毕氏酵母发酵批过程的补料优化方法

摘要

一种毕氏酵母发酵批过程的补料优化方法，属生物技术领域。在甲醇流加发酵期，首先利用基于宏观动力学模型的线性递增型补料方法使细胞比生长速率几近匀速地达到设定值，然后利用基于宏观动力学模型的抛物线型补料方法使细胞比生长速率恒定地保持在该设定值，两段补料方法转换时，甲醇的流加速率保持连续。对于毕氏酵母GS115重组人血清白蛋白的表达系统，本发明可以明显提高蛋白的产率，180小时处重组人血清白蛋白浓度和总产量较Invitrogen公司提供的补料方法提高40％。

说明书

技术领域

本发明涉及一种优化方法，特别是一种毕氏酵母发酵生产重组人血清白蛋白批过程的补料优化方法，属于生物技术领域。

背景技术

人血清白蛋白是由585个氨基酸组成的多肽链，分子量为66.5kDa。人体血浆中血清白蛋白的浓度高达42gl^-1，临床上人血清白蛋白主要用作血浆容量扩充剂，抢救休克、烧伤和失血病人以及癌症的辅助治疗。目前，人血清白蛋白制品主要从人血浆或胎盘中分离生产，产品被血液病原病毒(如乙肝病毒和爱滋病毒)污染的几率较大。近年来，随着重组DNA技术的发展，利用生物技术生产人血清白蛋白逐渐成为一条替代途径。

从产量看，毕氏酵母是迄今为止最为优良的重组人血清白蛋白的表达分泌系统。经文献检索发现，Invitrogen(美国)公司建立了毕氏酵母分批发酵生产人血清白蛋白的工艺规范(http：//invitrogen.com/content/sfs/manuals/pichiaferm prot.pdf)，该工艺把整个发酵周期定为180小时，分成三个阶段：甘油间歇发酵期、甘油流加发酵期和甲醇流加发酵期。规范中明确给出了每个阶段的发酵时间、培养基成分和发酵环境参数(温度、pH值和溶氧浓度)，同时给出了甘油流加发酵期和甲醇流加发酵期的补料方法，其中，甘油流加发酵期的补料方法是，以18.15(毫升每小时每升初始发酵液)的恒定速率流加甘油；甲醇流加发酵期的补料方法是，首先以1(毫升每小时每升初始发酵液)的速率流加甲醇2个小时；然后，每30分钟把甲醇的流速提高10％直到流速达到3(毫升每小时每升初始发酵液)；最后，保持3(毫升每小时每升初始发酵液)-的流速至发酵结束。该方法对应的甲醇流加发酵期的细胞比生长速率呈递减型，对利用毕氏酵母GS115表达重组人血清白蛋白的系统而言，这种补料控制方法所得蛋白表达量较低。检索中还发现，Ren et al.，Macrokinetic model formethylotrophic Pichia pastoris based on stoichiometric balance，Journal ofBiotechnology，106：53-68，2003(任海涛等，基于化学计量平衡的毕氏酵母宏观动力学模型，生物技术杂志，106：53-68，2003)建立了毕氏酵母的宏观动力学模型，但是文章中没有涉及产量优化问题。

发明内容

本发明针对现有技术存在的不足和缺陷，在保持Invitrogen工艺中其它工艺条件不变的前提下，基于毕氏酵母的宏观动力学模型，提供一种毕氏酵母发酵批过程的补料优化方法，使其适用于毕氏酵母发酵生产重组人血清白蛋白批过程的甲醇补料方法，该补料方法实现了甲醇诱导期-即甲醇流加发酵初期-的线性递增型补料控制和随后的恒定比生长速率的控制，弥补了Invitrogen工艺中甲醇流加发酵阶段递减型比生长速率补料方法的不足，提高了蛋白产率。

本发明是通过以下技术方案实现的，首先通过线性递增型补料方法使细胞比生长速率在诱导期末达到设定值，诱导期的时间由用户指定，记为t_in然后通过抛物线型的补料方法使细胞比生长速率恒定地保持在设定值，线性递增型补料方法和抛物线型补料方法进行转换时，保持甲醇的流加速率连续。

以下对本发明方法作具体描述：

(一)通过线性递增型补料方法使细胞比生长速率经过t_in小时达到设定值。

通过线性递增型补料控制方法适用于诱导期全程，期间甲醇补料速率是时间的一次函数，该函数的常数项和比例系数由如下方法确定：

(1)确定一次函数的常数项。本发明甲醇初始补料速率与Invitrogen公司的工艺规范相同，因此，一次函数的常数项等于1(毫升每小时每升初始发酵液)乘以初始发酵液体积(升)，其中，初始发酵液体积是指甲醇流加发酵阶段开始时的发酵液体积。

