新型速激肽、其前体肽及其编码基因

摘要

提供从软体动物真蛸的后部唾液腺分离、纯化的速激肽,这些速激肽是表现出以下特性的速激肽:(1)氨基酸残基数为12;(2)N末端为Lys;(3)C末端的5个氨基酸具有氨基酸序列式(I)－Phe－Xaa－Gly－Leu－Met－NH2(I)(式中,Xaa表示Val、Ile、Phe或Tyr),通过在分子水平上的结构活性相关的研究,可以提供研制医药和农药的新途径。其中特别提供氨基酸序列(1)H－Lys－Pro－Pro－Ser－Ser－Ser－Glu－Phe－Val－Gly－Leu－Met－NH2和(2)H－Lys－Pro－Pro－Ser－Ser－Ser－Glu－Phe－Ile－Gly－Leu－Met－NH2表示的新型肽。

说明书

技术领域

本发明涉及具有脊椎动物肠道收缩活性的新型速激肽及其前体肽，具体地说，涉及得自真蛸(章鱼，Octopus vulgaris)的后部唾液腺、具有脊椎动物肠道收缩活性的新型速激肽、其前体肽及其编码基因。

背景技术

章鱼唾腺精(eledoisin)是从海洋ジヤコウダコ(Eledone moschata和E.aldrovandi)后部唾液腺的丙酮提取物中分离的，显示出对狗具有强降压作用，章鱼唾腺精是由11个氨基酸残基构成的生理活性神经肽(Erspamer，V.等，Experientia，18，58，1962)。这种章鱼唾腺精除了具有降压作用外，还具有使豚鼠回肠收缩的作用。此外，在静脉注射的情况下，明显具有促进狗唾液分泌的特殊作用。

此后，从青蛙皮肤中分离出具有同样作用的肽，将其命名为泡蛙肽(Erspamer，V.等，Experientia，20，489，1964)。

由于这些肽具有使豚鼠回肠迅速收缩的作用，故与缓激肽(brady(缓慢地)kinin(动作的物质))相对，将这些肽命名为速激肽(tachy(＝快速)kinin，使快速收缩的物质)。此外，根据这些肽的结构，P物质的结构也清楚了。

被分类为速激肽的肽随后相继从两栖类(Yasuhara，T.等，Biomed.Res.，2，613，1981)和鸟类(Conlon，J.M.等，Regulatory Peptides，20，171，1988)等的脊椎动物中分离出来，但从无脊椎动物中分离出来的除章鱼唾腺精以外，仅从传播黄热病的蚊子中发现唾液激肽(sialokinin)(Champagne，D.E.&Ribeiro，J.M.：Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91，138，1994)。

目前，速激肽是对在肽的C末端具有下式所示通常的氨基酸序列：

-Phe-Yaa-Gly-Leu-Met-NH₂(式中，Yaa是芳族氨基酸(Phe、Tyr)、支链氨基酸(Val、Ile))、表现出肠道收缩作用、降压作用、促进唾液分泌作用等的生理活性肽的总称。在这样的速激肽中除了上述的P物质、章鱼唾腺精、泡蛙肽外，还包括神经激肽A、神经激肽B、肛褶蛙肽等(生物学辞典(第4版)，岩波书店，1997)。

这样，期望可将速激肽用作新药开发的基础化合物，特别是，由于认为P物质作为初级感觉神经的递质，与疼痛的传递有关，因此预期可将其开发作为镇痛药，并且一直在对此进行研究。此外，预期也可将其用作试剂，以阐明高等动物神经系统中的信息处理机构。

然而，真蛸的后部唾液腺除含有上述章鱼唾腺精外，还含有具有使甲壳类动物麻痹的效应的糖蛋白、章鱼毒素(cephalotoxin)、已知为河豚毒的河豚毒素等有毒物质，因此称为毒腺。此外，已知有含有章鱼胺、5-羟色胺、酪胺、去甲肾上腺素、组胺、乙酰胆碱等生物必需胺类以及蛋白水解酶、透明质酸酶等酶类的物质(Boucaud-Camou，E.&Boucher-Rodoni，R.1983.Feeding and digestion in Cephalopods.载于“The mollusca”，(Saleuddin，A.S.M.&Wilbur，K.M.)，Academic pressand New York.)。可是，没有关于发现除章鱼唾腺精以外的速激肽的报道。此外，虽然已知章鱼唾腺精具有使哺乳动物平滑肌收缩、血管扩张和降压的作用，但是关于章鱼唾腺精对真蛸的作用却几乎一无所知。

