利用NIPA1基因突变热点诊断、治疗遗传性痉挛性截瘫的方法

摘要

本发明描述了发现一个NIPA1基因内的突变热点及这一热点中的两个新突变的过程，这个基因中的突变会导致遗传性痉挛性截瘫。同时还与小鼠、大鼠、河豚和斑马鱼中的NIPA1同源基因进行同源性比对。这个基因的转录子和翻译产物在检测和诊断遗传性痉挛性截瘫，发展针对遗传性痉挛性截瘫的治疗技术，以及在分离和生产NIPA1突变基因编码的蛋白质和构建表达此突变基因的转基因动物模型中都十分有用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程和医学领域。更具体地，本发明涉及利用人NIPA1基因及其编码产物诊断和治疗遗传性痉挛性截瘫的方法，以及含有NIPA1基因和/或蛋白的药物组合物。

背景技术

遗传性痉挛性截瘫是由单个基因的病理性突变而引起的疾病，是一组遗传异质性很强的疾病，即本病可由不同基因的不同突变引起。因此，找寻及筛选本病的致病基因及其突变类型不仅是了解、阐明本病发病机理的必须途径，同时也是建立本病的基因诊断和产前/种植前诊断的先决条件。在已了解本病的致病基因及其突变类型之后，才可以建立起基于这一基因及其突变类型的基因诊断技术，以期对临床上可疑的患者进行确凿的基因水平的诊断，还可以通过羊水及脐血的检测，判断胎儿是否携带有这一基因的突变，从而预测胎儿出生后是否会患有这一疾病，并将这一信息提供给孕妇及其家人，从而决定继续或终止妊娠。由于基因的突变是本病发生的原因，从长远看，对突变的筛选使使用纠正突变的基因疗法，或其它针对这一突变的生物学效应的方法(如蛋白质拮抗剂)去治疗本病成为可能。因此，从长远看，本发现有治疗方面的应用前景。Rainier S等于本月报导了NIPA1基因的T45R(159C→G)的突变可引起本病(Rainier S，et al：NIPA1 gene mutations cause autosomal dominanthereditary spastic paraplegia(SPG6).Am J Hum Genet，73：967-971，2003)。

由于对本病的临床诊断现无特殊方法，仅靠排除其它可引起相同症状体征的疾病来进行(参见表1)，因而基因水平的诊断不仅明确了突变的具体部位及种类，还具有准确，快速，低消耗的特点。因此，本领域迫切需要开发新的早期诊断、治疗遗传性痉挛性截瘫的有效方法。

发明内容

本发明的目的是提供与遗传性痉挛性截瘫的发病或发病风险有关的多核苷酸和蛋白。本发明的另一目标是用这些蛋白和多核苷酸筛选调节这些蛋白或多核苷酸表达或功能的化合物。

本发明进一步的目的是用这些化合物调节或与所述遗传性痉挛性截瘫相关的蛋白及多核苷酸相互作用，以治疗和诊断这种疾病。

本发明的进一步目的是提供治诊断遗传性痉挛性截瘫的方法。

本发明的第一方面，提供了一种NIPA1基因突变蛋白，所述NIPA1基因突变蛋白具有SEQID NO：2所示的氨基酸序列，其中第106位氨基酸为精氨酸。

本发明的第二方面，提供了一种分离的NIPA1突变基因，其特征在于，它编码上述突变蛋白。

优选的，所述NIPA1突变基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，其中第341位发生突变，其突变选自：

G→C；

G→A。

本发明的第三方面，提供了一种对个体的遗传性痉挛性截瘫进行诊断的方法，所述方法包括步骤：检测该个体的NIPA1基因、转录本和/或蛋白，并与正常的NIPA1基因、转录本和/或蛋白相比较，存在差异就表明该个体患遗传性痉挛性截瘫的可能性高于正常人群。优选的，检测的是NIPA1的基因或转录本，并与正常NIPA1核苷酸序列(SEQ ID NO：1)比较差异。较佳的，所述差异选自：

SEQ ID NO：1中第341位G→C；

SEQ ID NO：1中第341位G→A；

SEQ ID NO：2中第106位甘氨酸变为精氨酸。

本发明的第四方面，提供了一种化合物，所述化合物抑制上述NIPA1基因突变蛋白的激活或抑制上述NIPA1突变基因的表达。较佳的，所述化合物是NIPA1突变基因的反义核苷酸。

本发明的第五方面，提供了一种NIPA1基因突变蛋白的用途，所述NIPA1基因突变蛋白用于制备治疗或诊断遗传性痉挛性截瘫的组合物。

本发明的第六方面，提供了一种NIPA1突变基因的用途，所述NIPA1突变基因用于制备治疗或诊断遗传性痉挛性截瘫的组合物。

本发明的第七方面，提供了一种检测遗传性痉挛性截瘫的试剂盒，所述试剂盒包括特异性扩增NIPA1基因或转录本的引物。较佳的所述试剂盒还含有选自下组的试剂：

(a)与突变部位结合的探针；

(b)识别突变位点的限制性内切酶。

在一优选例中所述的突变选自：

SEQ ID NO：1中第341位G→C；

SEQ ID NO：1中第341位G→A；

SEQ ID NO：2中第106位甘氨酸变为精氨酸。

本发明也包括了应用所述蛋白和多核苷酸筛选治疗和/或诊断遗传性痉挛性截瘫的化合物，这些化合物可以作为NIPA1基因表达或功能的激活剂或拮抗剂。这些蛋白和多核苷酸既作为筛选化合物的靶子，同时为合成衍生化合物提供了原料，后者能作为NIPA1基因表达或功能的激活剂或拮抗剂。

