含有包裹了极难溶于水的活性组分的冻干脂质体的药物制剂及其制备方法

摘要

含有海藻糖和其中掺入了生物活性组分的脂类脂质体的冻干组合物,其特征在于所述生物活性组分极难溶于水、海藻糖/脂类的重量比为≤1.5,且全部海藻糖均添加在冻干前已经形成的脂质体的外侧。

说明书

本发明涉及含有包裹了极难溶于水的生物活性组分的冻干脂质体的药物制剂，及所述制剂的制备方法。

更具体地说，本发明涉及含有包裹了极难溶于水并且在一段时间内保持稳定的生物活性组分的冻干脂质体的药物制剂。

在本说明书和权利要求书中，将术语“极难溶于水”用于描述在水中溶解度≤0.01％(w/v)的所有化合物。

人们知道，脂质体在医疗中用于获得冻干及储存期间内充分稳定的药物制剂的应用受到一些困难的阻挠。总体说来，所述困难在于如何制备既不发生崩解也不发生相互黏结的脂质体。换句话说，脂质体应保持完整并彼此分离。

在活性组分极难溶于水的情况下，脂质体的结构完整性也特别重要。实际上，在患者服用前通过添加生理溶液使水性脂质体溶液再溶解时，冻干和/或储存期间脂质体发生崩解不会阻止水溶性活性组分进入溶液。另一方面，若含有极难溶于水的活性组分的脂质体发生崩解，则冻干物再溶解后得到的溶液含有的活性组分将比需要的低。发生崩解的脂质体量越多，溶液中活性组分的理论量和实际量之间的差异就越大。

US-A-4857319描述了含有水溶性生物活性组分的脂质体的一种冻干方法。该文献描述了优选平均大小约为50-100nm的脂质体与作为防腐剂仅添加在内侧(与包裹的脂质体内含物一起)、或仅添加在外侧或添加在内外两侧的二糖的冻干过程。二糖/脂类的重量比为0.1∶1-4∶1。优选二糖是海藻糖。冷冻步骤在液氮的温度下(-195.8℃)进行。

在上面提到的专利中，通过再水化使冻干物再溶解后测定脂质体中包裹的活性组分的保留量来评估冻干过程中的稳定性特征。

上述专利的表2显示，仅当海藻糖/脂类比值大于1.76且海藻糖存在于脂质体的内侧和外侧上时，活性组分的保留量才比较高(99-100％)。当所述比值等于0.11和0.19时，即使海藻糖存在于脂质体的内外两侧上，活性组分的保留量也仅分别等于22％和49％。相比之下，当海藻糖仅存在于外侧上时，活性组分的保留量急剧下降，甚至使用大量的海藻糖也是如此。实际上，海藻糖/脂类比值为3.9时，保留量仅为26％。

然而，当生物活性组分极难溶于水时，上述结果并不能再现。实际上，当在制备脂质体过程中添加海藻糖以便将其包裹在脂类小囊泡中时，获得的是不均一的不可挤压的悬浮液(对比1和2的制剂)。

令人意外的是，已经发现：当仅在冻干前将小量海藻糖添加到脂质体中时，且所述的冻干过程是在-5℃--70℃温度下的冷冻步骤进行的，则含有极难溶于水的生物活性组分的脂质体在冻干过程中基本上完整地保留下来。

本发明的一个目的是提供了含有海藻糖和其中掺入了生物活性组分的脂类脂质体的冻干组合物，其特征在于所述生物活性组分极难溶于水、海藻糖/脂类的重量比为≤1.5，且全部海藻糖均添加到冻干前已经形成的脂质体的外侧。

经再水化再溶解后，所述组合物在溶液中保留了大于95％的极难溶于水的生物活性组分(实施例1、2和3)。

极难溶于水的生物活性组分的典型实例是：氯尼达明、褪黑激素、环孢菌素A和bindarit。

经过本发明冻干过程的脂质体组合物中的脂类优选选自磷酸甘油酯类、甘油酯类、甘油二酯类、甘油三酯类、磷脂类、半乳糖和葡糖脂类、胆固醇及其衍生物、鞘脂类以及它们的混合物。优选脂类是磷脂类。并且，海藻糖/脂类的重量比优选在1∶2-1∶1的范围。

脂质体的平均大小可以是50-250nm。优选50-100nm。

本发明的第二个目的是提供一种冻干方法，其特征在于：

1)对于含水脂质体组合物中的每重量份脂类来说加入0.2-1.5重量份的海藻糖，其中脂质体的平均大小为50-250nm，且所述的脂质体含有极难溶于水的一种生物活性组分；