因此，需要从更多的动物物种中发现速激肽，以了解速激肽对各种动物物种的作用以及物种特异性，通过结构-活性相关性研究等阐明高等动物神经系统中的信息处理机构以及获取可用于药品开发的信息。

因而，本发明的课题是发现新的速激肽、了解其结构、阐明其生理活性、提供能够用作试剂以阐明高等动物神经系统的信息处理机构、或者用作研制农药或者药品的基础化合物。

此外，本发明的课题还在于弄明白这些速激肽的前体肽以及编码这些速激肽的基因，提供所述速激肽的制备方法。

发明的公开

为了解决上述课题，本发明提供具有以下特性的速激肽：

(1)氨基酸残基数为12个；

(2)N末端是Lys；

(3)C末端的5个氨基酸由下面的氨基酸序列(I)表示，

   -Phe-Xaa-Gly-Leu-Met-NH₂                (I)(式中，Xaa表示Val、Ile、Phe或Tyr)。

其中本发明提供由以下氨基酸序列(II)所示的速激肽：

H-Lys-Pro-Pro-Ser-Ser-Ser-Glu-Phe-Xaa-Gly-Leu-Met-NH₂  (II)(式中，Xaa表示Val、Ile、Phe或Tyr)。

此外，在本说明书中，若无具体说明，则氨基酸残基用IUPAC和IUB确定的3字母表述。

也就是说，本发明者们为了从真蛸的后部唾液腺获得新型速激肽，将鱼类(鲤鱼)的直肠收缩作为指标进行检查，从真蛸的后部唾液腺分离纯化出在上述氨基酸序列(II)中用氨基酸序列式(1)和式(2)表示的速激肽：

H-Lys-Pro-Pro-Ser-Ser-Ser-Glu-Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH₂  (1)(以下将这种速激肽称为化合物(1))

H-Lys-Pro-Pro-Ser-Ser-Ser-Glu-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH₂  (2)(以下将这种速激肽称为化合物(2))确定了其化学结构，并且通过全合成确认了其结构和生理活性。

此外，本发明者们根据上述氨基酸序列制备了引物，对从真蛸后部唾液腺制备的总RNA，通过组合使用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法等基因序列分析方法，确知作为速激肽前体的多肽的完整的一级氨基酸序列如序列标识号3所示。

本发明者们还确定了编码所述速激肽的前体多肽的基因具有序列标识号4中所示的核苷酸序列。

因而，作为另一方案，本发明提供具有序列标识号3所示氨基酸序列或在该氨基酸序列中添加、缺失1个或多个氨基酸和/或用其它氨基酸置换1个或多个氨基酸而被修饰的氨基酸序列的速激肽前体多肽。

此外，作为再一方案，本发明提供编码所述速激肽及其前体多肽的基因、特别是由序列标识号4所示的核苷酸序列构成的基因、以及含有这些基因的载体以及用载体转化的宿主、或者用这些基因通过基因重组技术制备前体多肽和速激肽的方法。

附图简述

图1是反相HPLC的展开图，显示在实施例2中作为本发明肽的化合物(1)的最终洗脱图形。

图2是反相HPLC的展开图，显示在实施例3中作为本发明肽的化合物(2)的最终洗脱图形。

图3表示实施例6中本发明化合物(1)使鲤鱼直肠收缩的活性的结果，显示了将相当于1只真蛸量的化合物(1)加入到腔中时的结果。

图4表示实施例6中本发明化合物(2)使鲤鱼直肠收缩的活性的结果，显示了将相当于1只真蛸量的化合物(2)加入到腔中时的结果。

图5表示实施例7中本发明化合物(1)使豚鼠回肠收缩的活性的结果，显示了在腔中加入1×10^-8M化合物(1)时的结果。

图6表示实施例7中本发明化合物(2)使豚鼠回肠收缩的活性的结果，显示了在腔中加入1×10^-8M化合物(2)时的结果。

图7表示在本发明前体多肽的氨基酸序列中，对应于本发明速激肽的氨基酸序列的存在部分(下划线部分)。

实施本发明的最佳方式

本发明提供的新型肽是具有使脊椎动物肠道收缩作用的速激肽，可以从真蛸中按照例如以下方法进行分离纯化。

也就是说，用热水从真蛸后部唾液腺进行提取，向该提取液中加入乙酸至3％的浓度，冷却后离心分离获得粗制提取物。使所述粗制提取物吸附在C18柱(例如Sep-Pak(注册商标)柱：Waters Co.制造)中后，用含有0.1％三氟乙酸(以下简称为TFA)的60％甲醇洗脱，分别收集肽流分，对该流分进行离子交换层析、反向层析等，可以分离、精制目标肽。

