰(例如十四烷酰化作用，糖基化作用，截短作用，lapidation和酪氨酸，丝氨酸或苏氨酸磷酸化作用)提供合适的宿主细胞例如酵母，真菌和植物宿主细胞的应用。
宿主细胞可以是蛋白酶或无蛋白酶的菌株。这可以是例如蛋白酶缺陷菌株，即带有称作″alp″缺失的碱性蛋白酶基因的米曲霉JaL125。WO97/35956中描述了这种菌株。
生物体
与本发明相关的术语″生物体″包括包含编码具有这里定义的特定性质的酶的核苷酸序列和/或从其中获得的产物的任何生物体。
合适的生物体包括原核细胞，真菌，酵母或植物。
与本发明相关的术语″转基因生物体″包括包含编码具有这里定义的特定性质的酶的核苷酸序列和/或从其中获得的产物，和/或其中启动子能使具有这里定义的特定性质的酶在生物体中表达的任何生物体。优选地，核苷酸序列被掺入到生物体的基因组中。
术语″转基因生物体″不包括当处于也存在于其天然环境中的它们的天然启动子的控制下时其自然环境中的天然核苷酸序列。
因此，本发明的转基因生物体包括包含编码具有这里定义的特定性质的酶的核苷酸序列之一或者其组合，这里定义的构建体，这里定义的载体，这里定义的质粒，这里定义的细胞，或者其产物的生物体。例如转基因生物体也可以包含在异源启动子的控制下编码具有这里定义的特定性质的酶的核苷酸序列。
宿主细胞/生物体的转化
如较早所指出的，宿主生物体可以是原核或真核生物体。合适的原核宿主的例子包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。有关原核细胞宿主的转化的教导在本领域有很多文献，例如参见Sambrook等(MolecularCloning：A Laboratory Manual，2nd edition，1989，Cold SpringHarbor Laboratory Press)和Ausubel等，Current Protocols inMolecular Biology(1995)，John Wiley & Sons，Inc。
如果使用原核宿主，则需要在转化之前例如通过去除内含子而适当修饰核苷酸序列。
在另一个实施方案中，转基因生物体可以是酵母。就这一点来说，酵母也被广泛用作异源基因表达的载体。啤酒糖酵母物种的工业应用有很长的历史，包括其用于异源基因表达。Goodey等(1987，YeastBiotechnology，D R Berry等编著，pp 401-429，Allen and Unwin，伦敦)和King等(1989，Molecular and Cell Biology of Yeasts，E F Walton和G T Yarronton，编著，pp 107-133，Blackie，Glasgow)综述了异源基因在啤酒糖酵母中的表达。
啤酒糖酵母非常适合异源基因表达有几个原因。首先，它对人是非致病性的，并且它不能产生某些内毒素。其次，它有很长的的安全使用历史，伴随各种目的商业开发的几个世纪。这使得公众广泛接受。第三，对生物体投入的大量商业使用和研究产生有关啤酒糖酵母的遗传学和生理学以及大规模发酵特征的知识积累。
E Hinchcliffe E Kenny(1993，″Yeast as a vehicle for theexpression of heterologous genes″，Yeasts，Vol 5，Anthony HRose和J Stuart Harrison，编著，第二版，Academic Press Ltd.)作出了啤酒糖酵母中异源基因表达和基因产物分泌的原理综述。
几种类型的酵母载体是可获得的，包括整合载体，它要求为了它们的维持的宿主基因组重组，和自主复制质粒载体。
为了制备转基因糖酵母，通过在为在酵母中表达而设计的构建体中插入核苷酸序列来制备表达构建体。已经开发出用于异源表达的几种类型的构建体。构建体包含与本发明的核苷酸序列融合的在酵母中有活性的启动子，通常使用酵母来源的启动子，例如GAL1启动子。通常使用酵母来源的信号序列，例如编码SUC2信号肽的序列。在酵母中有活性的终止子在表达系统末端。
对于酵母的转化，已经开发出几种转化程序。例如，根据Hinnen等(1978，Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe USA 75，1929)；Beggs，JD(1978，Nature，London，275，104)；和Ito，H等(1983，J Bacteriology 153，163-168)的教导能制备根据本发明的转基因酵母。
使用各种选择标记物选择转化的酵母细胞。用于转化的标记物中有很多营养缺陷标记物，象LEU2，HIS4和TRP1，和显性抗生素抗性标记物，象氨基糖苷抗生素标记物，例如G418。
通过公知的涉及原生质体形成和原生质体转化后细胞壁的再生的方法可以转化丝状真菌细胞。EP0 238 023中描述了曲霉属作为宿主微生物的用途。
另一种宿主生物体是植物。遗传修饰植物的构建的基本原理是在植物基因组中插入遗传信息，这样获得插入的遗传物质的稳定保持。现存几种插入遗传信息的技术，两个主要的原理是遗传信息的直接导入和通过使用载体系统导入遗传信息。在Potrykus(Annu Rev PlantPhysiol Plant Mol Biol[1991]42：205-225)和Christou(AgroFood-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)的文章中可以发现一般技术综述。对植物转化的其它教导可以参见EP-A-0449375。
可以在有益于编码的酶的制备和有利于从细胞和/或培养基中回收酶的条件下培养用核苷酸序列转化的宿主细胞。
