杜鹃红山茶叶片愈伤组织再生体系的建立方法

摘要

杜鹃红山茶叶片愈伤组织再生体系的建立方法，属于生物技术领域。其包括以下步骤：1）杜鹃红山茶无菌苗的获得；2） 叶片的愈伤组织诱导与继代；3）愈伤组织不定芽的分化及植株再生；4）再生植株的生根及驯化移栽。本发明利用杜鹃红山茶无菌苗叶片进行愈伤组织诱导，在对愈伤组织进行状态调整的基础上，利用特定激素配比的MS培养基进行不定芽分化，最后利用“滤纸桥生根法”解决山茶难以生根的技术难题，从而实现杜鹃红山茶叶片愈伤组织诱导及植株的再生，培养周期短，繁殖系数高，为山茶分子育种奠定了基础。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及杜鹃红山茶叶片愈伤组织再生体系的建立方法。

背景技术

杜鹃红山茶（Camellia azalea），又被称作杜鹃叶山茶、张氏红山茶或简称为杜鹃茶，为我国独有的山茶属植物种。其花色艳丽，且具有常年开花、夏季盛花的奇特性状，是不可多得的园林用优良木本花卉；其为目前所发现的280多个山茶原种中少数能全年见开花的红山茶组宝贵原种，弥补了山茶属红山茶组物种夏季无花开的空白。其自然分布仅局限于广东省阳春市鹅凰嶂自然保护区，现存野生原种数量极其稀少，于2004年被《中国物种红色名录》列为极危种，被誉为“植物大熊猫”。

目前有关杜鹃红山茶的繁殖仍以人工扦插、嫁接等传统的方式进行，这些方式受限于接穗生长状态、操作技术水平以及嫁接季节等诸多因素而导致其扩繁数量有限，加之野生种质资源非常匮乏，故为了最大效率地保护与开发杜鹃红山茶，必须找到一种更为高效的途径，比如植物组织培养。目前众多研究分别以杜鹃红山茶的花药、新抽嫩梢、叶柄及叶片为外植体进行了愈伤组织的诱导，并获得了愈伤组织诱导，但均未见不定芽的分化及植株再生的报道。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种杜鹃红山茶叶片愈伤组织再生体系的建立方法的技术方案。

所述的杜鹃红山茶叶片愈伤组织再生体系的建立方法，其特征在于包括以下步骤：

1）杜鹃红山茶无菌苗的获得

a、外植体的选取与预处理

3月中旬，剪取杜鹃红山茶嫩梢茎段，去除叶片后消毒处理后，备用；

b、茎段初代培养与增殖扩繁

将消毒完毕的茎段切为带至少一个腋芽的茎段，接种于茎段培初代培养基

中培养，培养至茎段长出2～4cm的嫩芽，再将其切成单芽苗，接种于茎段继代培养基中培养，培养得到3～4cm成型的丛生芽条，丛生芽条每50±5d进行一次继代培养，获得大量杜鹃红山茶无菌苗；

所述的茎段培初代培养基为MS+25～35g/L蔗糖+6～7g/L琼脂+0.1～0.3mg/L NAA+4～6mg/L6-BA+0.04～0.06%PVP+45～55mL/L CW ；

所述的茎段继代培养基为MS+35～45g/L蔗糖+6～7g/L琼脂+0.1～0.3mg/L NAA+1～3mg/L6-BA+1～3mg/L2-ip+45～55mL/L CW；

2） 叶片的愈伤组织诱导与继代培养

选取生长状态良好的成型无菌苗，切取叶片，接种于愈伤诱导培养基中，培养35～45d后将叶片切口及叶脉出长出淡黄色、细颗粒愈伤组织转接至愈伤组织继代培养基中，每45±5d转接一次，进行继代培养；

所述的愈伤诱导培养基为MS+25～35g/L蔗糖+6～7g/L琼脂+0.4～0.6mg/L2,4-D+45～55mL/L CW；

所述的愈伤组织继代培养基为MS+25～35g/L蔗糖+6～7g/L琼脂+0.4～0.6mg/L TDZ+90～110ml/L CW；

3）愈伤组织不定芽的分化及植株再生

经过2～3次继代培养后，选取黄绿色、细颗粒愈伤组织，转接于不定芽分化培养基中，培养35±5d，得到成型芽条；

所述的不定芽分化培养基为MS+25～35g/L蔗糖+6～7g/L琼脂+0.1～0.15mg/L NAA+8～12mg/L6-BA+90～110mL/L CW+450～550 mL/L脯氨酸+90～110mL/L谷氨酰胺；

4）再生植株的生根及驯化移栽

待成型芽条长至2～3cm后，采用“滤纸桥生根法”，弱光培养50d后即可获得生根的再生植株。

所述的杜鹃红山茶叶片愈伤组织再生体系的建立方法，其特征在于所述的步骤1）中杜鹃红山茶嫩梢茎段去除叶片后用体积比75％的酒精表面消毒30秒，接着使用质量体积比为0.1％的HgCl₂浸泡8分钟，无菌水冲洗5～6次，清洗完毕后将茎段铺在含有滤纸的平皿里吹干水分。

所述的杜鹃红山茶叶片愈伤组织再生体系的建立方法，其特征在于所述的步骤1）中初代培养条件为光强100Lx条件下培养7d，后移至光强2500～3000Lx条件下培养。

所述的杜鹃红山茶叶片愈伤组织再生体系的建立方法，其特征在于所述的步骤1）中继代培养条件为光照2500～3000Lx、光照时间为12h/d、培养温度为25±2℃。

所述的杜鹃红山茶叶片愈伤组织再生体系的建立方法，其特征在于所述的步骤2）和3）中培养条件为光照2500～3000Lx、光照时间为12h/d、培养温度为25±2℃。