此外，由于本发明的肽是氨基酸残基数为12的肽，因此可以用通常的肽合成仪(例如433A型肽合成仪，PE Bio Systems Japan制造)通过固相合成法等常规有机合成化学的方法来容易地合成。用这些方法获得的粗制肽，在必要时可以通过反相高效液相色谱法或结晶等常用的精制方法，将本发明的肽进行精制。

另一方面，可以如下测定从真蛸分离的速激肽前体多肽的氨基酸序列以及编码所述多肽的基因的核苷酸序列。

即根据如上所述获得的速激肽的氨基酸序列制备引物，对从真蛸后部唾液腺制备的总RNA进行反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，测定了约500个碱基对的基因序列，然后可以用5’-RACE法、3’-RACE法测定5’末端和3’末端的基因序列。在本发明中，按照这种方法确定了真蛸的速激肽前体多肽具有序列标识号3所示的氨基酸序列，编码该前体多肽的基因具有序列标识号4所示的核苷酸序列。

因而，本发明的速激肽前体多肽以及速激肽可以通过基因重组法来制备。亦即当通过基因重组法制备时，例如可以构建插入了序列标识号4所示基因的载体，用所述载体转化宿主后，培养所述宿主或者使其生长，从所述宿主或所述宿主的培养液分离精制目标前体多肽。然后，为了从前体多肽获得目标速激肽，可以使用酶等对前体多肽进行切下(加工)和修饰，必要时可以进行精制。

由于本发明的肽是引起脊椎动物平滑肌收缩、血管扩张和降压的速激肽，因此不仅可以将其用作研究神经传递系统的试剂，还可以将其用作有用的化合物来提供药物开发的新途径。

例如，以本发明的肽作为有效成分的药物，可以与药剂学上常用的赋形剂一起以胶囊、片剂、注射剂等适当的剂型，经口或经胃肠外给药。具体地说，可以将本发明的肽与乳糖、淀粉或其衍生物、纤维素衍生物等赋形剂混合，然后充填到明胶胶囊中，配制胶囊剂。

另外，除了上述赋形剂之外，还可以加入羧甲基纤维素钠、藻酸、阿拉伯树胶等粘合剂以及水进行捏合，必要时制粒，然后进一步加入滑石、硬脂酸镁等润滑剂，用通常的压片机压片，制备片剂。

当胃肠外给药时，可以用助溶剂和无菌蒸馏水或无菌生理盐水溶解本发明的肽，将其密封到安瓿中，制成注射剂。在这种情况下，根据需要还可以含有稳定剂、缓冲物质等。另外，可以将本发明的肽以粉末形式填充到管形瓶中，制备成使用时加入无菌蒸馏水溶解的制剂。这些胃肠外制剂可以通过静脉注射或静脉点滴给药。

另外，本发明的作为有效成分的肽的给药量可以考虑各种因素例如所要治疗的病症、患者的症状、严重程度、患者的年龄以及给药途径等适当地设定。一般而言，在口服时，作为有效成分，通常在0.1-1000mg/天/人、优选1-500mg/天/人的范围内适当选择给药，而在胃肠外给药时，在口服给药量的约1/100-1/2左右的范围内适当选择给药。

实施例

以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的范围不仅仅限于这些实施例。实施例1：得自真蛸的具有鲤鱼直肠收缩增强作用的肽类的分离

(a)：粗提取

摘取100只真蛸的后部唾液腺，将其冷冻保存在液氮中。将冷冻保存的摘取组织(221g)分成3等份，将其中1/3加入800ml沸腾的蒸馏水中，煮沸10分钟。冷却后，加入乙酸至3％的浓度，搅匀后，在4℃以10,000×g离心分离30分钟，得到上清液。另一方面，向沉淀中加入200ml 3％乙酸，再次搅匀后，经过同样离心分离，获得上清液。再次向沉淀中加入200ml 3％乙酸，经过同样处理，获得上清液。将剩余的摘取组织分2次，如上所述分别进行3次提取操作，获得上清液。合并所得的上清液，将其减压浓缩至约200ml，得到粗制提取物。