用来培养细胞的培养基可以是适合所研究的宿主细胞生长并且获得酶的表达的任何常规培养基。合适的培养基可以从商家获得或者可以根据公开的内容制备(例如根据美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)目录的描述)。
重组细胞产生的蛋白质可以展示在细胞表面上。如果期望，并且本领域技术人员明白，可以将包含编码序列的表达载体设计为具有指导编码序列通过特定原核细胞膜或真核细胞膜分泌的信号序列。其它重组构建可以连接编码序列和编码有利于可溶蛋白质的纯化的多肽结构域的核苷酸序列(Kroll DJ等(1993)DNA Cell Biol 12：441-53)。
酶可以从宿主细胞中分泌，并且通过公知的方法方便地从培养基中回收，包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，和利用盐例如硫酸铵将培养基的蛋白质成分沉淀，接着使用色谱方法，例如离子交换色谱，亲和色谱等。
分泌物
经常期望酶从表达宿主中分泌到培养基中，在那里酶更容易被回收。根据本发明，以期望的表达宿主为基础可以选择分泌前导序列。在本发明中也可以使用杂交信号序列。
异源分泌前导序列的典型例子是真菌淀粉葡糖苷(AG)基因(glaA-18和24氨基酸型，例如来自曲霉属)，a-因子基因(酵母例如糖酵母属，克鲁维氏酵母属和汉逊氏酵母属)或α-淀粉酶基因(芽孢杆菌属)来源的那些。
融合蛋白
具有这里定义的特定性质的酶可以作为融合蛋白被生产出来，例如有助于其提取和纯化。融合蛋白配偶体的例子包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，6xHis，GAL4(DNA结合和/或转录激活结构域)和β-半乳糖苷酶。在融合蛋白配偶体和感兴趣的蛋白质序列之间插入允许去除融合蛋白序列的蛋白水解酶切位点也是方便的。优选地，融合蛋白不防碍蛋白质序列的活性。
融合蛋白可以包括与酶融合的抗原或抗原决定簇。在这个实施方案中，融合蛋白可以是包含可以作为提供免疫系统一般化刺激的佐剂的物质的非天然存在的融合蛋白。抗原或抗原决定簇可以与酶的氨基或羧基末端连接。
在本发明的另一个实施方案中，具有这里定义的特定性质的酶的氨基酸序列可以连接异源序列并编码融合蛋白。
实施例
现在只是作为举例来描述本发明，其中参考下面的附图：
图1，其说明天然-PAGE凝胶分析；
图2，其说明半乳糖脂(DGDG)酶谱；
图3，其说明SDS-PAGE凝胶；
图4，其说明生面团中豇豆LAH1的效果图；
图5，其说明用豇豆LAH处理过的生面团中半乳糖脂的HPLC分析图；
图6，其说明用豇豆LAH处理过的生面团中磷脂的HPLC分析图；
图7，其说明用豇豆LAH处理过的生面团中非极性脂类的GLC分析图；
图8，给出小面包照片，其中面包条14含有2％大豆油，面包条15含有2％大豆油+1.07单位/kg加入的豇豆LAH；
图9，给出小面包照片，其中面包条9是对照物；面包条10具有1.07单位/kg加入的豇豆LAH；面包条11具有1.07单位/kg豇豆LAH+0.1％加入的半乳糖脂；面包条12具有1.07单位/kg豇豆LAH+0.2％加入的半乳糖脂；和面包条13具有1.07单位/kg豇豆LAH+0.4％加入的半乳糖脂；
图10，给出小面包照片，其中面包条1是对照物；面包条2具有0.4％加入的DGDG；面包条3具有0.4％DGDG+0.4单位/g加入的豇豆LAH；和面包条4具有0.4单位/g豇豆LAH；
图11，给出从pYES2衍生的表达载体。去除pYES2的Gall启动子并且用组成型ADH启动子置换。通过啤酒糖酵母中体内重组掺入LipA。缩写：Amp，氨苄西林抗性基因；ADH3′，醇脱氢酶3′区；ADHp，醇脱氢酶基因启动子；bps，碱基对；CYC1，转录终止子；f1 ori，f1起点；Gallp，半乳糖基因启动子；LipA，来自塔宾曲霉(Aspergillustubigensis)的脂肪酶基因；MCS，多克隆位点；pMB1 ori，pUC来源的起点，ura3，基因编码尿嘧啶，2μ ori，2μ起点；
图12，给出利用这里描述的方法鉴定的来自豇豆的脂解酰基水解酶的Maldi-TOF谱；和
图13，给出VUPAT1的肽图谱(Matos等FEBS Letters 491(2001)188-192)。
材料和方法
酶：
纯化的豇豆脂类酰基水解酶(LAH)
来自小麦类囊体面粉的分离的膜结合的半乳糖脂酶：
丹麦面粉′Slvmel′nr.2001084
底物：
二半乳糖基甘油二酯，DGDG(55％纯)批次KGL01013，从LipidTechnologies Provider，Karlshamn，瑞典获得。
方法
豇豆脂解酰基水解酶(E.C.3.1.1.26)
植物材料
从豇豆中分离能水解糖脂和磷脂但是不能或基本上不能水解甘油三酯和/或1-甘油单酯的脂解酰基水解酶(LAH)。以Sahsah等(Biochemica et Biophysica Acta 1215(1994)66-73)描述的为基础的方法获得脂解酰基水解酶。另一种合适的方法可以是Matos等(FEBS Letters 491(2001)188-192)描述的方法。
从Morelos，Mexico获得豇豆豆子。植物在生长室内，在35×50cm(每个小盆大约50株植物)规格的小盆中，在温度和光控制条件下(22℃光照16小时和18℃黑暗8小时，相对空气湿度72％)，在Leca石上生长，并且用根据Ellfolk，Biochim.Biophys.Acta 192(1969)486-493(富含6mM硝酸钾)的矿物营养液浇灌。培养21天之后收获叶子。收获时植物有4-7个完全展开的成熟的叶子和3-8个嫩叶。
