一种以自由基发生源与生物反应器耦合系统促进微生物生产自由基相关酶及化合物的方法

摘要

一种以自由基发生源与生物反应器耦合系统促进微生物生产自由基相关酶及化合物的方法，涉及以物理或化学发生源产生的自由基提高自由基相关酶类及化合物的生产。以金黄色嗜热子囊菌发酵制备过氧化氢酶为例，本发明通过采用糊精和乙醇作为培养基的混合碳源，在发酵过程中流加光催化产生的含自由基的水溶液，流加速率为0.1～1.0mL/h，培养基其余组分及培养方法如说明书所述，发酵结束时，发酵液中过氧化氢酶的产量为5188U/mL。

说明书

技术领域

一种以自由基发生源与生物反应器耦合系统促进微生物生产自由基相关酶及化合物的方法，自由基可以通过光催化、超声波、放射法、Fenton试剂反应及臭氧发生法等自由基发生的物理或化学方法产生，与自由基代谢相关的酶类及化合物包括有过氧化氢酶(CAT)、辅酶Q10、过氧化物酶(POX)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽、胆红素、胱氨酸、组氨酸、牛磺酸等微生物代谢产物。

背景技术

自由基是指分子、原子或基团中有未配对电子的一类物质，包括超氧阴离子(O₂^-或H₂O^-)、羟自由基(^-OH)、单线态氧(¹O₂)、脂质过氧化物(RO^-、ROO^-与ROOH)等。

自由基具有高度的氧化活性，极不稳定，活性极高，它们攻击细胞膜、线粒体膜，与膜中的不饱和脂肪酸反应，造成脂质过氧化增强。脂质过氧化产物又可分解为更多的自由基，引起自由基的连锁反应。这样，膜结构的完整性受到破坏，引起肌肉、肝细胞、线粒体、DNA、RNA等广泛损伤从而引起各种疾病，诸如炎症癌症、扩张性心肌病、老年性白内障、哮喘等疾患。故自由基是人体疾病、衰老和死亡的直接参与和制造者。

人体靠某些酶来清除自由基，故体内自由基的产生和清除处于动态平衡状态。人类机体组织的清除自由基相关酶与化合物有：过氧化氢酶(CAT)、辅酶Q10、过氧化物酶(POX)、超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽、胆红素、胱氨酸、组氨酸、牛磺酸等。

上述酶类除了在保健、抗衰老方面具有作用外，随着研究的深入发现其应用领域也越来越广泛。以过氧化氢酶为例，它在食品、医药、临床等行业一直有着广泛的用途。它可作为消除啤酒、饮料中分子氧、活性氧和自由基的抗氧化剂。与葡萄糖氧化酶并用作为氧的去除剂，用于牛乳及干酪原料乳的杀菌。在临床分析中，对研究自由基代谢失衡，抗衰老和肿瘤发病机理具有一定价值，对某些疾病的诊断，鉴别亦具有重要意义。在医药方面，可用于隐形眼镜消毒过程中残留过氧化氢的分解。过氧化氢酶还与H₂O₂同时使用，用于橡胶成型，塑料及多泡性粘合剂。近年来随着H₂O₂在纺织、造纸、制浆等行业的普遍应用，市场对过氧化氢酶的需求呈大幅增长趋势。其中在织物染整工艺中，采用过氧化氢酶去除漂白废液中残余H₂O₂，不仅能避免给后续染色工序带来问题，大幅度提高过氧化氢去除率从而确保染色的良好可再现性，还能使漂染同浴，节省大量的水、电、汽的消耗，并显著提高生产效率。

目前自由基相关酶及化合物的生产主要有两个途径：一是从生物体内提取，二是通过微生物发酵法生产。而后者大多处于研究阶段，生产水平较低。后者的生产中，自由基的来源目前以添加过氧化氢为主要手段，还没有考虑到将自由基发生源与生物反应器相结合。由于自由基浓度升高对自由基代谢相关酶及化合物产生具有诱导作用，如果将自由基发生源结合到生物发酵过程中，将可能为微生物提供各种自由基种类并实现更为稳定的浓度控制，最终将促进自由基相关酶及化合物的生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高微生物法生产自由基相关酶及化合物如过氧化氢酶产量的方法。

本发明的技术方案，采用自由基发生源与生物反应器耦合系统促进微生物生产自由基相关酶及化合物的方法是：

A)以物理或化学方法获得稳定的自由基发生源；

B)自由基发生源与生物反应器相耦合；

C)该耦合系统所针对的对象为与自由基反应相关的所有酶类及化合物。

通过物理或化学方法产生自由基的途径主要有：

A)水经紫外线照射及光催化分解产生多种氧的自由基；

B)通过生成臭氧后进一步在水中转变成自由基；

C)通过超声波作用在水中生成自由基；

D)采用放射线照射使水分解，产生自由基；

E)利用Fenton试剂生成自由基。

自由基发生源与生物反应器相耦合的系统。包括：生物反应器与自由基发生源的串联系统；生物反应器与自由基发生源的流加组合系统；生物反应器与自由基发生源的一体化系统。

本发明涉及的促进微生物合成的相关酶类及化合物，包括：过氧化氢酶、辅酶Q10、过氧化物酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、胆红素、胱氨酸、组氨酸、牛磺酸。

