转基因产品的低密度基因芯片检测方法

摘要

转基因产品的低密度基因芯片检测方法，涉及一种采用低密度基因芯片用于转基因产品的检测方法。其步骤为：选择引物与探针；处理芯片载体；制备芯片：将探针溶于超纯水，加入点样液，将探针固定在已处理的芯片载体上，点样；多基因PCR扩增；MPCR产物标记；MPCR产物的芯片杂交试验；扫描分析和数据处理：将杂交反应后的芯片插入扫描仪的检测孔内，进行结果扫描和分析处理。与传统的检测方法相比，具有快速高效，自动化程度高等特点。可同时对转基因产品中常用的启动子、终止子、筛选标记基因、抗除草剂基因、抗虫基因等9个外源DNA序列进行检测分析。

说明书

技术领域

本发明涉及一种转基因产品的检测方法，尤其是采用低密度基因芯片用于转基因产品的检测方法。

背景技术

随着转基因农作物的迅猛发展，转基因产品的环境安全与食用安全引起了各国政府和公众的普遍关注(Anklam E，Gadani F，Heinze P，et al，Analytical methods for detection anddetermination of genetically modified organisms in agricultural crops and plant-derived food products.Eur.Food Res.Technol.，2002，214，3-26)为了保护消费者的知情权和选择权，保障人们的餐桌安全，确保农产品国际贸易的健康发展，世界各国都加大了在转基因产品的检测和安全评价方面的研究投入，我国从2002年3月20日起要求对转基因产品检测并标识(中华人民共和国国务院.《农业转基因生物安全管理条例》.2001年5月23日)。与转基因产品的迅猛发展相比，转基因产品检测方法的发展相对滞后，有关的国际标准仍未出台，目前常用的检测方法主要有以下几种(Markus L，Peter B，Klaus P，et al.IUPAC collaborative trialstudy of a method to detect genetically modified soy beans and maize in dried powder.Journal of AOAC International，1999，82：923～928)：

1.免疫学方法：以表达蛋白为目标的免疫学方法是根据抗原抗体特异性反应，针对某一特定转基因产品而设计的，其中包括免疫印迹法(western blot)、酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)和试纸条法(lateral flow strip)。目前已报道一些稳定可靠的免疫学方法可检测少数几种转基因产品，如ELISA法检测RoundupReady^TM大豆的表达蛋白cp4epsps、Flavor Savr^TM番茄的表达蛋白nptII等(Stave J W，Magin K，Schimmel H，et al.AACC collaborative study of a protein method for detection ofgenetically modified corn.Cereal Foods World，2000，45：497～501)。

评价：免疫学方法具有特异性好、操作简便、费用低、对仪器和人员要求不高的特点，适用于原料和半成品分析。但是该类方法仅针对一种特异蛋白，覆盖率低；对于加工食品，受到目标蛋白的构象和含量的限制，尤其是深加工食品中目标蛋白的变性，影响抗原抗体的特异性识别，而使检测的不确定性增加；有些基因在新宿主内进行修饰，只在某些部位表达或根本不表达，也就难以用该类方法进行检测(Anklam E、Gadani F、Heinze P、et al，Analyticalmethods for detection and determination of genetically modified organisms in agricultural crops andplant-derived food products.Eur.Food Res.Technol，2002，214，3-26)。

2.定性PCR方法：以外源DNA为目标的检测方法包括DNA杂交法(southern blot)和聚合酶链式反应法(polymerase chain reaction，PCR)。DNA杂交法准确可靠，但存在灵敏度低、操作繁琐等缺点(Anklam E，Gadani F，Heinze P，et al，Analytical methods for detectionand determination of genetically modified organisms in agricultural crops and plant-derived foodproducts.Eur.Food Res.Technol，2002，214，3-26)。PCR法是指模拟体内DNA复制方式在体外选择性扩增DNA某个特殊区域的技术，通过PCR扩增转基因产品中的外源DNA序列，然后用琼脂糖凝胶电泳分析产物，是目前最常用的转基因检测方法。

评价：对设备试剂要求不高，成本低，快速简便，可用作筛选试验。但存在电泳分析粗略、易污染、检测结果需验证、难以定量、不适合大规模分析等不足(Wenjin Su，Siyang Song，Minnan Long，and Guangming Liu，Multiplex polymerase chain reaction/membrane hybridization assayfor detection of genetically modified organisms.Journal of Biotechnology，2003，105：227-233)。