从叶子中提取脂解酰基水解酶
将215g冷冻在液氮中的新鲜叶子在工业混合机中均匀化，并且使用工业混合机(混合3分钟)用500ml的5mM TRIS-缓冲液(pH7.0)提取。以15000g离心20分钟去除不溶性物质。得到的上清液最后通过0.45μm过滤器过滤(收集605ml粗提取物)。
脂解酰基水解酶的纯化
步骤1.超滤
使用50kDa Amicon超滤装置实施该步骤。收集122ml浓缩粗提取物。
步骤2.硫酸铵沉淀
向粗提取物中加入固体硫酸铵(68.5g)达到80％饱和的最终浓度。室温(25℃)下将混合物搅拌60分钟(25C)。以15000g离心20分钟收集沉淀的蛋白质。将沉淀物再溶解于30ml的20mM TEA缓冲液(pH7.3)中。以15000g离心20分钟去除不溶性物质。
步骤3.脱盐(GFC)
在用20mM TEA(pH7.3)平衡过的Sephadex G-25柱子(5×25cm，Pharmacia，瑞典)上将上清液脱盐，流速15ml/min。合并具有半乳糖脂酶活性(蛋白质峰)的级分(100ml)。
步骤4.离子交换色谱(IEC)
然后将脱盐的样品施加到用20mM TEA(pH7.3)平衡过的Q-Sepharose Fast Flow(5×6cm，Pharmacia，瑞典)，流速6ml/分钟。为了去除没有结合的蛋白质，用250ml的相同缓冲液洗涤柱子，用相同缓冲液中0-0.6M NaCl线性梯度洗脱出结合的蛋白质。收集16ml级分并且测定半乳糖脂酶活性。合并具有半乳糖脂酶活性(蛋白质峰)的级分(128ml)。
步骤5.超滤
根据步骤1所述实施该步骤。
收集16ml脱盐/浓缩样品(Vmax：5.6mOD/分钟或0.010U/ml)。
使用该步骤得到的样品进行烘焙试验。
步骤6.离子交换色谱(IEC)
然后将脱盐/浓缩的样品(11ml)施加到用和步骤4相同的缓冲液平衡过的Poros Q10(0.5×5cm，Applied Biosystem，USA)，流速1.5ml/分钟。用相同缓冲液中0-0.65M NaCl线性梯度洗脱出结合的蛋白质。收集1.5ml级分并且测定半乳糖脂酶活性。合并具有半乳糖脂酶活性的级分(6ml)。
豇豆脂解酰基水解酶的表征
SDS-PAGE分析，纯度和分子量的测定：
将来自IEC(步骤6)的纯化的脂解酰基水解酶施加给凝胶(NU-PAGE，4-12％，MES-缓冲液，Novex，USA)，然后将凝胶考马斯染色。凝胶分析表明几个泳带的存在(参见图1)。试图利用几种色谱技术进一步纯化脂解酰基水解酶，例如凝胶过滤色谱，疏水相互作用色谱，色谱聚焦，等，没有提高脂解酰基水解酶的纯度。
天然PAGE之后脂解酰基水解酶的分子量测定和电洗脱：
根据Sahsah等(Biochim.Biophys.Acta 1215(1994)66-73从豇豆中纯化脂解酰基水解酶。然后将扩散洗脱的脂解酰基水解酶进行SDS-PAGE凝胶分析。将凝胶考马斯蓝染色。凝胶显示57和84kDa两个主要泳带(参见图3)。
应用下面的程序使该制备产物进行胰蛋白酶消化：
1.加入50微升的0.4M碳酸氢铵缓冲液pH8.1中的8M脲(每50毫升24.04g脲，1.581g碳酸氢铵)。
2.通入氮气并且在50℃下温育5分钟。
3.加入5微升的50mM DTT(8mg/ml水)。
4.充分混合，通入氮气并且在50℃下温育15分钟。
5.冷却至室温。
6.加入5微升100mM碘代乙酰胺(19mg/ml水)。
7.充分混合，通入氮气并且在室温下避光温育15分钟。
8.加入140微升水，充分混合并且以1∶25(胰蛋白酶贮存在20℃下，0.1％TFA中1微克/微升)加入胰蛋白酶。
9.通入氮气并且在37℃下温育过夜。
10.通过在-20℃下冷冻终止反应。
11.使用C18柱通过R.P.相HPLC回收肽。
使用ZipTipTM C18脱盐管尖进行消化后肽筛选：
A.通过吸入4×10微升甲醇使管尖湿润。
B.通过用5×10微升0.1％T.F.A.水溶液平衡管尖。
C.通过吸取20×蛋白质消化溶液结合肽。
D.通过用10×10微升0.1％ T.F.A.水溶液洗涤去除盐。
E.用60％乙腈/水中0.1％ T.F.A.中2微升的10mg/ml α-氰基-4-羟基肉桂酸直接将肽洗脱到Maldi-TOF靶平板上。
F.使用Voyage DE Maldi-TOF质谱仪测定肽的分子量。
图12给出Maldi-TOF分析的结果。
VUPAT1的理论肽图谱(参见图13)(如Matos等FEBS Letters 491(2001)188-192中的教导)和对这里获得的来自豇豆的脂解酰基水解酶的试验获得的肽图谱之间的比较表明，这里纯化的脂解酰基水解酶是与Matos等教导的那种不同的蛋白质。SDS-Page测定的分子量也证明了这一点。在该项研究中，与Sahsah等报道的40kDa分子量相反，测得了57和84kDa的分子量。
来自小麦叶子类囊体的膜结合脂解酰基水解酶。
植物材料
从Pajbjergfonden，Odder，丹麦获得小麦(Herward)。在纸上在25℃生长小麦种子并且有规律地浇水。一星期之后收获小麦叶子。
匀浆缓冲液：50mM HEPES，350mM山梨糖醇，1mM EDTA，1mMMgCl2，1mM DTT的1mM MnCl2，pH8.3/NaOH)。在使用之前缓冲液保持在冰上。
膜结合的脂解酰基水解酶的提取
将26g小麦叶子切成小碎片(1/2cm)。加入78ml冰冷的匀浆缓冲液。在高速Ultra Turrax混合机中将叶子匀浆12秒。
透过三层Kleenex组织过滤去除大的颗粒。250g下将滤液离心1分钟并且分离上清液。