本发明方法还可用于筛选对自由基及活性氧具有抗性的微生物菌种的筛选方法。

本技术方案自由基发生源以二氧化钛光催化反应器为例，生产的自由基相关酶及化合物以过氧化氢酶为例。

自由基发生源：二氧化钛光催化反应器，紫外灯为光源。

菌种：金黄色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)IFO9862，购自日本NBRC(原日本“大阪发酵研究所”)。

培养基

斜面培养基PDA(g/L)：马铃薯200，葡萄糖20，琼脂16，pH6.0。

种子培养基(g/L)：酵母膏4，玉米淀粉15，K₂HPO₄ 1，Na₂HPO₄ 1，MgSO₄·7H₂O 0.5，pH6.8。

发酵培养基(g/L)：糊精10～30，乙醇0.5％～3％(培养基体积比)，蛋白胨5～20，K₂HPO₄ 5，KH₂PO₄·3H₂O 3，MgSO₄·7H₂O 2，pH7.0。

培养方法：将成熟的孢子接种到PDA斜面上，45℃下培养6-8d。待孢子成熟后，刮取斜面上的孢子，用无菌水制成孢子悬液接种于种子培养基中，45℃摇床培养至对数生长后期。吸取种子培养液，按5-12％的接种量接种于发酵培养基中，5L生化反应器培养5天。

过氧化氢酶活性测定：发酵液经真空抽滤后的清液直接用于过氧化氢酶活力的分析。过氧化氢酶活力采用分光光度法在25℃下测定。反应总体积为3mL，含0.1ml酶液和2.9ml含有10mmol/L H₂O₂的50mmol/L的磷酸二氢钾、磷酸氢二钠缓冲液(pH7.0)。过氧化氢的分解速率用752型紫外-可见光分光光度计在240nm下测定。酶活定义为：在25℃下，每分钟分解1μmol H₂O₂所需的酶量为一个酶活单位。

提高过氧化氢酶产量的培养方式：在发酵体系中流加由光催化产生的自由基。

5L发酵罐培养时，罐中装3L培养基，实罐灭菌，冷却后用NaOH调节pH至7.0。通气量为0.5vvm～1.5vvm，搅拌转速为300r·min^-1～500r·min^-1，接种量为2％～10％。培养基中流加光催化产生的含自由基的水溶液，流加速率为0.1～1.0mL/h。5天后发酵液中过氧化氢酶水平达到5188U/mL。

本发明的有益效果，本发明选用的光催化自由基发生源可以稳定产生各种自由基，通过流加方式加入到生物发酵体系中，对金黄色嗜热子囊菌(Thermoascusaurantiacus IFO9862)合成过氧化氢酶具有很强的诱导与刺激作用。通过上述光催化反应器与生物反应器的耦合工艺，在5L发酵罐中恒速流加自由基，5天后过氧化氢酶水平达到5188U/mL。

具体实施方式

实施例1

以乙醇为单一碳源，培养基其余组分及培养方法如说明书所述，发酵结束时，发酵液中过氧化氢酶的产量为408U/mL。

实施例2

以糊精为单一碳源，培养基其余组分及培养方法如说明书所述，发酵结束时，发酵液中过氧化氢酶的产量为882U/mL。

实施例3

采用由糊精和乙醇组成的混合碳源，培养基其余组分及培养方法如说明书所述，发酵结束时，发酵液中过氧化氢酶的产量为1594U/mL。

实施例4

在实施例1的基础上，发酵中流加光催化产生的含自由基的水溶液(10mmol/L，以过氧化氢当量计)，流加速率为0.1～1.0mL/h，培养基其余组分及培养方法如说明书所述，发酵结束时，发酵液中过氧化氢酶的产量为1020U/mL。

实施例5

在实施例2的基础上，发酵中流加光催化产生的含自由基的水溶液(10mmol/L，以过氧化氢当量计)，流加速率为0.1～1.0mL/h，培养基其余组分及培养方法如说明书所述，发酵结束时，发酵液中过氧化氢酶的产量为1680U/mL。

实施例6

在实施例3的基础上，发酵中流加光催化产生的含自由基的水溶液(20mmol/L，以过氧化氢当量计)，流加速率为0.1～1.0mL/h，培养基其余组分及培养方法如说明书所述，发酵结束时，发酵液中过氧化氢酶的产量为5188U/mL。