(b)：向C18柱的吸附

向(a)得到的粗制提取物中加入20ml 1.0M HCl，在4℃以30,000×g离心分离30分钟。让所得的上清液通过Sep-Pak(注册商标)VacC18柱(10g，35cc，Waters Co.制造)。用200ml 0.1％TFA洗涤柱子之后，用100ml 60％甲醇/0.1％TFA洗脱保留的物质，将洗脱液减压浓缩后，将其冷冻干燥，获得干燥物质0.363g。

(c)：阳离子交换柱层析(1)

将在(b)中获得的干燥物质溶于150ml 10mM磷酸缓冲液(pH 7.0)中，使用TSK凝胶SP TOYOPERL PACK 650S(20-50μm，Φ22×200mm，Tosoh Co.制造)进行阳离子交换柱层析(阳离子交换HPLC)，在100mM磷酸缓冲液(pH 7.0)中，用60分钟，以0M-0.6M NaCl线性浓度梯度、3.0ml/min的流速洗脱。通过215nm的紫外线吸收监测，以每6ml收集流分，按照下述实施例6所述的方法，对洗脱的各流分进行生物测定，发现在0M NaCl浓度下洗脱的流分具有直肠收缩增强活性。

(d)：反相高效液相柱层析(1)

用Capcell pak C18 UG80(5μm，Φ10×250mm，资生堂生产)，对在(c)中所得的活性流分进行反相高效液相柱层析(反相HPLC)，在0.1％TFA(pH 2.2)中，用60分钟，以0％-60％的乙腈线性浓度梯度、1.5ml/min进行洗脱。对每3ml的洗脱流分进行生物检测，发现用30％-36％的乙腈洗脱的流分具有活性。

(e)：阳离子交换HPLC(2)

对(d)中获得的流分用TSK凝胶SP SP-5PW(10μm，Φ7.5×75mm，Tosoh Co.制造)进行阳离子交换HPLC，在10mM磷酸缓冲液(pH 4.7)中，用60分钟，以0M-0.6M NaCl的线性浓度梯度、1.0ml/min的流速进行洗脱。对每2ml洗脱流分进行生物测定，发现在0.13-0.15M NaCl浓度下洗脱的流分具有活性。

(f)：反相HPLC(2)

对(e)中所得的流分用Capcell pak C18 UG80(5μm，Φ4.6×150mm，资生堂生产)进行反相HPLC，在0.1％TFA(pH 2.2)中，用40分钟，以20-40％的乙腈线性浓度梯度、1.0ml/mi的流速进行洗脱。分成各自1ml的流分，确认了用浓度约23％的乙腈洗脱的流分(在下文中称为流分A)以及用浓度约25％的乙腈洗脱的流分(在下文中称为流分B)具有活性。实施例2：从活性流分精制肽类(其1：从活性流分A精制)

将实施例1的分离操作(f)中获得的活性流分A用Capcell pak C18UG80(5μm，Φ4.6×150mm，资生堂生产)进行反相HPLC，在0.1％TFA(pH 2.2)中，以0.5ml/min的流速，用浓度为22％的乙腈展开。获得在保留时间14.5分钟显示出单峰的化合物。将该化合物称为化合物(1)。

图1显示了该反相HPLC的展开图。实施例3：从活性流分精制肽类(其2：从活性流分B精制)

将实施例1的分离操作(f)中获得的活性流分B用Capcell pak C18UG80(5μm，Φ4.6×150mm，资生堂生产)进行反相HPLC，在0.1％TFA(pH 2.2)中；以0.5ml/min的流速，用浓度为24％的乙腈展开。获得在保留时间13分钟显示出单峰的化合物。将该化合物称为化合物(2)。

图2显示了该反相HPLC的展开图。

实施例4：肽类的鉴定

用Shimadzu PSQ-1型气相测序仪(岛津制作所制造)分析上述实施例2和实施例3中精制的化合物(1)和化合物(2)的结构。所得各氨基酸序列示于下表1中。

       表1：肽的氨基酸序列(单位：pmol)