以1000g离心5分钟分离叶绿体。将沉淀(含有膜结合的脂解酰基水解酶)重新悬浮于1ml匀浆缓冲液(显微镜检查分析清楚地看到叶绿体)。沉淀用于小麦模型生面团系统分析。
小型烘焙试验
将下面的成分加给50g Brabrender混合碗并且在30℃下揉合5分钟：面粉50g，干酵母1.0g，糖0.8g，盐0.8g，70ppm抗坏血酸和水(达到400Brabender单位生面团稠度)。34℃停留时间是10分钟。每块生面团定量为15g。然后在特殊装置上成型，在所述装置中生面团在木制板和Plexiglas框之间碾压。生面团在34℃下在罐中省45分钟，然后在225℃Voss家用烤箱中烘焙8分钟。
烘焙的面包冷却至室温放置20分钟。测量面包大小并且通过菜籽置换方法测定体积。
还将面包切开并且评价面包屑和面包皮。
模型生面团
有或没有酶的情况下，将10g面粉和0.020g氯化钠在10gFarinograph混合碗中混合1分钟。接着加入水(500Brabender单位)并且在30℃下混合5分钟。混合之后，生面团放在32℃下1小时，然后在进一步分析之前冷冻并冻干。
烘焙试验(丹麦面包卷)
丹麦改良面粉1500g，压缩酵母90g，糖24g，盐24g，水400Brabender单位+2％在带钩子的HobartTM混合机中低速揉合2分钟并且高速揉合9分钟。生面团温度是26℃。生面团定量为1350g。在30℃下放置10分钟并且在Fortuna模具上成型。生面团在34℃下省45分钟，然后在220℃Bago烤箱中烘焙18分钟再蒸12秒。
冷却之后定量面包卷并且通过菜籽置换方法测定面包卷体积。
面包比体积
比体积＝面包体积，毫升/面包重量，克
还评价了生面团质量参数。
生面团弹性1-10
粘性1-10
烘焙试验(烤面包)
丹麦改良面粉2000g，压缩酵母30g，糖30g，盐30g，水400Brabender单位+3％在带钩子的HobartTM混合机中低速揉合2分钟并且高速揉合10分钟。混合之后生面团温度是25℃。每个生面团重750g。然后再在33℃和85％RH下放置5分钟。生面团在Glimik模具上成型。生面团在33℃下在罐中省50分钟，并且在220℃Wachtel烤箱中烘焙40分钟再注入蒸气16秒。
冷却之后定量面包，并且通过菜籽置换方法测定面包体积。
以1至10等级为基础主观评价面包屑，其中1＝不均匀而10＝均匀性好。
将在带有盖子的罐中烘焙的三个面包保存在20℃下并且用于坚固性测量。
坚固性
在与计算机连接的4301型InstronTMM上测定面包坚固性。
面包坚固性测量的条件：
装载容器 最大100N
活塞直径 50mm
十字头速度 200mm/min
压缩 25％
面包片厚度 11mm
力转化为 N/dm2
结果是对于每一个面包十片面包片测量的平均值。
脂类提取和脂肪酸分析
10g完全省过的生面团立刻被冷冻并冻干。在咖啡研磨机上研磨冻干的生面团，并且通过800微米筛网。在带有螺旋顶盖的15ml离心管中定量1.5g冻干的生面团。加入7.5ml水饱和丁醇(WSB)。离心管放在沸水浴中10分钟。将试管放在Rotamix中并且在室温下以45rpm旋转20分钟，并且然后再次放在沸水浴中10分钟，然后在室温下在Rotamix上又旋转30分钟。试管以3500g离心5分钟。将5ml上清液转移到一个小瓶中并且在氮气下将WSB蒸发至干。
将提取物中游离的脂肪酸分析为在715nm下测定的异辛烷中的Cu-盐，并且根据以油酸为基础的校正曲线定量(Kwon D.Y.和RheeJ.S.(1986)，A simple and rapid Colourimetric Method forDetermination of Free Fatty Acids for Lipase Assay，JAOCS 63：89)。
通过HPLC测定糖脂和磷脂。
1.色谱条件
2.原液
ILPS*标准物溶解于CHCl3/CH3OH(75/25)大约2mg/ml PC原液稀释：0.7，0.14，0.028，
*磷脂酸 PA 5.13％
磷脂酰乙醇胺 PE 12.74％
磷脂酰胆碱 PC 14.76％
磷脂酰肌醇 PI 10.13％
*ILPS(国际卵磷脂和磷脂协会(International Lecithin andPhospholipid Society))标准物从Spectral Service GmbH Kiln，德国获得。
3.样品制备
样品溶解于CHCl3/CH3OH(75/25)，超声处理并且用0.45μm过滤器过滤。
4.校正模型
校正模型：对数-对数线性校正
使用对于PC的校正曲线计算糖脂和磷脂的量。
气相色谱
装有WCOT熔融二氧化硅柱12.5m×0.25mm ID×0.1μm 5％苯基-甲基-硅氧烷的Perkin Elmer 8420毛细气相色谱(Crompack的CP Sil 8 CB)。
载体：氦。
注入：分开1.5微升。
监测器：FID.385℃。
烘箱程序： 1 2 3 4
烘箱温度，℃ 80 200 240 360
等温线，时间，分钟 2 0 0 10
温度速度，℃/min 20 10 12
样品制备：50mg小麦脂类溶解于含有内标十七烷的12ml庚烷∶吡啶2∶1中，2mg/ml。500微升的样品转移至弯头瓶中。加入100微升MSTFA(N-甲基-N-三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺)，并且在90℃下将反应温育15分钟。
计算：从这些成分的参照混合物确定甘油单-二-三酯和游离脂肪酸的反应系数。以这些反应系数为基础，计算小麦脂类中甘油单-二-三酯和游离脂肪酸。
半乳糖脂(DGDG)酶图谱(Spot Plate)分析
平板的制备
溶液1.
通过加热至90-100℃将2g琼脂糖溶解于110ml水中。
溶液2.
