酶法水解丝素蛋白工艺的优化及丝素肽抗氧化活性功能的研究

摘要

本研究以桑蚕茧壳为原料，将其浸泡、除杂后，按1∶50(w/v)的比例加入0.5％Na2CO3溶液，煮沸60min脱胶。以1∶10(w/v)的比例加入到50％CaCl2溶液中，煮沸溶解丝素，经超滤脱盐后制得丝素蛋白溶液。通过六种酶对家蚕丝素蛋白水解的试验表明，Alcalase2.4L水解效果最佳，复合风味蛋白酶Flavorzyme次之，由正交表极差分析结果可知，单酶水解(1)碱性蛋白酶Alcalase2.4L水解丝素蛋白的最佳作用条件是：8％的丝素溶液中加入1％的酶，在pH值为8，55℃条件下反应6h，水解度可达到39.34％，氨基氮含量为3.43g/l，多肽含量为53.68g/l，回收率为76％；(2)Flavorzyme水解丝素蛋白的最佳作用条件是：在pH值7、酶浓度6％、底物浓度8％、反应时间3h、50℃的条件下，水解度可达38.31％，氨基氮含量为2.86g/l，多肽含量为46.39g/l，回收率为80％。 通过酶解工艺的优化，采用双酶水解时，先以碱性蛋白酶Alcalase2.4L确定的最佳作用条件水解后，再用Flavorzyme继续水解丝素蛋白，在pH值7的条件下，酶浓度2％，底物浓度8％，反应时间3h，温度50℃，是其最佳水解工艺。在此作用条件下，水解度可达44.13％，氨基氮含量为5.73g/l，多肽含量为66.8g/l，其回收率为69％。SDS-PAGE电泳检测证明，双酶水解后，水解产物的分子量由经CaCl2处理后的大约65KDa降到10KDa以下。 双酶水解后制得的丝素肽通过SephadexG-25和DEAE-52柱层析纯化后，经毛细管电泳鉴定其得到了纯化；分别采用NBT光还原法、D2-脱氧核糖法和体外动物实验模型研究了丝素肽的抗氧化作用，结果表明：丝素肽对超氧阴离子自由基和羟基自由基有很强的清除作用，清除率分别为65.7％和65.2％，并且能显著地抑制H2O2诱导的红细胞氧化溶血反应的发生。氨基酸分析结果表明，丝素抗氧化肽由12种氨基酸组成，约占氨基酸总含量的21％，含有4种人体必需氨基酸(Val、Ile、Leu、Lys)。

目录

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摘要

前言

第一章酶解前丝素液的制备

第二章酶解工艺的研究

第三章酶解产物的分离鉴定

第四章丝素抗氧化活性肽的分离与鉴定

参考文献

附录 SDS——PAGE测定丝素肽分子量的方法

致 谢

攻读学位论文期间发表文章