  编号    化合物(1)    化合物(2)    1    Lys    103    Lys    114    2    Pro    121    Pro    137    3    Pro    104    Pro    124    4    Ser    22    Ser    30    5    Ser    18    Ser    26    6    Ser    14    Ser    14    7    Glu    64    Glu    48    8    Phe    27    Phe    22    9    Val    15    Ile    11    10    Gly    10    Gly    11    11    Leu    6    Leu    3    12    Met    2    Met    2

化合物(1)和化合物(2)的分子量用MALDI TOF-MS(Voyager Elite，PE Bio Systerms Japan Co.制造)测定。其测定值示于下表2中。

                 表2：肽的MS数据

化合物    分子式             计算值(M+2H)²⁺  实测值  (1)    C₅₇H₉₂N₁₄O₁₇S    639.31   639.37  (2)    C₅₈H₉₄N₁₄O₁₇S    646.32   646.40

根据以上的仪器分析数据，确定了从活性流分A分离、精制的作为真蛸神经肽类的化合物(1)可以用以下氨基酸序列(1)表示。

H-Lys-Pro-Pro-Ser-Ser-Ser-Glu-Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH₂    (1)

还确定了从活性流分B分离、精制的作为真蛸神经肽类的化合物(2)可以用以下氨基酸序列(2)表示。

H-Lys-Pro-Pro-Ser-Ser-Ser-Glu-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH₂    (2)实施例5：通过固相法合成肽类

肽类的合成用PE Bio Systems Japan Co.制造的433A型全自动肽合成仪按照FastMoc(注册商标)法合成。

此外，在化合物(1)的合成中，用Fmoc-NH-SAL-A树脂(渡边化学工业公司生产)作为载体，使用Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Pro、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Val、Fmoc-Gly、Fmoc-Leu和Fmoc-Met。

另外，在化合物(2)的合成中，用Fmoc-NH-SAL-A树脂(渡边化学工业公司生产)作为载体，使用Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Pro、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Ile、Fmoc-Gly、Fmoc-Leu和Fmoc-Met。(其中，Fmoc表示9-芴基甲氧羰基，Boc表示叔丁氧羰基，tBu表示叔丁基。)

为了从反应完成后的肽树脂切下粗制肽并且将其去保护，使用4.3％苯酚/2.1％1，2-乙二硫醇/4.3％苯硫基甲烷/4.3％水/85％TFA。将反应混合物过滤，向滤液中加入醚使肽沉淀，用醚将沉淀洗涤3次，获得约100mg粗制肽。将其中约10mg粗制肽通过反相HPLC精制，获得约6mg的精制肽。

在使用Capcell pak C18的反相HPLC中，所述精制肽的保留时间分别与得自真蛸的化合物(1)和(2)的保留时间完全一致。此外，在鲤鱼直肠收缩活性方面，合成物与各自的天然物质的活性相同。实施例6：鲤鱼直肠收缩活性的测定

鲤鱼直肠收缩活性的测定如下进行。亦即取出鲤鱼肠，将其两端用棉线固定，一端固定在添加样品用的室(容量为2ml)中，另一端连接于传感器上，作为检查的标本。将待检测的样品用生理盐水溶解，加入到样品室中，记录收缩所引起的张力的变化。

其结果示于图3和图4中。

根据图中的结果可以看出，化合物(1)(图3)和化合物(2)(图4)使鲤鱼肠道强力收缩。实施例7：豚鼠回肠收缩活性的测定

豚鼠回肠收缩活性的测定按照Champagne等(Champagne，D.E.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91，138-142，1994)的方法进行。

取出豚鼠回肠，将其两端用棉线固定，一端固定在添加样品用的室(容量为5ml)中，另一端连接于传感器上，作为检查的标本。另外，在样品室中一直用37℃的生理盐水保持恒定，将待检测的样品用生理盐水溶解，加入到样品室中，记录收缩所引起的张力的变化。

其结果示于图5和图6中。

根据图中的结果可以看出，化合物(1)(图5)和化合物(2)(图6)分别在1×10^-8M浓度下使豚鼠回肠强力收缩。实施例8：前体多肽的全氨基酸结构及其编码基因的核苷酸序列的测定