将1.2g半乳糖脂分散在40ml去矿物质水中。加入50ml 0.1M磷酸盐缓冲液pH7，接着还加入0.6ml 0.2％罗丹明B。
将溶液1冷却至大约70℃并且在搅拌下加入溶液2。
将12ml的最终混合物转移给7cm培养皿。
在使用之前平板保存在5℃下。
分析
在凝胶上穿出直径1mm的小孔并且向小孔中移入10微升酶溶液。琼脂糖凝胶中晕圈的形成是时间的函数。
也向一个孔中加入没有酶的空白试验作为对照。
酶活性测定
用于酶测定的底物的制备：底物，pNP-癸酸酯(C10)，溶解于乙醇并且在100mM Na-磷酸盐-缓冲液(pH6.3)中稀释到底物的最终浓度和乙醇浓度分别是0.1mg/ml和30％，并且在室温下保存。
测定方法：酶分析混合物中含有30微升样品/空白和250微升底物。该混合物在35℃下温育30分钟(420nm)，同时进行ELISA-读数器(420nm)动力学程序。Vmax值用于计算酶活性(U/ml)。Vmax被从与样品相同条件下测定的pNP溶液的标准曲线转化成微摩尔。酶活性定义为35℃下每分钟产生1微摩尔pNP的酶的量。
随机诱变的筛选方法
从随机诱变或定域随机诱变获得的酶库在含有生长培养基的琼脂板上的乙酸纤维素滤纸上铺展开并且温育。
然后将乙酸纤维素滤纸转移给筛选板并且在37℃下温育2-6小时。给定条件下包含活性酶的细胞会在菌落周围出现清淅的带。然后对阳性变体进一步纯化并测试。
结论
实施例1
在第一组生面团实验中，为了测试生面团中的酶活性并且为了发现烘焙实验的合适的剂量，对不同浓度的10克生面团测定了纯化的豇豆LAH。通过分析生面团中游离脂肪酸的水平测定了酶活性。结果在表1和图4中给出。
表1.模型生面团中豇豆LAH的作用
表1和图4的详细结果清楚表明来自豇豆的LAH在游离脂肪酸的产生期间在生面团中是有活性的。
为了研究对生面团中极性脂类的作用，通过HPLC对从生面团提取的脂类进一步分析。
表2和图5和6中给出生面团脂类HPLC分析结果。
表2：生面团中极性脂类的HPLC分析
通过GLC分析非极性脂类。该项分析的结果在图7中给出。
HPLC分析清楚表明豇豆LAH对半乳糖脂的作用，在高酶剂量下二半乳糖基甘油二酯(DGDG)几乎完全水解。结果还表明相应的单酯，DGMG浓度的小幅增长。在豇豆LAH提高的浓度下，DGMG也被水解。在同一个图中还发现磷脂酰胆碱(Pc)被水解，接着相应的溶血磷脂酰胆碱小幅增加。在豇豆LAH提高的浓度下，生面团中溶血磷脂酰胆碱也被水解。
结论是，发现豇豆LAH降解生面团中的糖脂和磷脂两者。
GLC分析表明豇豆LAH对甘油三酯没有活性，而对极性脂类和游离的脂肪酸形成有活性。
非常清楚的是，3单位/千克的豇豆LAH对这种酶明显过量，它引起生面团中所有的半乳糖脂几乎完全水解。
实施例2
在两个不同浓度小面包分析中测试豇豆LAH，并且与对照物(没有加入豇豆LAH)相比较。评估面包体积并且评估面包屑结构和外观。将该项试验中完全省过的生面团冷冻并且冻干并且提取生面团脂类。通过HPLC和GLC分析分离的生面团脂类。
表3给出烘焙试验结果。
表3.使用豇豆LAH的烘焙试验
与对照物相比，豇豆LAH毫无疑问有助于烘焙面包体积增加，并且这种酶也有利于改进面包屑，有更均匀的结构和更好的外观。
表4给出提取的脂类的脂类分析结果。
表4生面团脂类的GLC和HPLC分析
脂类分析表明豇豆LAH不水解非极性脂类。甘油三酯的水平看起来提高一点，但是这在试验误差之内。但是，这种酶通过降解二半乳糖基甘油二酯(DGDG)清楚地具有对生面团中半乳糖脂的作用。观察到相应的DGMG水平有增长。半乳糖脂水解度不是非常高，但是足以解释酶的烘焙质量的改善。
实施例3
如下在烘焙试验中评估从豇豆中分离的LAH。评价硬皮面包卷中的LAH。
以0，0.25，0.5，1或1.5单位酶/kg面粉的剂量测试LAH。最初的结果表明，与没有酶的面包相比，加入1.5mg的LAH将面包条的体积增大10％以上，并且改善了生面团加工性能。
实施例4
使用丹麦改良面粉根据丹麦烤面包程序测试面包中的LAH。在0，0.1，0.25，0.5，1或1.5单位酶/千克面粉下测定LAH。以没有加入酶的生面团为参照。烘焙之后，将面包条冷却并且测定面包体积。将在带盖的罐中烘焙的面包保存在室温下，并且在22℃双层塑料袋子包裹下贮存1，3和7天之后评估面包屑柔和度。
最初的结果表明加入1-1.5单位的LAH增加面包体积。
坚固性和弹性的最初结果表明，与对照物(没有酶)相比较贮存7天之后，LAH给出软得多的面包屑。
初步结果还表明，LAH产生具有非常好的且均匀的面包屑结构的面包。
实施例5
根据表5测定不同浓度小面包中豇豆LAH。
表5.对生面团的豇豆LAH和脂肪酸分析的烘焙测试
毫无疑问，低浓度下豇豆LAH有助于增大体积(最大至0.239单位/千克)。在较高剂量下体积没有增加，但是面包屑结构变得更加均匀。从该项实验提取生面团并且分离生面团脂类。用HPLC和GLC分析，如表6所示。
表6.生面团脂类的GLC和HPLC分析
脂类分析清楚地证明，豇豆LAH对非极性生面团脂类(甘油单-二和三酯)没有活性，但是对极性脂类象二半乳糖基甘油二酯(DGDG)的作用解释其功能，清楚地，半乳糖基甘油二酯被水解。结果表明甘油二和三酯水平的一些变化，但是变化是随机的并且不指示任何酶活性。
实施例6
在小面包分析中评价豇豆LAH。在该项试验中，单独测试酶，并且还结合从燕麦分离的半乳糖脂进行测试。表7给出烘焙试验和游离的脂肪酸测定结果。
表7小面包中豇豆LAH和半乳糖脂(DGDG)。
在该项实验中，表明豇豆LAH和半乳糖脂(55％DGDG)对面包体积有正面影响。如表7所示，两种成分组合有助于明显的协同作用。当加入豇豆LAH和DGDG时，面包体积和面包屑结构显著改善。
将来自该项实验的生面团冷冻并且冻干，并且用水饱和丁醇提取生面团脂类。对分离的脂类进行GLC和HPLC分析。表8给出这些分析的结果。
表8.生面团脂类的GLC和HPLC分析
当向生面团加入半乳糖脂(实验号2)时，HPLC分析还检测出更多的半乳糖脂(DGDG)。豇豆LAH对DGDG具有强水解作用。
没有加入DGDG(实验号3)和特别是当加入DGDG(实验号4)时，水解作用都是明显的。还发现水解产物水平，即DGMG，当加入豇豆LAH时提高了。在其它实验中还看到，豇豆LAH对甘油三酯没有水解作用。
实施例7
在小面包分析中混合大豆油的情况下评估豇豆LAH(表9)。
表9：小面包中豇豆LAH和豆油
在该项实验中，与单独用大豆油烘焙的面包相比较，豇豆LAH不有助于面包体积的改善，但是豇豆LAH显著改善了面包屑结构和面包外观(图8)。
实施例8
在小面包分析中混合不同浓度半乳糖脂(55％纯)的情况下评估豇豆LAH(表10)。
表10.小面包中豇豆LAH和半乳糖脂(55％纯)
表10表明加入与1.07单位/千克半乳糖脂混合的半乳糖脂有助于面包体积和面包屑结构的极大改善(图9)。
实施例9
在小面包中混合半乳糖脂DGDG情况下测试纯化的来自豇豆的LAH。
表11中列出了向生面团加入的成分，以及这些烘焙实验的面包体积。
表11.用豇豆LAH和半乳糖脂DGDG进行的烘焙试验
表11的结果清楚地表明，DGDG对烘焙面包的面包体积有正面作用。豇豆LAH还有助于改善面包体积。观察到豇豆LAH和DGDG的混合进一步改善面包体积并且给出更好的面包屑结构(图10)。
实施例10
在该项实验中，在10克模型生面团系统中测试了分离的膜结合的来自小麦叶子的叶绿体的LAH。26℃下对生面团测试1小时，然后冷冻并冻干。
用水饱和丁醇(WSB)提取冻干的生面团，并且对分离的生面团脂类进行GLC和HPLC分析。表12给出脂类分析结果。
表12.生面团中来自小麦叶绿体的膜结合LAH的作用，脂类GLC分析
表12的结果证明了根据生面团中游离脂肪酸大幅增加测定的生面团中来自小麦叶绿体的膜结合LAH酶的脂解活性。结果还表明来自小麦叶绿体的膜结合LAH酶对非极性脂类几乎没有作用，甘油三酯的浓度没有改变。结果还表明来自小麦叶绿体的膜结合LAH酶对半乳糖脂象二半乳糖基甘油二酯(DGDG)水解的强水解作用，它在高剂量膜结合LAH酶下完全水解。
实施例11
