一种生物活性肽－丝素肽的制备方法

摘要

一种生物活性肽－丝素肽的制备方法，属于食品生物技术领域。本发明以下脚蚕茧或废蚕丝为原料，经0.3－1.0％(w/v)的Na2CO3溶液精练后，用20－60％(w/w)的CaCl2溶液加热溶解得溶丝液，在pH2.5－12.0，30－80℃下用蛋白酶对溶丝液进行酶水解反应，再用纳滤技术脱除酶解液中高浓度的CaCl2盐，浓缩液进行喷雾干燥，即制得产品丝素肽粉末。本发明优点是处理量大，脱盐率高，分离条件温和，流程简单及能耗较低，可实现工业化生产，制备高纯度的丝素肽粉末，用于功能性食品的开发。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物活性肽—丝素肽的制备方法，具体涉及利用酶法水解溶丝液，再用纳滤技术脱除酶解液中高浓度的氯化钙来制备丝素肽的方法，属于食品生物技术领域。

背景技术

蚕丝是一种纤维蛋白，由丝素和丝胶组成，其中丝素占70％～80％，丝胶占20％～30％，丝素蛋白由18种氨基酸组成，85％左右为甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和酪氨酸。丝素肽(丝肽)是丝素蛋白水解的中间产物，通常是将蚕丝脱胶后的丝素经溶解、透析、提纯、降解、浓缩等工序，采用喷雾干燥法制成高纯度丝肽粉。丝肽与丝素的氨基酸组成相同，但其分子量比丝素要小得多，分子构象以无规卷曲结构为主，聚集态结构呈疏松无序结构。因此，丝肽具有良好的水溶性，优良的吸湿保湿功能，较好的酸、热稳定性，粘度随浓度变化迟钝等优点。

丝素中氨基酸的组成，具有很高的营养价值，随着生物技术和其它高新技术的发展，国内外对丝素的食用研究也越来越重视。动物试验表明甘氨酸能降低血液中胆固醇的浓度，丙氨酸具有促进酒精代谢的功能，酪氨酸可预防痴呆症，丝氨酸具有防治皮肤老化、抗辐射、防止白血球下降的作用。因此，富含丝素肽的食品具有很好的营养保健作用，可以作为一种功能性食品，其研究开发也因此受至重视。

丝素肽的生产，一般采用酸法水解丝素或丝素用中性盐溶解后再经酶水解，控制一定的水解条件可以获得各种不同分子量的丝素肽。采用酸法水解丝素制取丝素肽，此法虽然简单、便宜，但是其缺点是水解度不易控制，产品分子量分布在300-5000这样一个很广的范围内，同时酸水解使色氨酸全部破坏，丝氨酸、酪氨酸和苏氨酸部分破坏。酶水解反应条件温和，水解度易控制，对氨基酸破坏小，而且它具有专一性，不同的酶水解丝素溶液能得到不同的中间产物，还有一个优点是酶解产物的含盐量低。因此，采用酶法水解丝素，可大大提高丝素肽的产量和质量。

因为天然丝素不溶于水，难以被酶直接水解，所以用酶水解丝素，首先要制备丝素溶液。当前人们大多采用高浓度的CaCl₂溶液溶解丝素，待丝素溶解液冷却脱盐后，即获得无色、无味、无臭的纯净的丝素溶液，分子量约为6万。脱盐工序，通常采用超滤、电渗析等膜技术脱盐，但该法膜污染非常严重，难以实现工业化生产。

发明内容

本发明目的是提供一种生物活性肽—丝素肽的制备方法。对传统的酶水解法制备丝素肽的生产工艺进行改进，即丝素溶液先不脱盐，而是先加入酶进行酶水解反应，然后酶解液用纳滤技术脱盐，可实现工业化规模生产丝素肽产品。此工艺目前在国内外还未见报道。

本发明所述一种丝素肽的制备方法，具体内容涉及利用酶法水解溶丝液，再用纳滤技术脱除酶解液中高浓度的氯化钙来制备丝素肽。是以下脚蚕茧或废蚕丝为原料，经0.3-1.0％(w/v)Na₂CO₃溶液精练，精练后，用20-60％(w/w)的CaCl₂溶液在50-140℃溶解，溶丝液在pH2.5-12.0，30-80℃下用蛋白酶进行酶水解反应，控制水解度(DH)为5-25％。反应结束后灭酶，离心、过滤，得滤液即酶解液，酶解液用纳滤膜进行纳滤脱盐，脱盐后料液浓缩后进行喷雾干燥，即制得丝素肽粉末。

纳滤(NF)膜是介于反渗透(RO)膜和超滤(UF)膜之间的一种膜，其膜表层孔径处于纳米级范围(10^-9米)。纳滤膜由于截留分子量介于超滤和反渗透之间，同时还存在道南(Donnan)离子效应的影响，因此对低分子量有机物和盐的分离有很好的效果，且具有不影响分离物质的生物活性、节能、无公害等特点。纳滤膜可采用聚酰胺膜、聚醚砜膜、醋酸纤维素膜、磺化聚砜膜或聚乙烯醇膜等。