2)以0.5℃-2℃/分钟的冷冻速度通过冻干机的冷冻平板将所述组合物冷却至-5℃--70℃；

3)一旦达到预定的冷冻温度，将所述组合物在所述温度下保持2-5小时；

4)使用5×10^-1-8×10^-2毫巴的真空，使冷冻平板的温度保持在步骤2)中确定的冷冻温度下2-5小时；

5)使冷冻平板的温度达到-15℃，并维持在此温度下直至水完全被除去为止。

优选的操作条件如下：

步骤2

冷冻温度：-20℃--30℃

冷冻速度：0.77℃/分钟

步骤3

时间：3小时

步骤4

真空：6×10^-2毫巴

步骤5

a)当冷冻温度(步骤2)低于-15℃时，将冷冻平板的温度以0.5℃-2℃的速度提高至-15℃，冻干过程进行20小时；然后使冷冻平板的温度达到-10℃，1小时后达到+5℃，冻干过程进行16小时。

b)当冷冻温度(步骤2)高于或等于-15℃时，冻干过程持续20小时，此后使冷冻平板的温度达到+5℃，冻干过程进行16小时。

本发明特别优选的脂质体组合物含有：成分                         ％(w/w)磷脂酰胆碱                      ：94溶血磷脂酰胆碱                  ：3N-酰基乙醇胺                    ：1磷脂酰乙醇胺                    ：0.1甘油三酯                        ：1游离脂肪酸                      ：0.75DL-α-维生素E                   ：0.15

一般来说，本发明的含水脂质体药物组合物可通过下列步骤来制备：

a)在20-30℃的温度下，将极难溶于水的生物活性组分分散于脂类中；

b)将所述分散体悬浮于水相中；

c)使所述悬浮液在环境温度下维持0-48小时；

d)将其加热至30-75℃、持续10-40分钟；

e)将其冷冻至-150℃--200℃；

f)将步骤d)和e)至少重复两次并不得超过8次；

g)使其通过孔径为500-1000nm的滤膜过滤；

h)使其挤压通过孔径为50-400nm的膜，且同时

i)除去未被封闭的活性组分。

步骤c)的持续时间取决于希望封闭于脂质体中的极难溶于水的活性组分的量。因此，本领域普通技术人员通过几个简单的常规实验即可很容易地确定对于每类活性组分和脂质体组合物的合适时间。

优选水相由0.05％-0.9％(w/v)氯化钠水溶液组成。一般来说，对于每重量份水溶液，使用0.01-0.4重量份的脂类。一般地，对于每重量份脂类，使用0.01-0.3重量份的活性组分。

一般来说，使用压缩空气或选自氮气、氦气和氩气这样的惰性气体作为挤压气体进行挤压。优选的惰性气体是氦气。挤压步骤中的压力优选在500-5500kPa，温度优选在20℃-75℃，甚至更优选在40℃-65℃。合适挤压机的典型实例是Lipex BiomembranesThermobarrel型挤压机或具有孔径为50-600nm的Costar^TM聚碳酸酯膜的Emulsiflex CC Avestin。

如上所述继续进行程序，获得的含水脂质体组合物中含有约8mg/ml的褪黑激素、3.8mg/ml的氯尼达明、1mg/ml的环孢菌素A和4mg/ml的bindarit，相对应的水溶解度为3×10^-3mg/ml(氯尼达明)、1×10^-1mg/ml(bindarit)，而事实上褪黑激素(G.S.Shida等《松果体研究杂志》(J.Pineal Res.)1994，16，198-201)和环孢菌素A[“不溶于水”-《药物分析曲线》中的环孢菌素A专集，16，163，(1987)]是绝对不溶性的。

下列实施例用来解释本发明而不用来限定本发明。制剂I

如下所述制备含有极难溶于水的生物活性组分的脂质体组合物。

在30℃下，用Ultraturrax^TM型匀浆器使100mg褪黑激素分散在1g磷脂中。此后，用所述匀浆器将所述分散体悬浮于10ml 0.9％(w/v)的氯化钠水溶液中，然后在55℃的水浴中加热20分钟。

使如此获得的悬浮液进行下列冷冻和加热循环：

-在液氮中冷冻1分钟，

-在55℃下加热直到磷脂完全流化为止。

将所述循环重复6次。

使用Lipex Biomembranes装置使该悬浮液两次通过0.6μm的滤膜。

由此获得“多薄层大囊”(Multilamellar Large Vesicle，MLV)悬浮液，在55℃下使用带有0.1μm Costar^TM聚碳酸酯滤膜的10ml Lipex Biomembranes Thermobarrel型挤压机对其进行6个连续的挤压循环，其中使用氦气作为挤压气体、压力为1000-4800kPa。制剂II