3.竞争性定量PCR方法(competitive quantitative PCR)：以待测的外源DNA与竞争DNA(以缺失或插入几十bp的外源DNA序列构建的质粒)作为相互竞争底物，在同一PCR反应体系中竞争引物和酶等，其相差几十bp的PCR产物可以通过凝胶成像分析系统进行区分和定量，以系列转基因标准品DNA制作“靶DNA浓度—靶DNA产物量/竞争DNA产物量”的标准曲线，即可依据“待测DNA产物量/竞争DNA产物量”求得样品中的转基因成分含量(Hardegger M，Brodmann P，Herrmann A.Quantitative detection of the 35S promoter andthe NOS terminator using quantitative competitive PCR.Eur Food Res Technol，1999，209：83-87)。

评价：竞争性PCR法在一个反应管中同时扩增待测样品与竞争模板，消除了实验中各种可变参数的干扰，获得了较为准确的结果，可定量分析，成本较低。但存在操作繁琐、技术复杂(需构建竞争性DNA)、要求电泳分析、易污染等不足(Ke LD，Chen Z，Yung WK.A reliability test of standard-based quantitative PCR：exogenous vs endogenousstandards.Mol.Cell Probes，2000，14：127-135)。

4.荧光定量PCR(fluorophore quantitative PCR，FQPCR)法：在PCR反应体系中加入荧光标记探针，通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，所以具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性。数据的采集和分析可自动完成，简化了实验过程，减少了污染和假阳性的机会(Becker K.，D.Pan and C.B.Whitely.Real-time quantitative polymerase chain reaction to assess gene transfer.Hum.GeneTher，1999，10：2559-2566)。

评价：荧光定量PCR方法灵敏度比上述各法高，准确性和重复性好，且可定量测定(Whitcombe D，Browie J，Gillard H L，et al.A homogeneous fluorescence assay for PCRamplicons：its application to real-time，single-tube genotyping.Clin Chem，1998，44：918～923)。但目前常用的荧光定量PCR技术成本高，不便普及应用(Li Q，Luan G，Guo Q，et al.A new class of homogeneous nucleic acid probes based on specific displacementhybridization.Nucleic Acids Res.，2002，30(2)：E5-5)。

5.多基因PCR(multiplex PCR，MPCR)法：随着分子生物学的发展，转基因检测技术正由单基因PCR向多基因PCR方向发展。单基因PCR技术操作简单，但它只能检测某一特定的基因成分，若待检样品中转基因成分不明或含有多种转基因成分，就需要采用不同的PCR对可能存在的转基因成分进行多次扩增，此时PCR技术就变得繁琐费时，而且可能出现漏检引起的假阴性结果。

评价：MPCR是一种特殊的PCR技术，比单基因PCR反应更快捷、更经济，可在一个反应体系中检测多种可能的转基因成分，弥补了单基因PCR的一些不足(Minunni M，Tombelli S，Mariotti E，et al.Biosensors as new analytical tool for DNA detection.Fresenius J Anal Chem，2001，369：589-593)。目前，多基因PCR产物的检测仍然沿用传统的凝胶电泳分析方法，该方法简便易行，但缺乏特异性和灵敏性，同时容易对人和环境产生危害。

发明内容

本发明旨在提供一种高通量、快速高效、自动化程度与灵敏度较高和成本低的转基因产品的低密度基因芯片检测方法。

本发明的另一目的在于提供一种可同时对转基因产品中常用的启动子、终止子、筛选标记基因、抗除草剂基因、抗虫基因等9个外源DNA序列进行检测分析的方法。

本发明的另一目的在于提供一种可对多种转基因产品进行检测的方法。

本发明的步骤为：

1、选择引物与探针；

2、处理芯片载体：选择芯片载体，经清洗、干燥，再硅烷化，将硅烷化的芯片载体用1，4-苯二异硫氰酸盐(POC)溶液中浸泡，晾干；

3、制备芯片：将探针溶于超纯水，加入点样液，将探针固定在已处理的芯片载体上，点样，放置，清洗，晾干，干燥，备用；

4、MPCR(多基因PCR)扩增：加入DMSO(二甲基亚砜)将Cy3(单功能荧光染料)干粉重悬，将重新悬浮的染料分装到小管中，以DNA浓缩系统将其抽干，干燥，进行多基因PCR反应；

