新型自组装肽水凝胶对成骨前体细胞粘附、增殖和成骨作用的研究

摘要

临床上治疗骨肿瘤切除、创伤或感染引起的骨缺损，以及进行关节或脊柱植骨融合等手术时常常需要大量骨填充材料对缺损和融合区域进行骨移植。目前，自体骨移植仍然是临床治疗此类疾病时的首选方法，但是由于骨量来源有限、取材区疼痛以及增加感染风险等因素，限制了其在临床上的运用。为了填补自体骨移植材料的不足，合成骨填充材料，如陶瓷材料、羟基磷灰石等也已经运用于临床，但其存在细胞黏附率低和生物相容性差等缺点。随着近年来骨组织工程学对支架材料研究的迅速发展，科学家们通过对合成材料进行表面修饰或者替换，为上述问题带来新的解决办法。
　　RADA16-Ⅰ是自组装肽（self-assembling peptide，SAP）的代表，其由16个氨基酸残基组成，其在生理盐溶液触发下，16肽氨基酸形成β-折叠结构，并相互间往复排列形成互补离子键，最终自组装形成纳米纤维(直径10～20nm)。研究表明，此种自组装多肽水凝胶能够形成含水量大于99％，孔径5～200nm的纤维网状结构，通过模拟与体内相近似细胞外基质(extracellular matrix，ECM)和微环境，为细胞在体外支架材料表面的粘附、增殖和分化创造有利条件。近年来，科学家们通过向传统RADA16-Ⅰ的C末端连接活性功能序列的方法，构建出具有更优异生物学性能的新型的自组装肽水凝胶支架材料。
　　Osteostatin(Thr-Arg-Ser-Ala-Trp)是甲状旁腺类激素相关蛋白(PTHrP)在C末端的结构域。研究表明， PTHrP(107～111)五肽片段能通过介导PTH/PTHrP受体非相关性受体，在体外能够促进成骨前体细胞(preosteoblast)分化和生长，并能促进兔骨缺损的修复。本研究通过利用PTHrP(107～111)片段对传统RADA16-Ⅰ的C末端进行功能化修饰，期望得到一种兼顾细胞粘附和促进成骨相关生物学性能的自组装肽水凝胶支架材料。
　　目的:(1)观察新型自组装肽水凝胶纳米结构，检测其自组装性能;
　　(2)评估MC3T3-E1细胞在新型自组装肽水凝胶上的细胞粘附性能;
　　(3)检测MC3T3-E1细胞在新型自组装肽水凝胶上的细胞增殖效果和生长情况;
　　(4)评价新型自组装肽水凝胶促进MC3T3-E1细胞成骨分化的效果。
　　方法:(1)将自组装多肽溶液稀释液滴加到洁净云母表面，通过原子力显微镜(atomicforce microscopy，AFM)观察自组装肽在云母表面形成的纳米结构;
　　(2)按照分组运用在14mm玻片上滴加不同材料成胶，制作爬片，而后爬片放入24孔板内，并接种细胞悬液，观察不同时间点各分组材料表面粘附细胞数，检测细胞粘附性能。
　　(3)以CCK-8法评价不同时间点、不同材料表面生长的MC3T3-E1细胞的增殖情况。
　　(4)通过激光共聚焦显微镜观察MC3T3-E1细胞在各时间点各材料表面的生长情况，以及在不同HA/β-TCP复合材料上培养14d时的生长情况;
　　(5)茜素红-S染色观察MC3T3-E1细胞在不同材料表面生长14d时的钙结节形成情况;
　　(6)检测不同时间点、不同材料上培养的MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)活性以及MC3T3-E1细胞在材料表面生长14d时ALP、骨钙蛋白（osteocalcin，OCN）、血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)基因的表达。