特别地，本发明还包括针对NIPA1基因或基因产物的异常表达水平、基因的突变、甚至异常基因或基因产物的检测方法。上述异常出现于具有遗传性痉挛性截瘫或有遗传性痉挛性截瘫发病风险的人的细胞或组织中，或者在患有这种疾病的细胞或动物模型中。

因而，本发明用于通过检测NIPA1基因或基因产物来指导筛选遗传性痉挛性截瘫患者或遗传性痉挛性截瘫的发病风险。对异常表达水平、基因突变或其他的异常现象的检测容许对遗传性痉挛性截瘫患者或遗传性痉挛性截瘫发病的风险进行诊断。在一实施例中，这项发明指示了通过对NIPA1基因的异常水平、基因突变或别的异常现象的检测。

因此，本发明还包括对患有遗传性痉挛性截瘫，或有遗传性痉挛性截瘫发病风险的人的治疗方法，本方法用NIPA1基因或基因产物的异常表达水平、突变或其他的异常现象作为治疗的指标或靶子。

本发明也包括了用NIPA1基因或基因产物作为指标或靶子筛选调节表达水平的因子或有效逆转在NIPA1基因或基因产物中的突变或其他异常特征的方法。因此，本发明包括筛选NIPA1基因或基因产物的激活剂和拮抗剂的方法。这些因子可以根据它们对NIPA1基因或基因产物的表达水平或功能的影响用于诊断或治疗遗传性痉挛性截瘫。通过鉴别能调节NIPA1基因或基因产物的表达或功能的因子，就获得了通过调节NIPA1基因或基因产物的表达水平或功能而影响一个人的遗传性痉挛性截瘫发病过程或发病程度的方法。进一步，通过获得这些基因表达调节的因子，就形成了评估对细胞和动物模型的治疗效果的方法。

通过筛选能够相互作用，或者容许对NIPA1基因或基因产物的异常表达或功能进行检测的因子，这样就形成了诊断遗传性痉挛性截瘫的发病或发病风险的方法。

本发明进一步还包括了在NIPA1基因或基因产物基础上得到的组合物，它们对于检测或调节NIPA1基因或基因产物的表达或功能都十分有用。所以，这些组合物对于诊断和/或治疗遗传性痉挛性截瘫十分有用。

本发明也包括了根据模型中的NIPA1基因或基因产物研究遗传性痉挛性截瘫的细胞和动物模型。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1.家系1 D15S1021～D15S1002标志物单倍体分析结果。

黑色图案符号表示患者，黑色长条代表病变单倍体。方框表示男性，圆圈表示女性。家庭成员中IV-7、V-1和V-7出现了重组。

图2.家系2系谱。

图3.D15S1021～D15S1002两点连锁分析Lod Scores值和多态性标志物间的距离(家系1)。

图4.NIPA1的cDNA序列。

发明人发现的突变在本序列中是第341位硷基的突变，该位置的硷基已加框)

图5：家系1中患者的正向测序结果(箭头所示为突变位点，G→C)。

图6：家系1中患者的反向测序结果(箭头所示为突变位点，C→G)。

图7：家系1中正常人及人群中正常人的正向测序结果(箭头所示为突变位点所在，但没有发生突变，为G)。

图8：家系1中正常人及人群中正常人的反向测序结果(箭头所示为突变位点所在，但没有发生突变，为C)。

图9：家系2中患者的正向测序结果(箭头所示为突变位点，G→A)。

图10：家系2中患者的反向测序结果(箭头所示为突变位点，C→T)。

图11：人类NIPA1基因与小鼠nipal基因的序列比对结果。

浅灰色的硷基表示突变所在密码子，下加一横线的为突变位点所在。结果显示该密码子在小鼠与人中是相同的。

图12：人类NIPA1基因与大鼠nipal基因的序列比对结果。

浅灰色的硷基表示突变所在密码子，下加一横线的为突变位点所在。结果显示该密码子在大鼠与人中是相同的。

图13：人类NIPA1基因与斑马鱼(zebrafish)基因的序列比对结果。

浅灰色的硷基表示突变所在密码子，下加一横线的为突变位点所在。结果显示该密码子在斑马鱼与人中是相同的。

图14：人类NIPA1基因编码的氨基酸与小鼠、河豚氨基酸序列的比对结果。

方框表示突变位点所在氨基酸。比对结果显示在小鼠、河豚(Fugul)、人中，本位点都是甘氨酸(Glysine)。

图15：NIPA1的生物结构预测图。

NIPA1蛋白的氨基酸序列共有氨基酸329个，在本图中发明人把它分成四段排列：

1.每一段的第一行数字是该蛋白氨基酸序列的氨基酸计数。

2.每一段的第二行是该蛋白的氨基酸序列。

3.每一段的第三行的M表示本处可能是一个跨细胞膜功能域(transmembranemotif)，整条序列共有8个可能的跨细胞膜功能域。

4.每一段的第四行的O、M、i分别表示该氨基酸序列可能的膜外部分(outsideregion)、跨膜部分(membrane helix)和膜内部分(inside region)。

发明人发现的新突变位于本氨基酸序列的第106位，是从甘氨酸(G)到精氨酸(R)的改变，在图中已加下划线。

具体实施方式

本发明的NIPA1突变蛋白是指具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白，其中第106位氨基酸为精氨酸。本发明的NIPA1突变基因编码NIPA1突变蛋白。它具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，其中第341位发生突变。较佳的，上述突变选自：

G→C；

G→A。

本发明的人NIPA1核苷酸全长序列(NIPA1突变基因)或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据NIPA1的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆人载体；再转入细胞；然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

将本发明NIPA1编码序列插入合适的表达载体，再转入宿主细胞，就可以分离出NIPA1突变蛋白。

本发明还包括对本发明NIPA1突变基因或是其片段编码的蛋白具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人NIPA1突变基因产物或片段。较佳地，指那些能与人NIPA1突变基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。