5、MPCR产物标记：取多基因PCR产物变性，进行荧光标记扩增，向反应管中加入缓冲液，变性PCR产物，每管加入无水乙醇沉淀核酸，离心，洗涤，用NaHCO₃溶解，将NaHCO₃溶解的多基因PCR产物加入到分装的Cy3染料小管中，将染料干粉重悬，放置，孵育，使用PCR产物纯化试剂盒，纯化、冻干浓缩至所需体积；

6、MPCR产物的芯片杂交试验：每个反应管加入EDTA(乙二胺四乙酸)溶液，再加入纯化的标记PCR产物，变性，取出放置于冰上，加入杂交液，制成杂交混合液，将制备的芯片滴加杂交混合液，置杂交炉中杂交过夜，杂交后的芯片经洗涤，离心，晾干；

7、扫描分析和数据处理：将杂交反应后的芯片插入扫描仪的检测孔内，进行结果扫描和分析处理。

所说的芯片载体选自玻片，尼龙膜或纤维素膜等。

基因芯片技术是20世纪90年代以来，随着人类及其它生物基因数据库急剧扩大而诞生的一种大规模、自动化、高可靠性的基因检测技术，已应用于各种病原体检测、遗传病诊断、环境监测等领域。目前芯片技术的点样密度已达到数万个探针/cm²，为转基因检测研究提供了一个强有力的工具；由于采用了现代的电子和光机电技术，基因芯片从制备到结果分析都是自动化控制；在芯片技术中设置平行实验和各种对照十分容易，数据的采集和分析由电脑完成，检测结果客观可靠；因此，高通量、快速、灵敏的基因芯片技术是转基因产品检测发展的必然方向。

本发明的转基因产品的低密度基因芯片检测方法(LD-CHIP)将目前通用的特异寡核苷酸片段固定于玻片上制成检测芯片，从待检样品中提取DNA进行多基因同时扩增、标记后与芯片进行杂交，杂交信号由扫描仪及计算机进行分析判定。

本发明首先确立了国产玻片的氨基硅烷化及POC处理程序，使玻片上的氨基转化为具有反应活性的异硫氰酸基，后者与寡核苷酸探针上标记的氨基共价结合，从而使探针牢固地结合于玻片表面。考虑到探针在玻片上的结合有一定损失，在芯片制备试验中采用了较高浓度(2μg/μL)的寡核苷酸探针，明显高于文献(Takahashi Y，Ishii Y，Nagata T，et al.Clinicalapplication of oligonucleotide probe array for full-length gene sequencing of TP53 in coloncancer.Oncology，2003，64：54-60)推荐的浓度标准(500ng/μL)，这样保证了在点样、漂洗和杂交过程中，探针仍能够维持一定的浓度。

本发明确定了转基因检测寡核苷酸芯片制备的最佳条件：采用氨基修饰并加上polyT(多聚胸苷酸)臂的寡核苷酸探针，以异硫氰酸基修饰玻片作为介质，点样后芯片室温放置，以1％的氨水、0.2％的SDS(十二烷基硫酸钠)和纯水清洗，室温晾干。

本发明选择合适的杂交条件能使多基因PCR产物与芯片上的探针之间反应处于最佳状况中，减少DNA分子之间的错配率。影响异源杂交双链形成的因素包括靶标浓度、探针浓度、杂交双方的序列组成、盐浓度及温度等。本发明确定了LD-CHIP检测的杂交温度与杂交时间。

本发明通过检测启动子、终止子和标记基因等通用基因位点来判定是不是转基因产品，通过检测抗除草剂、抗虫等各物种特定的目的基因来判定是哪一种转基因产品、是不是我国已批准的转基因产品，该方法可应用于包括大豆、玉米和马铃薯等多种转基因产品的检测，从模板提取、靶序列扩增、杂交到结果扫描可以在两天时间内完成。

DNA芯片在转基因产品检测中具有高通量、自动化等特点，显示出特有的优越性和极大的潜在用途。

基因芯片是一种高通量平行分析技术，是由大量DNA或寡核苷酸探针密集排列的矩阵，能同时检测成百上千种转基因成分，很好地解决了转基因检测中的效率问题。首先，按一定次序将寡核苷酸探针点样在芯片上，然后用标记的样品DNA多基因PCR产物与该芯片进行杂交反应，杂交信号进行扫描分析。基因芯片技术与传统的检测方法相比，具有快速高效，自动化程度高等特点。本发明建立的低密度基因芯片(LD-CHIP)可同时对转基因产品中常用的启动子、终止子、筛选标记基因、抗除草剂基因、抗虫基因等9个外源DNA序列进行检测分析。