　　结果:(1)在原子力显微镜下分别对TRSAW、RADA16-Ⅰ、RADA16/TRSAWRADA16-Ⅰ和TRASWmx四组短肽进行观察，TRSAW组呈云絮状改变，无法形成纳米纤维立体网状结构。RADA16/TRSAW组能够形成不规则的斑片样纤维，直径不规则，纤维之间无法连接搭载;但是，将RADA16/TRSAW与RADA16-Ⅰ稀释液按1:1体积比例混合后得到的TRSAWmx能够得到近似于RADA16-Ⅰ的长纳米纤维，且能形成网状结构，两者有自组装性能;通过原子力显微镜检测结果，后续实验采用空白组、RADA16-Ⅰ组和TRSAWmx组进行分组实验。
　　(2)对各个时相点在三种材料表面的粘附MC3T3-E1细胞计数并进行统计学分析，第10min时，空白组与RADA16-Ⅰ组有统计学差异(P＜0.05);在第30、60min和90min时，空白组分别与TRSAWmx组与RADA16-Ⅰ组有统计学差异(P＜0.05)，RADA16-Ⅰ与TRSAWmx间无统计学差异(P＞0.05)。
　　(3) CCK-8检测细胞各个时相点MC3T3-E1细胞在不同材料表面的增殖情况，培养1天时空白组与TRSAWmx和RADA16-Ⅰ组有显著差异（P＜0.05），TRSAWmx和RADA16-Ⅰ组统计学无显著差异（P＞0.05）;第3、5和7天空白组、TRASWmx组和RADA16-Ⅰ组间有统计学差异（P＜0.05）。
　　(4)在激光共聚焦显微镜下对分别接种于不同材料的平面上的MC3T3-E1细胞生长情况进行观察，可见接种培养的3d、7d和14d后，各分组细胞骨架排列连续，纤维结构沿着细胞长轴延伸;不同时间节点TRSAWmx组细胞数目均较空白及RADA16-Ⅰ组增加(P＜0.05)。在HA/β-TCP多孔支架材料上培养14天后，TRSAWmx组的细胞密度明显高于其他组别。
　　(5)检测不同时相点MC3T3-E1细胞在不同材料表面的ALP活性，结果显示在3d、7d和14d时，TRASWmx组和空白组、RADA16-Ⅰ组间有统计学差异(P＜0.05)。
　　(6)茜素红-S染色结果显示，通过14d诱导培养后空白组细胞密度较其他两组小，中间少量钙结节形成;RADA16-Ⅰ组中细胞密度较大，能够见到多个钙结节形成;而TRSAWmx组中可见较多橘红色的钙结节着色。
　　(7) ReaI-time PCR结果显示，在TRSAWmx组中培养的细胞，ALP、OCN和VEGF基因的相对表达量高于空白组和RADA16-Ⅰ组(P＜0.05)。
　　结论:通过肽固相合成法将甲状旁腺类激素相关蛋白（PTHrP）的高活性片段PTHrP(107～111)与传统RADA16-Ⅰ的C末端相连，并通过与传统自组装肽RADA16-Ⅰ混合得到的新型自组装水凝胶多肽，经试验证明TRSAWmx自组装肽水凝胶具有良好的细胞粘附性、促MC3T3-E1细胞增殖和成骨诱导相关性能，作为一种新型支架材料能够为细胞的体外培养提供适合的环境，为后期与羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）、脱钙骨基质（demineralized bone matrix，DBM）等材料相复合，进一步探索复合材料在体内的相关生物学性能，以及未来运用于临床治疗提供了良好实验依据和理论基础。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 新型自组装多肽水凝胶对成骨前体细胞粘附、增殖和成骨分化作用

第一节 功能自组装肽水凝胶的制备

第二节 新型自组装多肽水凝胶对成骨前体细胞粘附、增殖和成骨分化作用

第三章 新型自组装多肽水凝胶复合HA／β-TCP材料成骨前体细胞的增殖效果

1．0 引言

2．0 实验材料

3．0 实验方法

4．0 实验结果

5．0 讨论

全文总结

参考文献

文献综述 功能化自组装多肽的设计及在骨组织工程领域的应用研究进展

攻读硕士学位期间的研究成果

致谢