此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的抗体包括能阻断人NIPA1突变蛋白功能的抗体以及不影响人NIPA1蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人NIPA1突变基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用蛋白合成仪合成。

本发明包括NIPA1突变蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂等。当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、静脉内、皮下、或局部给药(包括病灶处)。较佳地是局部给药。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明NIPA1突变蛋白的拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。使用药物组合物时，是将安全有效量的NIPA1突变蛋白的拮抗剂拮抗剂施用于哺乳动物，其中本安全有效量通常至少约0.1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地本剂量是约0.1微克/千克体重一约100微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明还涉及定量和定位检测人NIPA1突变蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。

一种检测样品中是否存在NIPA1突变蛋白的方法是利用NIPA1蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与NIPA1蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在NIPA1突变蛋白。

NIPA1蛋白的多聚核苷酸可用于NIPA1蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，NIPA1蛋白的多聚核苷酸可用于检测NIPA1蛋白的表达与否或在疾病状态下NIPA1蛋白的异常表达。如NIPA1 DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断NIPA1蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用NIPA1蛋白特异的引物进行RNA一聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测NIPA1蛋白的转录产物。

本发明提供了一种检测人NIPA1基因表达是否异常的方法；它包括步骤：(a)确定在人NIPA1基因的SEQ ID NO：1所示序列的第341位的核苷酸；和b)检测在所述位置是否存在硷基G的错义突变。

检测NIPA1基因的突变也可用于诊断遗传性痉挛性截瘫。检测可以针对DNA，也可针对基因组DNA。NIPA1蛋白突变的形式包括与正常野生型NIPA1 DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析，PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。

发明人经过广泛而深入的研究，收集了两个遗传性痉挛性截瘫病患者的大家系，并应用全基因组扫描、连锁分析技术首次将致病基因定位于15q11.1-q12的染色体节段。发明人在一个含3代14名本病患者(仍存活并有血样的代数及患者数)的大家系(家系1)中进行了NIPA1基因突变的检测，并通过测序的方法，发现了这一在国际上由发明人首先筛选的第106密码子G→C(G106R)的突变。同时，发明人还在另一个含3代7名患者(仍存活并有血样的数字)的家系中(家系2)发现了位于同一硷基的G→A改变。这两种改变在氨基酸水平均为G106R。这使得肽链中的中性疏水性甘氨酸(Glycine)变为碱性亲水性的精氨酸(Arginine)。由于突变氨基酸位于编码肽链跨膜区的功能基团中，这一改变使得NIPA1基因所编码肽链的功能发生异常，从而引发本病。突变硷基G在脊椎动物中的保守性，也证明了这一硷基在功能上的重要性。由于在这2个无血缘关系的家系中NIPA1基因的突变发生于同一硷基位点，且突变后的硷基不同，表明这一核苷酸为本基因的突变热点。在此基础上，发明人完成了本发明。

本发明发现了一个NIPA1基因内的突变热点及位于这一热点的2个新突变。这一发现可应用于遗传性痉挛性截瘫的诊断、治疗中；并进一步证实了NIPA1基因是引起遗传性痉挛性截瘫的疾病基因。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1  家系收集，全基因组扫描和连锁分析

1.家系收集

按改良Harding标准筛选家系中的患者(McDermott CJ，White k，et al：Hereditaryspastic paraparesis：a review of new developments.J Neurol Neurosurg Psychiary2000；69：150-160)。两家系患者的表型均呈单纯型，无智力障碍、小脑症状、耳聋、眼部等症状(家系1表型见表1，系谱见图1，家系2系谱见图2)。两家系均由哈尔滨医科大学一附院宋纯医生提供。在所有家系成员知情同意后，取外周血于EDTA管中。

  病例  性  别 年龄 发病 年龄截瘫步态改变 膝反射  亢进 肌张力  增高踝痉挛巴宾斯基征chadolock  III-2  女  72  25  +  +  +++  +++  +  +  +  III-5  女  63  16  +  +  +++  +++  +  +  +  IV-2  女  56  30  -  +  ++  ++  +  +  +  IV-4  女  51  35  -  +  ++  ++  +  +  +  IV-6  女  37  30  -  +  ++  ++  +  +  +  IV-9  女  52  24  +  +  +++  +++  +  +  +  IV-14  男  44  25  -  +  ++  ++  +  +  +  V-1  男  33  15  -  +  +  ++  +  +  +  V-2  女  31  25  -  +  +  ++  +  +  +  V-3  女  31  30  -  +  ++  +  -  +  +  V-4  男  28  25  -  +  ++  ++  -  +  +  V-5  男  26  20  -  +  +  +  +  +  +  V-6  男  26  13  -  -  +  +  -  +  +  V-9  男  26  20  -  +  ++  +  -  +  +

                            表1家系中受累个体疾病表型

2.DNA提取

用Qiagen公司生产的QIAamp DNA Blood Maxi Kits从抗凝外周血中提取DNA，TE溶解，-70℃保存。

3.全基因组扫描

①多态性标志物引物序列：为400个从Genethon人类遗传图谱中选择的多态性双核苷酸微卫星重复序列引物，荧光标记。每对标记物间距约为10cM，连锁分析所用多态性标志物在染色体上的排序和距离来自于http：//www.marshfieldclinic.org/网站资料。

②PCR反应条件：5-μl反应体系，含50ng of DNA，2.5mM MgCl₂，10mM Tris-HCl pH8.3，50mM KCl，250mM each dNTP，0.625pmol引物，和0.25单位Hotstart Taq DNA聚合酶(QIANGEN GmbH，Hilden，Germany)。反应采用Perkin-Elmer 9700热循环仪。采用标准Touchdown程序：95℃预变性12分；Touchdown循环14次，95℃变性30秒，退火温度1分钟，由63℃起始，以后每个循环递减0.5℃，直到56℃，72℃延伸1分30秒；之后保持退火温度为56℃，1分钟，再进行30个循环；最后产物72℃延伸10分钟。