附图说明

图1为用于转基因产品检测的低密度基因芯片的点样阵列。

图2为LD-CHIP杂交检测GM(转基因)大豆标准品(A)和GM玉米标准品(B)的扫描结果。

图3为样品LD-CHIP杂交检测扫描结果。在图3中，A(0.3％转基因大豆标准品和B(S1)：18S rRNA，CaMV 35S，Tnos，lectin和cp4epsps-1/-2结果阳性；C(0.15％转基因玉米标准品)和D(M1)：18S rRNA，CaMV 35S，Tnos，nptII，invertase和cryIAb-1/-2 arepositive；E(S-P8)和F(P3)：18S rRNA，CaMV 35S，Tnos，nptII，and cryIIIA结果阳性。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

实施例1

选择合适的引物与探针是成功进行DNA分析检测的关键。针对转基因产品中最常用的9个外源DNA以及对照基因(如18S核糖体RNA、大豆lectin内源基因和玉米invertase内源基因)的序列，通过反复多次地组合调整各项参数，经软件Primer Express^TM和OLIGO 4.0搜索分析，并进行各寡核苷酸的比较，从中选出符合要求的引物和探针。选用的引物及相关信息见表1，所用的探针及相关信息见表2。

                                      表1

引物编号引物序列(5’-3’)目标DNA18S-1TAA TAG AGC AAT GAA CAG TCG G18S-2CTT TCA ACA ACG GAT CTCTT G G18S核糖体RNAlec-1GTG CTA CTG ACC AGC AAG GCA AAC TCA GCGlec-2GAG GGT TTT GGG GTG CCG TTT TCG TCA AC大豆lectin内源基因inv-1GGC CGG ATC GTC ATG CTC TAC Ainv-2TTG GCG TCC GAC TTG ACC CAC T玉米invertase内源基因35S-3GAT TCC ATT GCC CAG CTA TCT G35S-4TAG AGG AAG GGT CTT GCG AAG GCaMV 35S启动子fmv-1AGT CCA AAG CCT CAA CAA GGT Cfmv-2CAT TAG TGA GTG GTC TGT CAG GFMV 35S启动子nos-3GAA TCC TGT TGC CGG TCT TGnos-4CGA ATT CCC GAT CTA GTA ACT-nos终止子npt-1TTT CTC GGC AGG AGC AAG Gnpt-2ACT GGG CAC AAC AGA CAA TCNPT-II筛选标记bar-1ACA AGC ACG GTC AAC TTC Cbar-2ACT CGG CCG TCC AGT CGT A草丁膦乙酰转移酶基因epsps-1TGT GCT GTA GCC ACT GAT GCepsps-2TGA TGT GAT ATC TCC ACT GAC G莽草酸-3-磷酸合成酶基因epsps-3CGA ATA TCC GAT TCT CGC TGT Cepsps-4CGC CCT CAT CGC AAT CCA C野生型CP4-EPSPSepsps-5CGT CTT GAA GGT CGT GGT Aepsps-6GCA ACA GCG AGA ATT GGA TA修饰型CP4-EPSPScry-1TCG ACA TCA GCC TGA GCC TGcry-2TGG TTG ATC AGC TGC TCG ATC杀虫毒蛋白CryIAb基因cry-3AGG CTG CCA ACC TGC ACT Tcry-4TCA AAG CCC CAC CGT TGT杀虫毒蛋白CryIAc基因cry-5TCT GGA TAC GAG GTT CTAcry-6AAA GAC GCT CAA ATT TAT GG杀虫毒蛋白CryIIIA基因