(1)真蛸后部唾液腺总RNA的制备

将约1g的真蛸后部唾液腺在液氮中粉碎，将其溶于10ml TRIzol(注册商标)试剂(GIBCO BRL Co.制造)中，然后匀浆。在室温下静置5分钟后，将其分为每份1ml，在每份混合物中加入200μl氯仿并搅拌后，用冷却离心机(佐久间制作所公司制造)离心分离(15,000rpm，15分钟，4℃)。取上层水层，向每份中加入0.5ml异丙醇，于室温下静置10分钟。用冷却离心机离心分离(15,000rpm，10分钟，4℃)后，除去上清液，加入1ml 75％乙醇后再次离心分离(10,000rpm，5分钟，4℃)。除去上清液，将残余物风干约10分钟，加入10μl DEPC处理水，于60℃保温10分钟，溶解RNA。用上述方法获得约3mg总RNA。

(2)简并3’-RACE

根据从真蛸后部唾液腺分离的肽的序列，设计以下简并引物，并且按照常规方法合成。Oct-TK-M-1：5’-AA(A/G)CCICCII(C/G)II(C/G)II(C/G)IGA(A/G)TT(C/T)AT-3’Oct-TK-M  ：5’-GA(A/G)TT(C/T)AT(A/T/C)GGI(C/T)TIATGGG-3’(各式中英文字母基于“Nucleotide Abbreviation List”(细胞工学别册，“Biotechnology Experiment Illustrated”：秀润社)；以下各式中与此相同。)

接着，用5’/3’-RACE试剂盒(Boehringer Mannheim Co.制造)，按照以下程序进行简并3’-RACE。亦即加入2μg总RNA、4μl cDNA合成缓冲液、2μl dNTP混合物、1μl寡聚dT-锚定引物(12.5pmol/μl)、1μlAMV反转录酶(20单位/μl)、DEPC处理水，使总体积为20μl，于55℃保温60分钟后，于65℃处理10分钟，合成第一链cDNA。

接着，在以下条件下进行第一轮3’-RACE。亦即将5μl第一链cDNA、5μl 10×PCR缓冲液、8μl dNTP混合物、3μl Oct-TK-M-1(100pmol/μl)、1μl PCR锚定引物(12.5pmol/μl)、0.5μl TaKaRa Ex Taq(注册商标)(宝酒造社生产)、水混合，使总体积为50μl，在94℃反应5分钟后，以94℃ 30秒、45℃ 30秒、72℃ 2分钟进行30个循环，然后于72℃反应7分钟。在聚合酶链式反应(PCR)反应中，使用GeneAmpPCR System 2400热循环仪(Perkin Elmer Co.制造)。

随后，将第一轮PCR产物用离心柱(spin column)(MicroSpin(注册商标)S-400，Amersham Pharmacia Co.制造)精制，在以下条件下进行第二轮3’-RACE。亦即将3μl第一轮PCR产物、5μl 10×PCR缓冲液、8μl dNTP混合物、3μl Oct-TK-M(100pmol/μl)、1μl PCR锚定引物(12.5pmol/μl)、0.5μl TaKaRa Ex Taq(注册商标)(宝酒造社生产)、水混合，使总体积为50μl，在94℃反应5分钟后，以94℃ 30秒、45℃ 30秒、72℃ 2分钟进行30个循环，然后于72℃反应7分钟。

将5μl反应液在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，结果发现扩增了约300bp的PCR产物。

(3)PCR产物的连接反应

将PCR产物经离心柱精制，将其中3μl PCR产物与2μl TA克隆载体pCR2.1(Invitrogen Co.制造)、5μl Ligation high(东洋纺社生产)混合，于16℃进行1小时的连接反应。

(4)大肠杆菌的转化

将上述(3)中所得的10μl连接反应溶液混合到感受态细胞Competent high大肠杆菌DH5α(东洋纺社制造)中，在冰中静置30分钟后，于42℃进行热激50秒。在冰中冷却2分钟后，加入1ml SOC培养基，于37℃孵育30分钟。随后，在LB/Amp.(含有50μg/ml氨苄青霉素的LB)琼脂培养基上涂布35μl X-gal后，涂布10μl转化子。将残留的转化子以10,000rpm离心沉淀1分钟，将体积减至100μl左右，全部涂布到LB/Amp.琼脂培养基上。将培养基于37℃培养过夜。