我们按照制剂I中所述程序进行，其中使用2g磷脂和50mg氯尼达明代替1g磷脂和100mg褪黑激素。制剂III

我们按照制剂I中所述程序进行，其中使用2g磷脂和200mg褪黑激素代替1g磷脂和100mg褪黑激素。制剂IV

除用0.2μm聚碳酸酯膜代替0.1μm聚碳酸酯膜进行挤压外，我们均按照制剂II中所述程序进行。制剂V

在30℃下，用Ultraturrax^TM型匀浆器使30mg环孢菌素A分散在2g磷脂中。此后，使用所述匀浆器将所述分散体悬浮于0.9％(w/v)的氯化钠水溶液中，在环境温度下使其静置24小时。此后，将所得悬浮液在65℃的水浴中加热20分钟。

对如此获得的悬浮液进行下列冷冻和加热循环：

-在液氮中冷冻1分钟，

-在65℃下加热直到磷脂完全流化为止。

将所述循环重复6次。

使用Lipex Biomembranes装置使悬浮液两次通过0.6μm的滤膜。

由此获得“多薄层大囊”(MLV)悬浮液，在65℃下使用带有0.1μm Costar^TM聚碳酸酯滤膜的10ml-Lipex BiomembranesThermobarrel型挤压机对其进行6个连续的挤压循环，其中使用氦气作为挤压气体、压力为1000-4800kPa。制剂VI

我们按照制剂I中所述程序进行，其中使用2g磷脂和50mgbindarit代替1g磷脂和100mg褪黑激素。对比1的制备制剂1A

在30℃下，用Ultraturrax^TM型匀浆器使100mg褪黑激素和1g海藻糖分散在1g磷脂中、持续10分钟。此后，使用所述匀浆器将所述分散体悬浮于10ml 0.9％(w/v)的氯化钠水溶液中，然后在55℃的水浴中加热20分钟。

对如此获得的悬浮液进行下列冷冻和加热循环：

-在液氮中冷冻1分钟，

-在55℃下加热直到磷脂完全流化为止。

将所述循环重复6次。

使用Lipex Biomembranes装置使悬浮液两次通过0.6μm的滤膜。

这样获得了非常致密的团块。在55℃下使用带有0.1-μmCostar^TM聚碳酸酯滤膜的10ml-Lipex BiomembranesThermobarrel型挤压机对其进行挤压的尝试没有成功(其中使用氦气作为挤压气体，压力为1000-4800kPa)。制剂1B

除不使用褪黑激素外，我们如上述制剂1A中所述程序进行。获得了“多薄层大囊”(MLV)悬浮液，这种悬浮液在55℃下通过使用带有0.1μm Costar^TM聚碳酸酯滤膜的10ml-Lipex BiomembranesThermobarrel型挤压机可以很好地挤压出(其中使用氦气作为挤压气体，压力为1000-4800kPa)。对比2的制备制剂2A

除用2g而不是1g磷脂外，我们按照上述就对比1A制备所述的程序进行。

在这种情况下也获得了非常致密、不可挤压的团块。制剂2B

除用2g而不是1g磷脂外，我们如上述就对比1B制备所述的程序进行。

在这种情况下也获得了能够很好地挤压出的MLV悬浮液。实施例1

将制剂II分成1ml的等分试样，按照表1/1中给出的海藻糖/脂类重量比向每一等分试样中添加海藻糖。

在板式冻干机中如下进行冻干过程：

1)以0.77℃/分钟的速度冷却至-25℃；

2)维持所述温度(-25℃)3小时；

3)使用真空(6×10^-2毫巴)并在所述温度下(-25℃)维持2小时；

4)在6×10^-2毫巴的真空中加热至-15℃、持续20小时；

5)在6×10^-2毫巴的真空中加热至-10℃、持续2小时；

6)在6×10^-2毫巴的真空中加热至+5℃、持续20小时；

7)关闭真空；

8)导入空气。

用1ml蒸馏水将冻干物(1ml)再水化，在环境温度下保持30分钟以便使脂质体有效再溶解。

用10ml生理溶液进一步稀释0.5ml的所述溶液以便用NICOMP370装置测定脂质体的平均大小。

表1/1列出了所得结果。表1/1冻干前和冻干后的脂质体平均大小

  批号海藻糖/脂类(w/w)  冻干前  冻干后  LM/302    0    102    911.7    1∶2    102    115.9    1∶1    102    109.7    2∶1    102    167.9  LM/303    0    99.2    911.7    1∶2    99.2    98.7    1∶1    99.2    109.8    2∶1    99.2    291.3  LM/304    0    98.6    911.8    1∶2    98.6    94.9    1∶1    98.6    105.8    2∶1    98.6    794