                                      表2

探针编号探针序列(5’-3’)目标DNA18s-PTTC AGA CCT CCA CCC TTG AAT18s核糖体RNAlec-PCTT CAC CTT CTA TGC CCC TGA CAC大豆lectin内源基因inv-PCGA GCA GAC CGC CGT GTA CTT CTA CC玉米invertase内源基因35S-P3GGC CAT CGT TGA AGA TGC CTC TGC CCaMV 35S启动子fmv-PTAA TCT TGT CAA CAT CGA GCAFMV 35S启动子nos-P3AAT GTA TAA TTG CGG GAC TCT AAT CT-nos终止子npt-PACT TCG CCC AAT AGC AGC CAG TCC CTT CNPT-II筛选标记bar-PAGC GCT ATC CCT GGC TCG T草丁膦乙酰转移酶基因epsps-P1TTC ATG TTC GGC GGT CTC GCG莽草酸-3-磷酸合成酶基因epsps-P3GTC TGG AAG AAC TCC GCG TCA AGG AAA GC野生型CP4-EPSPSepsps-P5TGG CTG ACT TGC GTG TTC GTT CTT CTA CTT TG修饰型CP4-EPSPScry-P1ATG TCC ACC AGG CCC AGC ACG杀虫毒蛋白CryIAb基因cry-P3TCG GTG CTC CGC GAT GTC TCC杀虫毒蛋白CryIAc基因cry-P5AAC ATA TGC ACA AGC TGC CAA杀虫毒蛋白CryIIIA基因

备注：探针5’端加上十个T并标记NH₄。

选择显微镜用载玻片(国产帆船牌)为芯片载体，用脱脂棉擦拭清洗，用重铬酸洗液浸泡，以去除表面有机物等杂质，然后用双蒸水(ddH₂O)清洗；再于25％的氨水中浸泡14h，超纯水清洗。用2mol/L的NaOH-70％乙醇浸泡2h，超纯水清洗、烘干，干燥器中冷却至室温。玻片浸入含1％的氨丙基-三甲氧基硅烷(APS)的95％乙醇(用冰醋酸调节pH至4.5)中20min，95％乙醇超声清洗5min，纯水超声清洗5min，烘干。将硅烷化的玻片用2g/L的1，4-苯二异硫氰酸盐(POC)溶液中浸泡2h；甲醇浸泡7min，丙酮浸泡5min，室温晾干。合成的寡核苷酸探针(5OD)先溶于40μL超纯水，再加入40μL 2×点样液，DNA浓度为2μg/μL。利用自动点样仪将探针固定在已处理的玻片上，依据AxSys软件设计的阵列模式(16×4)点样，每个探针重复4个点，点样体积为10nl，直径为0.25μm，点间距为0.5mm×0.5mm。点样完毕的芯片室温放置，1％的氨水清洗5min；0.2％的SDS(十二烷基硫酸钠)清洗5min；纯水清洗5min，室温晾干，干燥器中4℃保存备用。

加入12μL DMSO将Amersham的Cy3染料干粉重悬，将重新悬浮的染料以2μL/管的量分装到小管中，室温条件下以DNA浓缩系统将其抽干；干燥后的分装染料置于不透光的盒子中，干燥器中4℃保存备用。多基因PCR反应按反应体系[10×PCR缓冲液5μL，10mmol/Ld ATP(脱氧腺苷三磷酸)，dGTP(脱氧乌苷三磷酸)，dCTP(脱氧胞苷三磷酸)各0.5μL，20mmol/L dUTP(脱氧尿苷三磷酸)0.5μL，1U/μL AmpErase^ UNG酶(DNA糖基化酶)1.0μL，25mmol/L MgCl₂ 5μL，10μmol/L primer(引物)2×n μL，DMSO 2μL，50ng/μL DNA模板1×nμL，5U/μL AmpliTaq^TM Gold DNA聚合酶1μL，加入ddH₂O至50μL]和反应程序(94℃/5min；94℃/30s，55℃/30s，40个循环；72℃/5min)进行。

取多基因PCR产物于99℃变性3min；依照Ready-To-Go^TM DNA labeling Beads操作说明书进行荧光标记扩增，向新的反应管中加入1μL aa-dUTP，4μL TE(三氨基甲烷/乙二胺四乙酸)缓冲液，45μL变性PCR产物，37℃温育1h。每管加入2.5倍体积无水乙醇125μL沉淀核酸，14000r离心5min；用500μL 70％乙醇洗涤2次，用10μL 0.1mol/L NaHCO₃溶解。将NaHCO₃溶解的多基因PCR产物加入到分装的Cy3染料小管中，反复吹打，将染料干粉充分重悬；室温下放置暗处，孵育60min。使用PCR纯化试剂盒，纯化，冻干浓缩至所需体积。