③基因型筛选：PCR产物于ABI377或3100测序仪上进行基因型筛选，以GeneScan，Genotyper软件分析结果。

4.连锁分析

两点连锁分析：采用LINKAGE软件(Version 5.10)，假定致病基因频率为10^-4，多态性标志物的等位基因频率相等，男女重组率相等，外显率0.9。两点连锁分析结果获得最大Lod Score值(Zmax)：4.55，重组率(θ)为0。相邻的几个多态性标志物的Lod Score值也大于3.0(表2，图3)。

                                LOD SCORE

                                                                      Zmax at 0＝

Marker θ＝0.00    0.01    0.05    0.10   0.20    0.30    0.40

多态性标志物

D15S1021   4.55    4.51    4.27    3.89   2.96    1.89    0.74        4.55   0.00

D15S128    2.92    2.87    2.67    2.41   1.83    1.20    0.55        2.92   0.00

D15S646    2.48    2.45    2.32    2.13   1.69    1.19    0.63        2.48   0.00

D15S210    4.55    4.51    4.27    3.89   2.96    1.89    0.74        4.55   0.00

D15S122    4.34    4.32    4.15    3.82   2.97    1.94    0.81        4.34   0.00

D15S986    4.04    3.98    3.71    3.36   2.60    1.75    0.82        4.04   0.00

D15S97     3.42    3.43    3.36    3.18   2.63    1.91    1.02        3.43   0.01

D15S822   -1.02    1.08    1.66    1.74   1.48    1.0     0.45        1.74   0.10

D15S975   -2.59   -0.31    0.29    0.47   0.51    0.40    0.22        0.51   0.20

D15S156    0.04    0.17    0.41    0.52   0.53    0.39    0.19        0.53   0.20

D15S1002  -6.72   -2.20   -0.65   -0.05   0.36    0.37    0.22        0.37   0.30

           表2 D15S1021～D15S1002多态性标志物两点连锁分析结果

5.精细定位和单倍体构建

在初步获得阳性连锁位点后，据Genome Datebase和Genethon，Whitehead InstitutePhysical Map等数据库资料，用这一节段中一切已知的多态性标志物做尽量密集的扫描，方法同上。同时从单倍体构建中寻找可能的重组(cross-over)，以期最大限度地缩短候选基因所在的区域。单倍体构建多态性标志物在染色体上的排序和距离也来自于http：//www.marshfieldclinic.org/网站资料。对家系1仍存活并有血样的3代、34个个体的单倍体分析发现，IV-7、V-1和V-7个体分别出现同源染色体间的重组，但在着丝粒方向未发现重组，因此，致病基因的关键节段位于15号染色体着丝粒与D15S97之间约9.85cM区域内(图1)。

实施例2 NIPA1基因突变检测

NIPA1基因(Homo sapiens non-imprinted in Prader-Willi/Angleman syndrom 1)其mRNA complete cDNA序列来自GeneBank(accession number BK001020)(图4)。genomic DNA序列来自http：//genome.ucsc.edu。

主要步骤：

1.PCR扩增：PCR反应体积为50μl，内含50mmol/L Tris-HCl(pH8.8)，16.6mmol/L(NH₄)₂SO₄，0.10mg/mlBSA，3.0mmol/L MgCl₂，200μmol/L dNTPs，引物P1、P2各0.2μmol/L，Taq酶2U(MBI公司)，人基因组DNA约0.1～0.7μg。PCR反应条件：94℃ 3min；94℃ 45s，60℃ 1min，72℃ 1min，35循环；最后72℃延伸10min。引物P1(SEQ ID NO：3)的序列为：5’-GTG CTG CGC CCA TTT CAG TCA-3’，P2(SEQ ID NO：4)的序列为：5’-GTG CCA TCT CAA CTC ACT GCA-3’。

2.测序反应方案：

(1)预反应：反应体积共3μl，内含PCR产物5-10ng(约0.5-1.0μl)，虾碱性磷酸酶(SAP)、外切酶I(Exo I)各0.25μl(USB公司)，补超纯水至3μl。反应混合物在PCR仪上反应，37℃温浴15min，然后85℃ 15min灭活酶。反应完毕后反应混合物直接作为测序反应的模板用。

(2)测序反应：用ABI公司的96孔板，在GeneAmp 9700 PCR仪上进行。反应体积共10μl，内含3μl的预反应产物，2μl的5×buffer，1μl的Big-Dye(ABI)，1μl引物(3.2pmol/μl)，3 μl的超纯水。反应条件：98℃ 2min；96℃ 10s，50℃ 5s，60℃ 4min，30循环；最后4℃保存。

(3)测序纯化：直接在96孔板上进行。

a)测序反应完毕后，每个样品加入90μl 75％乙醇，贴上封口铝箔，漩涡混匀；

b)室温避光20min；

c)20℃，3500rpm离心30min(5810R离心机上进行)；

d)倒去上清，倒扣在四层吸水纸上，350rpm离心30s；

e)室温避光20min，以晾干乙醇；

f)每样品加10μl超纯水，上ABI3100测序仪进行测序。

3.测序结果分析：用ABI序列分析软件进行分析

发明人在家系1中发现了第341位硷基(cDNA序列)G→C的突变，在家系2中发现了同一位点G→A的突变。2突变均位于NIPA1基因第三外显子中，这2种改变均导致第106个氨基酸由中性疏水的甘氨酸变为碱性亲水的精氨酸。故这一突变在cDNA水平上为G341C(家系1)或G341A(家系2)；在全长genomic序列为G25596C(家系1)或G25596A(家系2)改变；在氨基酸水平两家系均为G106R改变。