(2)确定一次函数的比例系数。首先设定一个比例系数的初值，然后利用黄金分割法进行一维搜索，目标函数是使诱导期末细胞比生长速率的模型仿真值和设定值的误差平方最小，其中，模型仿真值通过毕氏酵母宏观动力学模型获得。

(二)通过抛物线型的补料方法使细胞比生长速率恒定地保持在设定值。

抛物线型补料方法适用于诱导期结束后的剩余发酵时间，期间补料速率是时间的二次函数，该函数的常数项、一次项系数和二次项系数由如下方法确定：

(1)确定二次函数的常数项。二次函数的常数项取诱导期结束处的补料速率值，它保持了流加速率的连续性。

(2)确定二次函数的一次项系数和二次项系数。首先设定一次项系数和二次项系数的初值，然后利用单纯形法寻优，目标函数是在诱导期以后的发酵时段，使细胞比生长速率的模型仿真值和设定值的误差平方和最小。其中，模型仿真值通过毕氏酵母宏观动力学模型求得，误差平方和在时间整点计算。

与现有技术相比，本发明在任海涛等的毕氏酵母宏观动力学模型基础上，将线性补料方法和抛物线型的补料方法相结合，并且在两段补料方法转换时保持流加速率连续，使比生长速率在诱导期几近匀速地到达设定值并使随后发酵时段的细胞比生长速率恒定地保持在该设定值。这种恒定比生长速率补料方法可以较高地提高蛋白产率，发酵时间180小时处的蛋白浓度和总产量较Invitrogen公司提供的补料方法提高40％。

具体实施方式

结合本发明方法的内容进一步提供以下实施例：

对象：毕氏酵母GS115重组人血清白蛋白发酵批过程。发酵罐体积为10(升)，甘油间歇发酵期和甘油流加发酵期按Invitrogen公司提供的操作规范进行，甲醇流加发酵期的初始发酵液体积为4(升)，甲醇诱导期为20(小时)。

控制目标：使甲醇流加发酵期细胞比生长速率恒定地保持在0.006(每小时)。

具体步骤如下：

(一)在甲醇诱导期-位于甲醇流加发酵初期-首先实施线性补料方法，它的方程是：

F＝ω₁+ω₂*(t-t_f)            (t_f≤t≤t_f+20)            ①

式①中，F表示甲醇的流加流率(毫升每小时)，t是以接种时刻为计时起点的发酵时间(小时)，t_f是甲醇流加发酵期开始处的时间(小时)，ω₁是初始流加速率(毫升每小时)，其值设为4(毫升每小时)，这是由甲醇流加发酵期开始时的发酵液体积乘以1(毫升每小时每升发酵液)得出的，ω₂是比例系数，其初始值设为0.3，再由黄金分割法寻优得出准确值，寻优目标函数见式②。

$$ >\underset{}{}$$                    ②

式②中，J为目标函数值，F的含义与式①中相同，F_min和F_max是甲醇流加速率的下限和上限，它们由发酵罐的物理条件决定，μ(t_f+20)是甲醇流加发酵20小时后细胞比生长速率的模型仿真值(每小时)。

(二)线性补料方法实施20小时后，实施抛物线型的补料方法至发酵结束，它的方程是：

F＝ω₃+ω₄*(t-t_f-20)+ω₅*(t-t_f-20)²    (t_f+20＜t≤180)      ③

式③中的F、t和t_f的含义与式①中相同，ω₃是抛物线型补料方法甲醇流加速率的初始值，它和线性补料方法结束时的甲醇流加速率相等，即ω₃＝ω₁+20ω₂，这就保证了两段补料方法转换时，甲醇流加速率的连续，ω₄和ω₅是方程系数，其初始值分别设为0.0001和0.05，再由单纯形法寻优得出其准确值，寻优目标函数见式④。

$$ >\underset{}{}$$          ④

式④中的误差平方和在时间整点计算，其中，J、F_min、F_max、t和t_f的含义与式①和②中相同，μ(t)是整点时刻细胞比生长速率的模型仿真值。

按上述方法得到的甲醇流加发酵阶段的补料方法可以使细胞比生长速率恒定地保持在0.006(每小时)，最终的蛋白浓度和总产量较Invitrogen公司提供的补料方法提高40％。