制备丝肽过程中，用中性盐溶液溶解丝素制得丝素溶液，再用酶水解溶丝液，然后用纳滤膜分离技术脱除酶解液中大量中性盐，脱盐率可达98％以上。

本发明的优点是，采用先酶法水解溶丝液，再用纳滤膜分离技术脱除酶解液中高浓度的CaCl₂盐，此法具有处理量大、脱盐率高、分离条件温和、流程简单及能耗较低等优点，是一种高效的脱盐方法，可实现工业化生产。

附图说明

图1，图2为DH＝12％的丝素肽溶液纳滤脱盐实验数据曲线图。

图1为浓缩液、透过液的电导率随时间的变化。

图2为浓缩液、透过液的离子含量随时间的变化。

图3，图4为DH＝10％的丝素肽溶液纳滤脱盐实验数据曲线图。

图3为浓缩液、透过液的电导率随时间的变化。

图4为浓缩液、透过液的离子含量随时间的变化。

具体实施方式

实施例1

水解度(DH)＝12％的丝素肽粉末的制备

废蚕丝(落绵)经0.5％(w/v)的Na₂CO₃溶液精练后，置于沸腾的40％(w/w)CaCl₂溶液中溶解5分30秒(按100mlCaCl₂溶液溶解14g精练丝进行溶解)，迅速冷却。溶丝液经纱布过滤后得到浓溶丝液，取8升浓溶丝液，加12升水，在pH8.5、60℃下用Alcalase酶进行酶解反应，采用pH-stat法控制水解程度。反应结束后加热灭酶，离心、过滤后，滤液用聚酰胺纳滤膜脱盐，在脱盐过程中不断加水稀释料液，脱盐后的料液浓缩后进行喷雾干燥即制得丝素肽粉末。

DH＝12％的丝素肽溶液纳滤脱盐实验

图1显示浓缩液、透过液的电导率随时间的变化，由图1可以看出，随脱盐时间延长，浓缩液、透过液的电导率均下降，且脱盐时间为4h左右时，电导率下降显著，此后，随脱盐时间延长，电导率下降缓慢。

由图2可见，随脱盐时间延长，浓缩液、透过液的钙离子和氯离子含量均下降，与电导率的变化趋势一致。

酶解蛋白质的水解度测定：

在中性及碱性条件下采用pH-stat法

在酸性条件下采用TNBS法

丝素肽回收率：脱盐后料液氮含量/脱盐前料液氮含量

脱盐率：(1--脱盐后料液Ca²⁺含量/脱盐前料液Ca²⁺含量)×100％

            表1  脱盐前后料液钙离子含量的变化

                 料液           钙离子含量(g)

                 脱盐前         1335.87

                 脱盐后         26.04

                 脱盐率(％)     98.05脱盐率高于98％，回收率高于80％。脱盐后浓缩液进行喷雾干燥，干燥条件：进风温度：150-220℃，出风温度：60-90℃。

             表2  丝素肽产品的分析结果

     肽含量(％)    含水量(％)    灰分含量(％)

     85.15         5.10          9.75

产品为淡黄色粉末，复水性良好。

实施例2

水解度(DH)＝10％的丝素肽粉末的制备

废蚕丝(落绵)经0.5％(w/v)的Na₂CO₃溶液精练后，置于沸腾的40％(w/w)CaCl₂溶液中溶解5分30秒(按100mlCaCl₂溶液溶解14g精练丝进行溶解)，迅速冷却。溶丝液经纱布过滤后得到浓溶丝液，取7升浓溶丝液，加7升水，在pH8.5、60℃下用Alcalase酶进行酶解反应，采用pH-stat法控制水解程度。反应结束后加热灭酶，离心、过滤后，滤液用聚醚砜纳滤膜脱盐，在脱盐过程中不断加水稀释料液，脱盐后料液经浓缩后进行喷雾干燥即制得丝素肽粉末。

DH＝10％的丝素肽溶液纳滤脱盐实验

图3显示浓缩液、透过液的电导率随时间的变化，由图3可以看出，随脱盐时间延长，浓缩液、透过液的电导率均下降，且脱盐时间为100min左右时，电导率下降显著，此后，随脱盐时间延长，电导率下降缓慢。

由图4可见，随脱盐时间延长，浓缩液、透过液的钙离子和氯离子含量均下降，与电导率的变化趋势一致。

              表3  脱盐前后料液钙离子含量的变化

              料液                钙离子含量(g)

              脱盐前              742.33

              脱盐后              11.92

              脱盐率(％)          98.39

脱盐率高于98％，回收率高于80％。

脱盐后浓缩液进行喷雾干燥，干燥条件：进风温度：150-220℃，出风温度：60-90℃。

产品成分与表2基本相同。