发明人已对家系1中共14位仍存活并采到了血样的患者及37名非患者全部进行了正、反向测序。所有患者都含有这一突变热点中G→C(G341C，G106R)(图5，图6)改变，且这一突变和疾病表型呈共分离。而家系中所有非患者全都不含这一突变(图7，8)。

发明人也对家系2中仍存活并有血样的7位患者及13位仍存活并有血样的正常人进行了双向测序。所有患者都含有突变热点中G→A改变(G341A，G106R)(图9，图10)而正常人没有这一改变(图表省去)。

发明人还对100名和本家系无血缘关系的正常人进行了测序，也全不含这一突变(图7，8)。

实施例3跨种属同源性比对

1.人类NIPA1的核苷酸序列和小鼠、大鼠的同源性比对通过网站

http：//genome.ucsu.edu/中的Comparative Sequence进行。

2.人类NIPA1的氨基酸序列和河豚、小鼠的同源性比对是参照了Chai JH等人的文章“Identification of four highly conserved genes between breakpoint hotspots BP1 andBP2 of the Prader-Willi/Angleman syndromes deletion region that have undergoneevolutionary transposition mediated by flanking duplicons”Am J Hum Genet 2003；73：898-925的比对结果。

3.人类NIPA1的序列、NIPA1的氨基酸序列和斑马鱼的同源性比对是利用软件clustalx进行的，斑马鱼相应的核苷酸和氨基酸序列来源于网站http：//www.ensembl.org。

结果显示在所有比对的动物中相当于人类NIPA1基因cDNA第341位硷基，即第106号密码子的第一位硷基均为G，密码子所编码的氨基酸全为甘氨酸(图11-14)。这一硷基在生物进化中的高度保守性说明了它在编码肽链中具有重要的生物学功能。

实施例4 NIPA1蛋白质二级结构预测

利用网站http：//www.embl-heidelberg.de/predictprotein/predictprotein.html进行，并用软件TMHMM2.0核实。相应的NIPA1的氨基酸序列从网站http：//www.ncbi.nlm.nih.gov获取。

NIPA1基因编码肽链的生物结构学的研究表明第106密码子(GGG)编码的甘氨酸位于第2跨膜区功能基中，位于α-螺旋中，故具有重要的生物功能(见图15)。而突变所导致的甘氨酸(GGG)到精氨酸(CGG，家系1；AGG家系2))的改变显然改变了这一功能基的正常生理功能，从而引起临床上的症状、体征。

实施例5    遗传性痉挛性截瘫检测试剂盒的制备

制备一试剂盒，它含有：

名称      序列(5’→3’)              编号        浓度

正向引物  GTG CTG CGC CCA TTT CAG TCA SEQ ID NO：3干粉2 OD

反向引物  GTG CCA TCT CAA CTC ACT GCA SEQ ID NO：4干粉2 OD

PCR反应液         含Taq酶、dNTP、镁离子、PCR反应缓冲液

PCR产物纯化盒     含小量PCR产物纯化的溶液，DNA吸附柱Label1

测序反应液        含Big Dye

抽取待检测病人的血液3ml，使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从血液中提取DNA。将遗传性痉挛性截瘫检测试剂盒中的PCR引物稀释到0.2μmol/L，以所提取的DNA为模板与所提供的引物进行PCR反应。使用检测试剂盒所提供的PRC产物纯化盒对PCR产物进行纯化。将纯化的产物进行测序反应后直接进行测序。观测测序所得到的序列是否有错义突变。

实施例6  药物组合物的制备

将NIPA1突变蛋白的拮抗剂与普通的药膏材料按特定的比例混合，制成含NIPA1突变蛋白的拮抗剂的药膏。使用时，将药膏施于患处，患处NIPA1突变基因所编码的突变蛋白受到抑制，使病人由于缺乏NIPA1所编码的正常蛋白而引起的遗传性痉挛性截瘫得以减轻，直至最后的消失。或将NIPA1突变基因所编码的突变蛋白制成针剂，使用时对患处进行皮下注射，直接抑制病灶处的NIPA1突变蛋白，使病人的遗传性痉挛性截瘫症状得到改善，从而达到治疗的目的。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                                    序列表

<110>中山大学

<120>利用NIPA1基因突变热点诊断、治疗遗传性痉挛性截瘫的方法

<130>031112

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>6565

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(26)..(1015)

<223>

<400>1

ggctcggagg gcgggcgcgg gcgga atg ggg act gca gct gcg gca gcg gcg    52

                            Met Gly Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala

                            1               5

gcg gcg gcg gcg gcg gcg gcc ggg gag ggg gcg cgt agc ccg agc ccc    100

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Glu Gly Ala Arg Ser Pro Ser Pro