每个反应管加入4μL 10mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)溶液，再加入1.33μL纯化的标记PCR产物，95℃变性10min，立即取出放置于冰上2min，加入13.3μL杂交液，制成杂交混合液。将制备的芯片平放，滴加13μL杂交混合液(含检测模板)，小心加上盖玻片，置专用杂交炉中于55℃恒温避光杂交过夜。杂交后的芯片经过严格条件下的洗涤，依次用1×SSC(氯化钠/柠檬酸钠缓冲液)、0.2×SSC、0.1×SSC洗涤，每次3min，以除去未杂交残留物，500r/m离心玻片5min，室温晾干。

将杂交反应后的芯片插入Scan Array^TM lite扫描仪的检测孔内，利用ScanArrayExpress软件进行结果扫描(扫描强度50％～60％，修正值取-5，分辨率为10μm)和分析处理。

实施例2

利用PixSys^TM 5500型全自动点样仪，设计成16×4阵列，包含14条检测目标探针，2条阴性对照，每种探针重复4个点(参见图1)。芯片上设置一段与检测探针几乎没有同源性的人类基因作为阴性对照，以排除杂交过程中非特异杂交的干扰。

实施例3

芯片杂交是指荧光标记的样品与芯片上的探针进行反应并产生一系列信息的过程。影响芯片杂交双链形成的因素包括靶标浓度、杂交液成分及杂交温度等，选择合适的条件能使杂交反应中的大多数处于最佳状况中，也就是说使尽可能多的正确配对物不遗漏，有错配的杂交降至最低。所列出的杂交程序(包括探针修饰、靶标浓度、杂交温度、杂交时间和玻片洗涤等反应条件)均已进行优化，例如探针5’端进行氨基化修饰，并连接10个胸腺嘧啶核苷(T)组成的连接臂后，可以明显提高探针在玻片上的固定效率，并改进杂交效果；杂交温度选择55℃(低于探针Tm值)和杂交时间选择过夜(＞13h)可以获得理想的杂交信号；杂交后的芯片经过严格条件下的3次洗涤(依次用1×SSC、0.2×SSC、0.1×SSC)，可以除去未杂交的绝大多数残留物。依据优化后的试验条件，应用已知阳性标准品进行了LD-CHIP检测的灵敏度试验，结果显示，LD-CHIP方法可检出0.1％的GM大豆DNA和0.1％的GM玉米DNA的MPCR产物(参见图2)。

应用建立的LD-CHIP方法对6份已知标准样(0％和0.3％的大豆粉，0％和0.15％的玉米粉，以及马铃薯S-P7和S-P8)进行了检测。结果显示，0％的大豆粉、0％的玉米粉和马铃薯S-P7只出现了相应的内参照基因杂交检测信号(如18S rRNA、lectin或invertase)；而0.3％的大豆粉，0.15％的玉米粉，以及马铃薯S-P8不仅获得了内参照基因的杂交检测信号，同时得到了特异的外源基因杂交检测信号，即大豆粉检出CaMV 35S、Tnos和cp4epsps基因，玉米粉检出CaMV 35S、Tnos、nptII和cryIAb基因，马铃薯检出CaMV 35S、Tnos、nptII和cryIIIA基因。

应用建立的LD-CHIP方法分别对6份马铃薯类样品(编号为P1～P6)，9份大豆类样品(编号为S1～S9)，6份玉米类样品(编号为M1～M6)等未知实物样品进行了检测。结果显示，5份大豆类样品(编号为S1、S2、S6、S7、S9)检出18S rRNA、lectin、CaMV35S、Tnos和cp4epsps基因，3份玉米类样品(编号为M1、M3、M6)检出18S rRNA、invertase、CaMV 35S、Tnos、nptII和cryIAb基因，2份马铃薯类样品(编号为P3、P5)检出18S rRNA、CaMV 35S、Tnos、nptII和cryIIIA基因(参见图3)；其余11份样品只有相应的内参照基因杂交检测信号。在图3中，A(0.3％转基因大豆标准品)；B(S1)：18SrRNA，CaMV 35S，Tnos，lectin和cp4epsps-1/-2结果阳性；C(0.15％转基因玉米标准品)；D(M1)：18S rRNA，CaMV 35S，Tnos，nptII，invertase和cryIAb-1/-2结果阳性；E(S-P8)和F(P3)：18S rRNA，CaMV 35S，Tnos，nptII和cryIIIA结果阳极。