在该项实验中，在10克模型生面团体系中测试了SEQ ID No.12所示序列构成的分离的LAH酶。生面团在26℃下放置1小时，然后冷冻并冻干。
初步结果表明包含SEQ ID No.12所示序列的酶减少油中极性脂类的量，而不明显影响油中甘油三酯水平。
结论：
从豇豆分离了LAH酶，表征，在模型生面团中测试并且进行小型烘焙实验。这种酶对生面团中的极性糖脂和磷脂有活性但是对生面团中的甘油三酯没有活性。也分离了来自小麦叶子的叶绿体结合LAH，并且在模型生面团中测试。这种酶对生面团中的糖脂和磷脂也有活性，但是对甘油三酯没有活性。
实施例12
用从豇豆分离的LAH处理植物油，特别是油菜籽油，以实现油的脱胶。使用的方法基本上和Buchold，H.(Fat Sci.Technol.95Jahrgang nr.8，1993，pp300-305)一般教导的植物油酶催化脱胶方法一样，除了使用LAH。
初步结果表明LAH减少油中极性脂类的量，而不显著影响油中甘油三酯水平。
上面说明书中提到的所有的公开物在这里引作参考。不脱离本发明的范围和精神，本发明的描述的方法和系统的各种修饰和变化对于本领域技术人员是显而易见的。虽然参照具体的优选的实施方案描述了本发明，但是应该明白权利所要求的不应该不适当地局限于这样的具体的实施方案。事实上，对于食品化学/技术领域的技术人员显而易见的实施本发明的描述的方式的各种修饰认为在下面的权利要求书范围内。
序列表
SEQ ID No.1
MAATQTPSKVDDGALITVLSIDGGGIRGIIPGILLAFLESELQK
LDGADARLADYFDVIAGTSTGGLVTAMLTAPNENNRPLYAAKDIKDFYLEHTPKIFPQ
SSSWNLIATAMKKGRSLMGPQYDGKYLHKLVREKLGNTKLEHTLTNVVIPAFDIKNLQ
PAIFSSFQVKKRPYLNAALSDICISTSAAPTYLPAHCFETKTSTASFKFDLVDGGVAA
NNPALVAMAEVSNEIRNEGSCASLKVKPLQYKKFLVISLGTGSQQHEMRYSADKASTW
GLVGWLSSSGGTPLIDVFSHASSDMVDFHISSVFQARHAEQNYLRIQDDTLTGDLGSV
DVATEKNLNGLVQVAEALLKKPVSKINLRTGIHEPVESNETNAEALKRFAARLSNQRR
FRKSQTFA
SEQ ID No.2
1 caaattctat ataaaatata atacattagg aagttagaaa atacttgacc tactctccaa
61 ttatttgatt cacgttcaaa atatatcatt acgattctag attaataaag attcctataa
121 agtttcaaat cacaaatgtg accattcaat atctcacatg caaccaaaat aaggaaaaag
181 ccttaagttt aaaaaataaa taaaaagttt actcaaaacc aaaacttaat aagataaact
241 tttcttatat tctgttaaat tttattcccc atactttaat aaaagaaagg ataagaaaca
301 actacttttt attttacttt gtattttata gagataaaat agtttagata attgaaaagt
361 gaattagttt tacattatat ataactttta catactaaaa catttatttt tgttttaaat
421 taaagaaagg tacttacact agaaataacg tttataaatg aatgaaaatt acattcaatt
481 tcttaaaagt actgtgaata gaaaaatgat aacaaagaag aaaaatatat agtgaattat
541 attacaagaa aaaaaaagtt gtcaattaat tattaataca ttgcatcaat aataaataaa
601 ggttctcatt tttgtagtga aatctcaaat aagttttctc atttttattt gactcaattg
661 agttactaat ttggaaaatt cattgcaatt agatcatttt cgttagtact acactagcga
721 tgttaactat gtgtcatgtg tcagcaagtg atttttttta taattttttt gaaaaaaata
781 aaaaaaaatt atcatgtgtt aatctgacat tgtgtcacat gttagagata atgtgatgtg
841 acagtaatag taccacatgt cactattgaa tgtgaaaagt cttaatataa tccttgtatt
901 tattattttg tttcaattta acattttttt aaacataaaa caatttaatt aattttttaa
961 atttcatatt ttctaaatat tttagataag taaaaaataa taataatacg attaaacctt
1021 aattttgtac tttacaacta ctatttgatg gttatgcttt taagttgtgg ttgaaatagt
1081 ggtgaagagc atacgtgaat atgacaaata aagaaacaaa cgcaattatg acattcttat
1141 ccttttctaa gtattttctt ataattacag tcttttgaaa ttattgtgta tgaaattaaa
1201 gtaggtatgt gggaatgtga caataataat aactaaggag actctgaaaa gttctgagaa
1261 tttaatgaat taattataat ttaaacaagt cagacaagaa aattataaag ttctctaacc
1321 tagtacgtgc ctcataaaat aatagtcatg ctattataaa ataattaatt atggtgggtg
1381 gaatgttcat tgacacaatt atttagatat tttctcattg actcattgac acatggttca
1441 ttgctatcca tctattacca atgaatatta ccttttgtcg tctatgataa tttattttta
1501 taattttaat actctatcaa agtaaaaata ttgtccagga aaaatgggtt ttattaataa
1561 ttaattgaag gtgaattaac tatactaaat attataccaa tggataatta cattgcaaaa
1621 gaataccttt gtagtatttt gaaatatgat attttaaagt aacttgttgt tcattaaaaa
1681 attaaaaatt taaatataag tttaagtctt acactaaaaa aaataaaaaa atataaagtt
1741 gagtatcata taaagatgaa aactcataaa acatattaga gttgaaggtt aatagtctat
1801 ttagacaaat ttttgtatcg agaaagaaat accgatggga catactcatg ggataaatca
1861 aaactaagtg aaaataaaat ttgaggtaaa gaaaatacat atttaataaa tttaaaagtg
1921 aaatttttaa tgtgtgtcca aaatatttgt taaataataa taaacatatt ttacatcacc
1981 taatccatgc gtttttcatc ggatttacgg gccggtccga cgggccagat cctaattgtc