(5)菌落PCR

将所得的菌落作为模板，在以下条件下进行菌落PCR。亦即将大肠杆菌细胞、5μl 10×反应缓冲液、5μl 2mM dNTP、3μl 25mM MgCl₂、0.5μl M13FW引物(100pmol/μl)、0.5μl M13RV引物(100pmol/μl)、0.5μlrTaq DNA聚合酶(东洋纺社制造)和水混合，使总体积为50μl，于90℃反应10分钟后，以94℃30秒、55℃30秒、72℃1分钟进行30个循环，然后于72℃再反应5分钟。将5μl反应液在1.5％琼脂糖凝胶上电泳。

此外，在该反应中使用的M13FW引物和M13RV引物按照常规方法合成。其序列示于下面。

M13FW：5’-GTAAAACGACGGCCAGTG-3’

M13RV：5’-GGAAACAGCTATGACCATG-3’

(6)DNA序列

通过离心柱精制目的大小(约500bp)的菌落PCR产物，用DNA测序试剂盒(PE Biosystems Co.制造)进行测序。测序使用ABIPRISM 310Genetic分析仪(PE Biosystems Co.制造)。

用基因分析软件GENETYX-MAC(Software Development Co.制造)分析所得的序列，结果确定了约500bp的部分cDNA的序列。

(7)5’-RACE

根据部分cDNA的核苷酸序列，合成以下引物。TK-M-5’-1R：5’-TTCAGGTTTCAGTTCATTGGG-3’TK-M-5’-2R：5’-TTTCGGTGGACCTCTCTTAC-3’TK-M-5’-3R：5’-TTCAGACATAGAACCAGGATG-3’

接着，用5’/3’-RACE试剂盒(Boehringer Mannheim Co.制造)，按照以下程序进行5’-RACE。首先，将2μg总RNA与1μl TK-M-5’-1R(12.5pmol/μl)混合，于70℃处理10分钟，然后在冰中冷却。然后，将4μl cDNA合成缓冲液、2μl dNTP混合物、1μl AMV反转录酶(20单位/μl)、DEPC处理水混合，使总体积为20μl，于55℃保温60分钟后，于65℃处理10分钟，合成第一链cDNA。接着，在用离心柱精制第一链cDNA后，加入2.5μl反应缓冲液、2.5μl 2mM dATP，于94℃处理3分钟，然后加入1μl末端转移酶(10单位/μl)，在于37℃保温20分钟后，于70℃处理10分钟，合成以dA加尾的cDNA。

接着在下述条件下进行第一轮PCR和第二轮PCR。

①第一轮PCR：

将5μl dA加尾的cDNA、5μl 10×PCR缓冲液、8μl dNTP混合物、1μl TK-M-5’-2R(12.5pmol/μl)、1μl寡聚dT-锚定引物(12.5pmol/μl)、0.5μl TaKaRa Ex Taq(注册商标)(宝酒造社生产)和水混合，使总体积为50μl，在94℃反应5分钟后，以94℃30秒、55℃30秒、72℃2分钟进行30个循环，然后于72℃反应7分钟。

②第二轮PCR：

将3μl经离心柱精制的第一轮PCR产物、5μl 10×PCR缓冲液、8μl dNTP混合物、1μl TK-M-5’-3R(12.5pmol/μl)、1μl PCR锚定引物(12.5pmol/μl)、0.5μl TaKaRa Ex Taq(注册商标)(宝酒造社生产)和水混合，使总体积为50μl，以与第一轮PCR相同的循环进行第二轮PCR。

用以上方法获得的第二轮PCR产物通过1.5％琼脂糖凝胶电泳，确证了约300bp的条带。

将所述第二轮PCR产物按照上述方法(3)、(4)、(5)和(6)中所述的方法进行测序。

结果，可以确定速激肽前体肽的编码基因(cDNA)的大小(约460bp)以及其推定的氨基酸数(87个氨基酸残基)和序列。其氨基酸序列示于序列标识号3中，而cDNA的序列示于序列标识号4中。

另外，在前体多肽中，对应于本发明速激肽的氨基酸序列所存在的部分示于图7中。图中用下划线表示的氨基酸序列的部分是存在对应于本发明肽的氨基酸序列的部分。实施例9：制剂实施例片剂组成：化合物(1)或(2)                               10g