从表1/1中我们可以看出，缺乏海藻糖伴有某种程度的脂质体融合，这一点由脂质体平均大小的增加可以证明。令人意外的是，海藻糖用量的增加(海藻糖/脂类2∶1)也可导致某种程度的融合，因此脂质体平均大小增加。

用制剂IV也获得了类似的结果。

由如上所述新近制备的一定数量样品来测定脂质体的平均大小和氯尼达明的量。随后，将样品重新放入5℃的冷藏箱中，在给定的时间间隔取样并再水化以测定活性组分的量和脂质体的平均大小。由此获得的结果列在表1/2中。表1/2海藻糖/脂类比(w/w)1∶2

  批号时间(月)  HPLC量(mg/ml)平均大小(nm)  LM/328    t₀    3.3    107    1    3.2    110    3    3.2    114    6    3.1    127.2  LM/329    t₀    3.2    103.3    1    3.2    101    3    3.2    110.5    6    3.1    115  LM/330    t₀    3.3    99.2    1    3.4    99.5    3    3.2    100.5    6    3.1    113.6实施例2

如上述实施例1中所述冻干制剂III，并且如上述实施例中所述测定冻干前和冻干后脂质体的平均大小(表2/1)以及新鲜制剂及保存于5℃的制剂中脂质体的平均大小和褪黑激素的量(表2/2)。表2/1冻干前和冻干后脂质体的平均大小

    批号海藻糖/脂类(w/w)  冻干前  冻干后    LM/336    0    92    16953    1∶2    92    6875    1∶1    92    96.5    2∶1    92    109.7    LM/337    1∶2    92    146.3    1∶1    92    98.8    2∶1    92    8319.8    LM/338    1∶2    92    179.7    1∶1    92    225.7    2∶1    92    2984

用制剂1也获得了类似的结果。表2/2海藻糖/脂类比(w/w)1∶1

    批号时间(月) HPLC量(mg/ml)平均大小(nm)    LM/359    t₀    6    104    1    6    103.2    3    5.8    109.5    LM/360    t₀    6.5    107.2    1    6.5    106.3    3    6.7    113.6    LM/361    t₀    6.2    98.4    1    6.3    99    3    6    100.5实施例3

如上述实施例1中所述冻干制剂VI，并且如上述实施例中所述测定冻干前和冻干后脂质体的平均大小(表3/1)以及新鲜制剂及保存于5℃的制剂中的脂质体平均大小和bindarit的量(表3/2)。表3/1冻干前和冻干后脂质体的平均大小

    批号海藻糖/脂类(w/w)  冻干前  冻干后  LM/342    0    102.7  7524.1    1∶2    102.7    928    1∶1    102.7    109    2∶1    102.7    140    LM/343    1∶2    102.7    546.6    1∶1    102.7    112.3    2∶1    102.7   1559.2  LM/344    1∶2    102.7    194.9    1∶1    102.7    112.2    2∶1    102.7    4722表3/2海藻糖/脂类比(w/w)1∶1    批号时间(月)HPLC量(mg/ml)平均大小(nm)    LM/356    t₀    3.2    135.4    1    3.1    128    3    3.2    131.3    LM/357    t₀    3.1    122    1    3.1    121    3    3.2    126.2  LM/358    t₀    3.1    126    1    3.1    122.8    3    2.9    121.8    对比1实施例

将制剂II分成1ml的等分试样，按照对比表1中给出的海藻糖/脂类重量比向每一等分试样中添加海藻糖。

然后将该制剂在液氮的温度下(-195.8℃)冷冻并冻干20小时，不再另外控制温度。

用1ml蒸馏水使冻干物(1ml)再水化并在环境温度下保持2小时。

用10ml生理溶液进一步稀释0.5ml的所述溶液，以便用NICOMP 370装置测定脂质体的平均大小。

所得结果列于下列对比表1中。对比表1冻干前、后的脂质体平均大小

    批号海藻糖/脂类(w/w)  冻干前  冻干后  LM/302    0    102    911.8    1∶2    102    254.8    1∶1    102    219.3    2∶1    102    773.7    LM/303    0    99.2    911.8    1∶2    99.2    349.9    1∶1    99.2    180.4    2∶1    99.2    717.2    LM/304    0    98.6    911.8    1∶2    98.6    722.5    1∶1    98.6    161.1    2∶1    98.6    150

从对比表1中我们可以观察到：在液氮温度下进行冻干过程时，在没有海藻糖或有上述表给出比例的海藻糖存在的情况下，脂质体均发生了一定程度的融合，这可由脂质体平均大小的增加证明。此外，上述数据表明：当在液氮温度下进行冻干过程时，冻干过程本身(相同组合物的制剂)并不总能再现同样的结果。