2041 accccttatg tattttatat atggtatata tgactaacat gagaaaatgt gaccgttaaa
2101 agcagagttt taatcaaaca taagtaaaaa tgagtatagt taaaccaaaa cttgatttac
2161 catatataac tcataacaga gactttaaca cagatctgca aaccttccta gtatgtacac
2221 tgcaaaaaca agggaacaca aaggttgccc tacgcattca atctcattaa tctctgtggt
2281 ccaaaacact ttgtgtgtat atgatttgaa tattactatt atacatccaa caatagtaat
2341 tcttgtcttt tgtgtctata tgatttgaac gctagtatta cattctctat caactcttcc
2401 atacatttat tgatcgcccc accatcaaaa aaccataact aacacgtgaa aactgataaa
2461 aataacgtca gcatagaagt tctgaacgtt caatattatt cacagaaaaa agatattatc
2521 catttcgacg tttttgtggt aattaactta acatggtgct aagattttgg tataggagat
2581 gatgttatat aggttacctt aattatgatt gaagtgagtg aagaattctt attcattgaa
2611 agtgttttta actgaggttt tagacaaact atacctaatt ttactagttt aatccctctt
2701 aagaaaaaaa aaccaactcc tggaacacca acaaacacca taagtaacac gtttgaaaac
2761 ggactaaaat aatgttgaag ctctcgacaa ttaaataggt ttcatggaaa catattatcc
2821 atttccctgt ttttgtggca actaattgaa cacgctaaaa acaagacaag taaactcacc
2881 aacatcttca ctctttacac ggtttggctt tatatataaa tatgcagttt ctcctcatca
2941 aatcaaccca tgaaaaccag atttttctga ataagtttgt gtaagagttc agtagttttc
3001 tttgctcttt cctaagttca ttccatctct ctttctttct ctttctttct cactgtgtgt
3061 gtctctctct ttctctttga cttagtaagt catcaattca gatccatggc agcaactcaa
3121 actccaagca aagttgatga tggagcactg attactgtgc tgagtattga tggtggtggc
3161 attcgtggaa tcattcccgg aattttgctt gctttcctct aatcagaact tcaggtaata
3241 ataatctatg gtaaccaaga gaaaacgttt atatgtaaat taatgcagga aagtaactaa
3301 taatggtgca tatgcagaaa ctggatggtg ctgatgcaag actcgcagat tactttgatg
3361 tgattgcagg aacaagcacc ggtggattag tcactgcaat gctcactgct ccaaatgaaa
3421 ataatcgacc cttgtatgca gccaaagata taaaggattt ctaccttaag cataccccaa
3481 aaatcttccc gcagagtagg taaataccac actttacacc ataaacttcg taccaaatca
3541 ttcaaatcta aatacacact gtgtactaat ttacagtgtg attttttccc aaatacagta
3601 gctggaattt gattgcaaca gcgatgaaga aaggcagaag tctgatggga ccacagtacg
3661 atggcaagta tttacacaag ctcgttaggg aaaaactagg gaacacaaaa ttggaacaca
3721 cattaaccaa tgtcgttatc ccagcatttg atatcaaaaa ccttcaaccc gccatctttt
3781 ccagcttcca ggttcacccc tcctcctctc aattgcaaaa agtcactcac ttgaaagcaa
3a41 aaattgcagc tttttgtttt tctctaacga aattattact ctcgaatatg atgtcacagg
3901 tgaagaagag gccatatttg aatgcggcgt tgtctgatat atgcatttca acctcggcag
3961 caccaaccta tctcccagct cattgctttg aaactaaaac cagcactgct agtttcaaat
4021 tcgaccttgt agatggtggt gtagcagcaa ataacccggt attgtattat acagtctcag
4081 aactaatctt aatcattcat aacataatca cacacacaaa cactataatt aacaagtata
4141 aacttaatcg ataacagaag aaggtgatag atatgttata atctggcatt ttccaggctc
4201 tggtggcgat ggcagaagtg tcgaacgaaa tccgcaatga agggtcatgt gcaagcttga
4261 aagtaaaacc gttgcaatac aaaaagtttt tggtgatatc gttgggaaca ggttctcagc
4321 aacacgaaat gagatacagt gctgataagg catcgacatg gggccttgtg ggttggcttt
4381 cctcctccgg tggcactcct ctcatcgatg ttttcagcca tgctagttct gacatggttg
4441 atttccacat ctcctccgtt ttccaagcac gccatgctga acaaaactac ctccgaatcc
4501 aggttctttc cgaacatata tataaacatc ttcaatgatt ctcgtgcttg caaatgaaaa
4561 ctcatgagtt caatctttat attcaaattt tgcaggatga tactttaact ggggacttag
4621 gttcggtgga cgtggccacg gagaagaatc tgaatggcct cgtccaagtt gcggaagcat
4681 tgttaaagaa accagtttca aagattaact tgaggaccgg tattcatgaa cctgttgagt
4741 ctaacgaaac caacgcagaa gccttgaaga ggtatatata tatcaaaacc ctactcatac
4801 acacacatga taatggaaag aatttaagaa aaactgtgta agaaattaaa gtatatatac
4861 aataaaaaca tcatgtgttc atcgtactaa tgttttatta acaacgtatt ttttatcaaa
4921 cgaaatccat atatgagttg taacttcttc gaatcacagt ttcacgttca cttcacttca