10                  15                  20                  25

gcc gcc gtg tcg ctc ggc ctg ggc gtg gcc gtc gtg tcg agc ctg gtg    148

Ala Ala Val Ser Leu Gly Leu Gly Val Ala Val Val Ser Ser Leu Val

                30                  35                  40

aac ggg tcc acg ttc gtg cta cag aag aag ggc atc gtg cgt gcc aag    196

Asn Gly Ser Thr Phe Val Leu Gln Lys Lys Gly Ile Val Arg Ala Lys

            45                  50                  55

cgg cga ggt act tcc tat tta aca gac att gtg tgg tgg gct ggc aca    244

Arg Arg Gly Thr Ser Tyr Leu Thr Asp Ile Val Trp Trp Ala Gly Thr

        60                  65                  70

atc gca atg gct gtt ggc cag att gga aac ttc ctg gct tac acg gcg    292

Ile Ala Met Ala Val Gly Gln Ile Gly Asn Phe Leu Ala Tyr Thr Ala

    75                  80                  85

gtc ccc acg gtc ctg gta acc ccc ctg ggc gcc ctt gga gta ccg ttc    340

Val Pro Thr Val Leu Val Thr Pro Leu Gly Ala Leu Gly Val Pro Phe

90                  95                  100                 105

ggg tcc att tta gct tcc tat ctc ctg aag gaa aag ctc aac atc ttg    388

Gly Ser Ile Leu Ala Ser Tyr Leu Leu Lys Glu Lys Leu Asn Ile Leu

                110                 115                 120

ggc aag ttg ggg tgc ctg cta agc tgt gca ggc tcc gtc gtg ctg att    436

Gly Lys Leu Gly Cys Leu Leu Ser Cys Ala Gly Ser Val Val Leu Ile

            125                 130                 135

atc cac tcc cca aag tct gag agt gtg acg act cag gct gag ctg gag    484

Ile His Ser Pro Lys Ser Glu Ser Val Thr Thr Gln Ala Glu Leu Glu

        140                 145                 150

gaa aag ctg acc aac cca gtg ttt gtg ggc tac ctg tgc atc gtg ctg    532

Glu Lys Leu Thr Asn Pro Val Phe Val Gly Tyr Leu Cys Ile Val Leu

    155                 160                 165

ctc atg ctg ctg ctg ctc atc ttc tgg atc gcg ccg gcc cat ggg ccc    580

Leu Met Leu Leu Leu Leu Ile Phe Trp Ile Ala Pro Ala His Gly Pro

170                 175                 180                 185

acc aac atc atg gtc tac atc agc atc tgc tcc ttg ctg ggc agt ttc    628

Thr Asn Ile Met Val Tyr Ile Ser Ile Cys Ser Leu Leu Gly Ser Phe

                190                 195                 200

acc gtg cct tcc acc aag ggc atc ggg ctg gcg gcc caa gac atc ttg    676

Thr Val Pro Ser Thr Lys Gly Ile Gly Leu Ala Ala Gln Asp Ile Leu

            205                 210                 215

cat aac aac ccg tcc agt cag aga gcc ctc tgc ctg tgc ctg gta ctc    724

His Asn Asn Pro Ser Ser Gln Arg Ala Leu Cys Leu Cys Leu Val Leu

        220                 225                 230

ctg gcc gtg ctc ggc tgc agc atc atc gtc cag ttc agg tac atc aac      772

Leu Ala Val Leu Gly Cys Ser Ile Ile Val Gln Phe Arg Tyr Ile Asn

    235                 240                 245

aag gcg ctg gag tgc ttc gac tcc tcg gtg ttc ggg gcc atc tac tac      820

Lys Ala Leu Glu Cys Phe Asp Ser Ser Val Phe Gly Ala Ile Tyr Tyr

250                 255                 260                 265

gtc gtg ttt acc acg ctg gtc ctg ctg gcc tca gcc atc ctc ttc cgg      868

Val Val Phe Thr Thr Leu Val Leu Leu Ala Ser Ala Ile Leu Phe Arg

                270                 275                 280

gag tgg agc aac gtg ggc ctg gtg gac ttc ttg ggg atg gcc tgt gga      916

Glu Trp Ser Asn Val Gly Leu Val Asp Phe Leu Gly Met Ala Cys Gly

            285                 290                 295

ttc acg acc gtc tcc gtg ggg att gtc ctt ata cag gtg ttc aaa gag      964

Phe Thr Thr Val Ser Val Gly Ile Val Leu Ile Gln Val Phe Lys Glu

        300                 305                 310

ttc aat ttc aac ctt ggg gag atg aac aaa tct aat atg aaa aca gac      1012

Phe Asn Phe Asn Leu Gly Glu Met Asn Lys Ser Asn Met Lys Thr Asp

    315                 320                 325

tagattgcaa taggagcttg gatggttcga ggaataggca ttggaggtgg tttctggccg    1072

tgattggatg tgaagtagaa gaggtcctcg atcatggtgt tagaattgac tggatagtaa    1132

caggtggtct ggtggatagc ggggagcatg gctcagcacc agagcagagg cccagccagc    1192

cctctgcagc ccaaacgtcc ccaacggttg cctggcacca tctctctctg atgagacgaa    1252

tctcattttc atttccatta acctggaagc tttcatgaat attctcttct tttaaaacat    1312

tttaacatta tttaaacaga aaaagatggg ctctttctgg ttagttgtta catgatagca    1372

gagatatttt tacttagatt actttgggaa tgagagattg ttgtcttgaa ctctggcact    1432

gtacagtgaa tgtgtctgta gttgtgttag tttgcattaa gcatgtataa cattcaagta    1492

tgtcatccaa ataagaggca tatacattga attgttttta atcctctgac aagttgactc    1552

ttcgaccccc acccccaccc aagacatttt aatagtaaat agagagagag agaagagtta    1612