  乳糖                                         125g

  微晶纤维素                                   25g

  玉米淀粉                                     25g

  5％羟丙基甲基纤维素                          100ml

  硬脂酸镁                                     5g

将上述成分按照常规方法捏合、制粒，干燥后压片，获得每片中含有10mg化合物(1)或化合物(2)作为有效成分的190mg片剂。

工业应用性

本发明提供的真蛸神经肽在低浓度下使鲤鱼直肠迅速收缩，而且是具有引起随后持续收缩作用的神经肽，这样的结果与P物质的平滑肌收缩所特有的双相收缩类似。

另外，本发明的真蛸神经肽的C末端一侧具有引起哺乳动物平滑肌收缩和血管扩张以及降压作用的速激肽所特有的结构：

-Phe-Yaa-Gly-Leu-Met-NH₂(式中，Yaa的定义同前)。因此，本发明的真蛸神经肽被分类为速激肽。

因此，本发明的真蛸神经肽可以用作生化试剂以阐明神经传递系统，而且，通过对分子水平的结构活性相关性的研究，可以获得开发医药和农药的新途径。

并且，按照本发明获得的速激肽的前体多肽及其编码基因，成为制备本发明速激肽的重要的工具。

                       序列表<110>三得利株式会社(SUNTORY LIMITED)<120>新的速激肽、这些前体多肽及其编码基因<130>SN-36<150>JP11-216922<151>1999-07-30<150>JP2000-86236<151>2000-03-27<160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>12<212>PRT<213>真蛸(OCTOPUS VULGARIS)<220><221>肽<222>(1)..(12)<223>在C末端酰胺化<400>1Lys Pro Pro Ser Ser Ser Glu Phe Val Gly Leu Met   1              5                  10<210>2<211>12<212>PRT<213>真蛸(OCTOPUS VULGARIS)<220><221>肽<222>(1)..(12)<223>在C末端酰胺化<400>2Lys Pro Pro Ser Ser Ser Glu Phe Ile Gly Leu Met   1              5                  10<210>3<211>87<212>PRT<213>真蛸(OCTOPUS VULGARIS)<220><221>肽<222>(1)..(87)<400>3Met Ile Arg Val Gly Leu Ile Leu Cys Cys Ile Phe Ile Ala Gly Val  1               5                  10                  15Phe Glu Ala Ser Ser Ala Asp Asp Met Leu Thr Ala His Asn Leu Ile

         20                  25                  30Lys Arg Ser Glu Val Lys Pro Pro Ser Ser Ser Glu Phe Ile Gly Leu

     35                  40                  45Met Gly Arg Ser Glu Glu Leu Thr Arg Arg Leu Ile Gln His Pro Gly

 50                  55                  60Ser Met Ser Glu Thr Ser Lys Arg Gly Pro Pro Lys Lys Val Ser Arg 65                  70                  75                  80Arg Pro Tyr Ile Leu Lys Lys

             85<210>4<211>460<212>DNA<213>真蛸(OCTOPUS VULGARIS)<220><221>CDS<222>(94)..(354)<400>4acagatctca caaaatttga gaagaaaatt ctataaaacc tgagaaatcc ctaatattcc 60atacagattc ttattgtgat ttctatattc aac atg att aga gta ggt ttg atc  114

                                 Met Ile Arg Val Gly Leu Ile

                                   1               5ctg tgt tgt atc ttc att gct gga gtg ttt gaa gcc agt tct gct gat   162Leu Cys Cys Ile Phe Ile Ala Gly Val Phe Glu Ala Ser Ser Ala Asp

     10                  15                  20gac atg ctt aca gca cat aat ttg att aaa aga tct gaa gtt aaa cct   210Asp Met Leu Thr Ala His Asn Leu Ile Lys Arg Ser Glu Val Lys Pro

 25                  30                  35cct tca tcc tca gaa ttc ata ggc tta atg gga cgt tct gaa gag ttg   258Pro Ser Ser Ser Glu Phe Ile Gly Leu Met Gly Arg Ser Glu Glu Leu 40                  45                  50                  55aca cga cga tta att caa cat cct ggt tct atg tct gaa aca agt aag   306Thr Arg Arg Leu Ile Gln His Pro Gly Ser Met Ser Glu Thr Ser Lys

             60                  65                  70aga ggt cca ccg aaa aaa gtt tct cgt cgt cca tat att ctt aag aaa   354Arg Gly Pro Pro Lys Lys Val Ser Arg Arg Pro Tyr Ile Leu Lys Lys

         75                  80                  85tgaatgttac caaaatattt caggcgattt taatcccaat gaactgaaac ctgaatctaa 414catttgttaa aataaaatat gaaagcacaa aaaaaaaaaa aaaaaa                460