4981 ctattttttt atatcaggtt tgcggcacga ctatccaacc agaggagatt tcggaaatct
5041 caaacgtttg cgtagaatgg gaatcttcga aagatgaaga tatacgagac acgtgttgct
5101 tggccaatat gataaatgat tggtgtagtg tttatcttaa ttttatatat ttttctttat
5161 atttcgtagt gttcattaca gtgaagatat attcattgta ctgaatcaca ataattagtg
5221 tccctacaat attaaatctc atgtgctgta aacgctttgt gtttctttgt tttcatttac
5281 caatgtaatc agtttggttc actatattgt ctctaattca ttttatttta a
SEQ ID No.3
1 M F S G R F G V L L T A L A A L G A A A P A P L A V R S V S
31 T S T L D E L Q L F A Q W S A A A Y C S N N I D S K D S N L
61 T C T A N A C P S V E E A S T T M L L E F D L T N D F G G T
91 A G F L A A D N T N K R L V V A F R G S S T I E N W I A N L
121 D F I L E D N D D L C T G C K V H T G F W K A W E S A A D E
151 L T S K I K S A M S T Y S G Y T L Y F T G H S L G G A L A T
181 L G A T V L R N D G Y S V E L Y T Y G C P R I G N Y A L A E
211 H I T S Q G S G A N F R V T H L N D I V P R V P P M D F G F
241 S Q P S P E Y W I T S G N G A S V T A S D I E V I E G I N S
271 T A G N A G E A T V S V V A H L W Y F F A I S E C L L
SEQ ID No.4
1 ATGTTCTCTG GACGGTTTGG AGTGCTTTTG ACAGCGCTTG CTGCGCTGGG
51 TGCTGCCGCG CCGGCACCGC TTGCTGTGCG GAGTGTCTCG ACTTCCACGT
101 TGGATGAGTT GCAATTGTTC GCGCAATGGT CTGCCGCAGC TTATTGCTCG
151 AATAATATCG ACTCGAAAGA CTCCAACTTG ACATGCACGG CCAACGCCTG
201 TCCATCAGTC GAGGAGGCCA GTACCACGAT GCTGCTGGAG TTCGACCTGA
251 CGAACGACTT TGGAGGCACA GCCGGTTTCC TGGCCGCGGA CAACACCAAC
301 AAGCGGCTCG TGGTCGCCTT CCGGGGAAGC AGCACGATTG AGAACTGGAT
351 TGCTAATCTT GACTTCATCC TGGAAGATAA CGACGACCTC TGCACCGGCT
401 GCAAGGTCCA TACTGGTTTC TGGAAGGCAT GGGAGTCCGC TGCCGACGAA
451 CTGACGAGCA AGATCAAGTC TGCGATGAGC ACGTATTCGG GCTATACCCT
501 ATACTTCACC GGGCACAGTT TGGGCGGCGC ATTGGCTACG CTGGGAGCGA
551 CAGTTCTGCG AAATGACGGA TATAGCGTTG AGCTGTACAC CTATGGATGT
601 CCTCGAATCG GAAACTATGC GCTGGCTGAG CATATCACCA GTCAGGGATC
651 TGGGGCCAAC TTCCGTGTTA CACACTTGAA CGACATCGTC CCCCGGGTGC
701 CACCCATGGA CTTTGGATTC AGTCAGCCAA GTCCGGAATA CTGGATCACC
751 AGTGGCAATG GAGCCAGTGT CACGGCGTCG GATATCGAAG TCATCGAGGG
801 AATCAATTCA ACGGCGGGAA ATGCAGGCGA AGCAACGGTG AGCGTTGTGG
851 CTCACTTGTG GTACTTTTTT GCGATTTCCG AGTGCCTGCT ATAA
SEQ ID No.5
CAAGCTATACCAAGCATACAATCAACTCCAAAATGTTCTCTGGACGGTTTG
SEQ ID No.6
CAAACCTCTGGCGAAGAAGTCCAAAGCTG
SEQ ID No.7
GCTCGTGGTCGCCTTCCGGGG
SEQ ID No.8
GCCGGTGCAGAGGTCGTCG
SEQ ID No.9
CCTCGAATCGGAAACTATGCGC
SEQ ID No.10
TGTCACGGCGTCGGATATCG
SEQ ID No.11
CTCATCCAACGTGGAAGTCG
SEQ ID No.12
5 10 15 20 25 30
| | | | | |
1 M C S Q A D P T L T C P P P S Q G R L I T V L S I D G G G I
31 R G L I P S T I L A C L E S K L Q E L D G P D A R I A D Y F
61 D V I A G T S T G A L V T S M L A A P G E N K R P L F E A K
91 D I N K F Y L D N G P K I F P Q K G W G V L T P M A N L F G
121 A V T G P K Y D G K F L H D K I K S L T N D V T V A D T V T
151 N I I V P T F D I K Y L Q P I I F N T Y E A K V D P L K N A
181 H L S D I C I S T S A A P T Y F P A H Y F T T R D P A G K L
211 P D R E Y H L I D G G V A A N N P T M A A M S M I T K E V L
241 R R N P D F T H G K P A E Y G N Y L I I S I G T G S A K M A
271 E K Y T A P D C A K W G V L R W L Y D G G F T P L I D I F S
301 H A S A D M V D I Q A S V L F Q V L D C T K S Y V R I Q H A
331 E L T G E M A S V Y V S T S K S L N G F I S V G K A L L K K
361 Q V C K V N V E T G K N E P D L E R G A Y E E E L A R F V R
391 M L S K E R K A R K E A Y K L V
机译： 面包质量改善和面包组成，以及面包面团和面包使用所谓的面包质量改善或面包组成
机译： 用于改善面包质量和储存稳定性的酸面团，其制备方法和面包的制造方法（酸面团面包）
机译： 一种改善面粉面团的流变特性和由这种组合物制成的成品质量以改善质量的方法，质量使用所述组合物制备面包产品的方法和基于该质量制备食品的方法