atgaacatga ggtagtgttc cactggcagg atgacttttc aatagctcaa atcaatttca    1672

gtgcctttat cacttgaatt attaacttaa tttgactctt aatgtgtata tgttcttaga    1732

ttagaataat gcaacttcga gtatgcttta atatttcaat attcaagtta caaatgtata    1792

aggcagttag aaataataca gtcacatgtc acttaatgat agggaaacat tctgagaaat    1852

gcattgtaag gtgactttat tgtgtgaaca tcatggagtg cacttataca aacctagatg    1912

ggacacctat gacccaccca ggccagatgg tacagcctgt tgctcctggg ccacacacct    1972

gtacagcatg tgaccgcact gaataccgca ggcaattgta acacagtggt gagtatttgt    2032

gtttacaaac ataggaaagg tacagtaaaa ctatggtatt acaatgttat gggaccaccg    2092

tcatgtaagt ggtatgtctt tgacagaaac atggttacgt ggttcatgac tgtatattca    2152

ctggaagata gtcaagacta aagacacatt agagcaaatt gaccccttta acatgtgatt    2212

attgtccaat taaagacagt tgatttaagt agcatgaggt attattttat ttgtattcga    2272

tctgtgttac ctgggatcca gtatcaaata tatccacatt ctttatcagc aagcattcat    2332

ggccattcag aagaaataaa ttaggtaact tgataataag gctaagtggg agagtacctg    2392

ttcaatagct catatatcga gtaccctgtc atacaggaac aagttaaagg acacaattga    2452

ggttaggcta gcttctacaa attgcaatat gcagtttttg aaagattttc taacaaaaag    2512

ccaataaatg tagccatctc cttgttgttt gcaatggcag agcatcctag agttcctcag    2572

ctaacctctc attatgtgtc ttaaatgcaa aagagccatt aattatgcca gtatttgaat    2632

caaagaggtc attctctgtc tatagtgttc ccatccatgt gttccaaatg ggagcatagc    2692

atgaagtgat gcacatattt caccacggta tcatgtactt catggccagt gttttatctc    2752

agcagggaac tacgccaagt tgaaagatgg ggttgggtaa agtagattag gtgaagtaga    2812

acataaaatt gaatagtacc caattaaagt tcctcagtaa gaaaaaaaat gtgtttttgt    2872

aggcaaaaag aacatttcta aagtctcaag gaatagcttc ctaaagtgtt gagtaaagag    2932

gctaaataaa atgagactag tttaatatag agagaaaaat acctttatgg agtaaacgtg    2992

tacatgatga tcatgggttg tcagtgattt gtgaactgag agcagcaaca acattatttt    3052

ttaaaaatct taaatcctct caatggatgg ttaacaaatg ctcaaagtcc attactcttt    3112

ttattggctc ttgcaggttt tgtgttttat catcagtgct tttagaaatg caggccttaa    3172

cttactgaac tgaactttct gaaaacgtaa tgtagcagta tcaatatact tttgggcata    3232

aaaatagttt cctaggtaag gggtgtgaga tattcaaaga atacatgtgg ctaacaagtg    3292

taatgagaaa gttcatgtgt cacatgaaaa tgatcatgtt tgtgttgcta cagcttttgt    3352

gggaaattta gtttaaaggc agctcttggt gtaccttagt atattttaat ccacaattat    3412

accattgata ctgagaggtg atacccgatg atcttctcta taatattctt agagtaaaac    3472

aaaatctcaa aagtattaat agctcttcta cccttgaagg tgactggtcc tgggacagtt    3532

agaatctttc aggtttacct ctgttcagca gatacttcag taggatacat agcttttctt    3592

ccagtgaaac aaagttcata tcatccattg tttttcaagc acgtgacacc agcctcaaag    3652

taaatgacat gaccagtggt tgaacagtct aattttcaaa tttaatatag agcatataac    3712

ttctgatttg atagtattta ttttaaaaaa ttatgttttc atcattcatt tgaaaatgaa    3772

aaagccccaa agtgagaact ttgggggagg gcctagaaca tggatagatc tcttagtggt    3832

ctttccaaaa gtacatgtac ttgaaatatt ttcattatca tactattctt tgaaaaaaaa    3892

gatgcttact gtatacttgt tttcaagcat cctctaaaat caaaggtttt gatcacaata    3952

tgcagatttc tcttgataga tacttaaata ggctatttct ctcctcttct tgggcaatgc    4012

cttgttttct cctctgaata tttgcatttg aaaggattgc ttcctgttct gctcattgat    4072

caaaggtagg gccaattaag gattctaacc ctaacccagc accacaaagc ccccctggag    4132

catcttcccg gctggcagga ccatgccatc tctgtggaga aggtgctggg gagggaagtc    4192

cttccagtgc cacatggagt gaggccctgc ccatgctggg gactttgggg aggaatttgg    4252

tattctggtg gccttgctca gctctcattg agatcttttc ctatcagaat gttagtgaat    4312

atacttcgca gctctttgtt cagcaataag gaatattctt tcaattcctg ctcttcaagc    4372

caatttacta cacccagttg tctttccaga agttcatccc agcggtaata tgttggtgtt    4432

tgttcttctt tggatttcac atctgttttc tggtagaagt gagcactgtt cacttgtgca    4492

gtcgtcttat tttccttctt cctagatgac tcagctcttt gtaaatgttg tgctcaactt    4552

ctaggggcca gttctagact ttggagatgc agtgtctccc aggtgtgcac ggacacctgg    4612

tccgtggaaa caggtgtgat gggcacaggc tgctgccctt ctgtctggtc gggggattcc    4672

tcttcttcaa gctgctcagc taacccagaa gaggggagag agtactccgg tggttcccag    4732

agcccctccc gttgtgccgc ttcgacctga cacctgctcg atgctgactt aggcttcctg    4792

ccaccaagca ggaaactaga aagagaacat ttcagtgtaa ggtctgttcc cgacagcatg    4852

gattagcttc cgtgttctga agttgttctt ttcatggtgt ctgacaccga gggcgttgtt    4912

cgtccatcag gcgggattgg atggagtctt ggtgttttgc cttctcaggg accaaaaatg    4972

tatcattgac tccttaacag tgaccttcct cccaaggaca tatccgtgtt catttttcat    5032

aggttttact catattcata ggtagattct gttaatgtga gttggaaaga aaagaccaat    5092

ttgtacacca gtcacaccac aagacagttt atcatataaa atacctcaat tttttgtatt    5152

cctcatttcc acctcacaat tgtactggtg atgaatttta agggtctgtc ctttagctta    5212

taggtgatgt ttcacatctg gccagattct tatacctcca ttgtatactt gaaaaggttc    5272

agaattacag gaacagcagt gagaatttgg cccactacca cgactcattt gtttcattca    5332

cattcctcac gtgcaacaac ataattatat tttaagaaaa tgtaactttg ttacatcaaa    5392

atatgttgtc tagtaaaaag ttgatattca gtagaacaag gatcatgtaa ataaacatct    5452

atttcacatg tacccaaaag catttaaaaa gcagaatcca gggcccagag catgagccag    5512

ggaggaggat gtttttcttc ttttctctat ttttccctaa attgtgcaaa cataggtgag    5572

tctcttaacc tttctgtgcc tcagtttttc tacctctaaa ggggtgggat ggttcttcaa    5632

attgtttcta aaacaccggc actttcagca gtgttctggt ggcctgagat gagagcaccg    5692

tgttcagaag tgcctgggag tggcacagtg gaaactccgc ttgcacggac catggagtct    5752

gctcaggacc atgctgtagg acacacagcc tcatgcgctg agaaagcaaa ggaagtgctg    5812

ggtgtaaagt ttgcatgatt ccatgaagct ttagttttcc tttttttgtt ttaaaagaaa    5872

gggttttata tgttctattg taaaatatgg aaattaaaca gggacttcag aaagccgcac    5932

agaaagatca ccttccgatg gtgtgatgtg ctcctgacat tcggccgagg tctgtattct    5992

gaaaaagatt taatggcctg tgaaacacgt ggattctgtt gcactggatt tgtaataaat    6052

gacgctgaac ttcctgcttc caagcagctc aaccctgatg ctgaactgac accaggcgaa    6112

tgtcagggct cccaaaccac tagtgccaaa gggtcatgtt gaaaagttca gaatatttat    6172

ttgtcagaat ataataattg ccccccacct tagtattttt gcactttaca gaaatttaga    6232

tactgttttt cagtggcttg agcgttttgc cttttcaaag gataactatt attttcttga    6292

aaatggaata taatcatgag aggaagaaga tgtaaaaaat gtcaaatgtt gattggttgt    6352

gtaaaagttt tgtcatagac atgtattggg gagcttccaa ttagcataca tagacacatg    6412

tgtcagtggc caagacctgc ttatattttg ctttatagat gtagtcatag catgttgtta  6472

ttgcctcatg taaataaaaa ggctattaag ttttccagta atatttatta atctgtatgt  6532

gttttaaaat aaaataactt atttctagct gaa                               6565

<210>2

<211>329

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

Met Gly Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala

1               5                   10                  15

Gly Glu Gly Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ala Ala Val Ser Leu Gly Leu

            20                  25                  30

Gly Val Ala Val Val Ser Ser Leu Val Asn Gly Ser Thr Phe Val Leu

        35                  40                  45

Gln Lys Lys Gly Ile Val Arg Ala Lys Arg Arg Gly Thr Ser Tyr Leu

    50                  55                  60

Thr Asp Ile Val Trp Trp Ala Gly Thr Ile Ala Met Ala Val Gly Gln

65                  70                  75                  80

Ile Gly Asn Phe Leu Ala Tyr Thr Ala Val Pro Thr Val Leu Val Thr

                85                  90                  95

Pro Leu Gly Ala Leu Gly Val Pro Phe Gly Ser Ile Leu Ala Ser Tyr

            100                 105                 110

Leu Leu Lys Glu Lys Leu Asn Ile Leu Gly Lys Leu Gly Cys Leu Leu

        115                 120                 125

Ser Cys Ala Gly Ser Val Val Leu Ile Ile His Ser Pro Lys Ser Glu

    130                 135                 140

Ser Val Thr Thr Gln Ala Glu Leu Glu Glu Lys Leu Thr Asn Pro Val

145                 150                 155                 160

Phe Val Gly Tyr Leu Cys Ile Val Leu Leu Met Leu Leu Leu Leu Ile

                165                 170                 175

Phe Trp Ile Ala Pro Ala His Gly Pro Thr Asn Ile Met Val Tyr Ile

            180                 185                 190

Ser Ile Cys Ser Leu Leu Gly Ser Phe Thr Val Pro Ser Thr Lys Gly

        195                 200                 205

Ile Gly Leu Ala Ala Gln Asp Ile Leu His Asn Asn Pro Ser Ser Gln

    210                 215                 220

Arg Ala Leu Cys Leu Cys Leu Val Leu Leu Ala Val Leu Gly Cys Ser

225                 230                 235                 240

Ile Ile Val Gln Phe Arg Tyr Ile Asn Lys Ala Leu Glu Cys Phe Asp

                245                 250                 255

Ser Ser Val Phe Gly Ala Ile Tyr Tyr Val Val Phe Thr Thr Leu Val

            260                 265                 270

Leu Leu Ala Ser Ala Ile Leu Phe Arg Glu Trp Ser Asn Val Gly Leu

        275                 280                 285

Val Asp Phe Leu Gly Met Ala Cys Gly Phe Thr Thr Val Ser Val Gly

    290                 295                 300

Ile Val Leu Ile Gln Val Phe Lys Glu Phe Asn Phe Asn Leu Gly Glu

305                 310                 315                 320

Met Asn Lys Ser Asn Met Lys Thr Asp

                325

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(21)

<223>引物P1

<400>3

gtgctgcgcc catttcagtc a                                            21

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(21)

<223>引物P2

<400>4

gtgccatctc aactcactgc a                                            21