所述的杜鹃红山茶叶片愈伤组织再生体系的建立方法，其特征在于所述的步骤4）中滤纸桥生根法为先对成型芽条基部进行浓度500mg/LIBA溶液浸泡60min，再接种至生根诱导培养基中。

所述的杜鹃红山茶叶片愈伤组织再生体系的建立方法，其特征在于所述的步骤4）中生根诱导培养基为MV+15～25g/L蔗糖。

发明选择首先大规模繁殖获得无菌苗，再从中剪取无菌叶片作为外植体进行愈伤组织诱导工作，这样愈伤组织诱导过程中，其外植体的选取就不受采样季节与消毒方法的影响；同时无菌茎段亦可作为外植体进行其他试验工作。

本发明在愈伤组织的诱导与继代培养中对愈伤组织诱导培养基和愈伤组织继代培养基优化，通过这两种特定PGRs配比的培养基的培养，可获得黄绿色、富有水润光泽且呈细颗粒的愈伤组织，该种愈伤组织生长旺盛、具有一定的不定芽分化潜力，利于愈伤组织不定芽的分化。

本发明采用“滤纸桥生根法”，弱光培养50d后即可获得生根的再生植株，克服木本花卉植物生根诱导的难度。

本发明利用杜鹃红山茶无菌苗叶片进行愈伤组织诱导，在对愈伤组织进行状态调整的基础上，利用特定激素配比的MS培养基进行不定芽分化，最后利用“滤纸桥生根法”解决山茶难以生根的技术难题，从而实现杜鹃红山茶叶片愈伤组织诱导及植株的再生，培养周期短，繁殖系数高，为山茶分子育种奠定了基础。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

实施例1：

1 杜鹃红山茶无菌苗的获得

（1）外植体的选取与预处理

3月中旬，剪取杜鹃红山茶嫩梢茎段，去除叶片后用体积比75％的酒精表面消毒30秒，接着使用质量体积比为0.1％的HgCl₂浸泡8分钟，无菌水冲洗5～6次，清洗完毕后将茎段铺在含有滤纸的平皿里吹干水分；备用；

（2）茎段初代培养与增殖扩繁

将消毒完毕的茎段切为带至少一个腋芽的茎段，接种于茎段培初代培养基MS+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂+0.2mg/L（NAA）+5.0mg/L6-BA+0.05%PVP（占MS总重量）+50mL/L （CW）（椰汁，coconut water）中，放置于光强100Lx条件下进行弱光培养7d，而后移至光强2500～3000Lx条件下，培养50d后茎段长出3cm左右的嫩芽，再将其切成单芽苗，接种于茎段继代培养基MS+40g/L蔗糖+6.5g/L琼脂+0.2mg/L（NAA）+2.0mg/L6-BA+2.0mg/L2-ip+50mL/L （CW）（椰汁，coconut water）中，光照2500～3000Lx、光照时间为12h/d、培养温度为25±2℃（以下的培养条件在未说明的情况下均都相同）条件下进行快速增殖扩繁，培养70d后获得3～4cm成型的丛生芽条，丛生芽条每50±5d进行一次继代培养，获得大量杜鹃红山茶无菌苗。

2 叶片的愈伤组织诱导与继代培养

选取生长状态良好的成型无菌苗，切取叶片，接种于愈伤诱导培养基MS+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂+0.5mg/L2,4-D+50mL/L（CW）（椰汁，coconut water）中，培养40d后将叶片切口及叶脉出长出淡黄色、细颗粒愈伤组织转接至愈伤组织继代培养基MS+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂+0.5 mg/L（TDZ）+100ml/L（CW）（椰汁，coconut water）中，每45±5d转接一次。经过多次继代培养后，淡黄色的愈伤组织逐渐变为黄绿色愈伤组织，表面富有水润光泽，呈细颗粒状。愈伤组织诱导率为94.05%。

3 愈伤组织不定芽的分化及植株再生

经过2～3次继代培养后，选取黄绿色、细颗粒愈伤组织，转接于不定芽分化培养基MS+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂+0.125mg/L（NAA）+10mg/L6-BA+100 mL/L（CW）+500 mL/L脯氨酸+100 mL/L谷氨酰胺中，培养35±5d后，细颗粒愈伤组织分化出嫩绿的芽点；随后嫩绿的芽点逐渐成型，有的不定芽基部还伴有白色绒毛的细根长出。不定芽分化率87.12%。

4 再生植株的生根及驯化移栽

待成型芽条长至3cm左右后，采用“滤纸桥生根法”，先对其基部进行高浓度(500mg/L) IBA溶液浸泡60min，再接种至MV+20 g/L蔗糖的生根培养瓶中，弱光培养50d后成功诱导出幼根，待主幼根木质化程度较高后对生根芽条进行驯化移栽，7d后可见成功移栽的小苗顶芽发芽，长出棕红色嫩叶。

本发明中MS基本培养基成分表：

本发明中MV液体培养基成分表

该实施例中茎段培初代培养基采用MS+25g/L蔗糖+6g/L琼脂+0.1mg/L（NAA）+4mg/L6-BA+0.04%PVP+45mL/L（CW），或采用MS+35g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.3mg/L（NAA）+6mg/L6-BA+0.06%PVP+55mL/L（CW）；

茎段继代培养基采用MS+35g/L蔗糖+6g/L琼脂+0.1mg/L（NAA）+1mg/L6-BA+1mg/L2-ip+45mL/L（CW），或采用MS+45g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.3mg/L（NAA）+3mg/L6-BA+3mg/L2-ip+55mL/L（CW）；

愈伤诱导培养基采用MS+25g/L蔗糖+6g/L琼脂+0.4mg/L2,4-D+45mL/L （CW），或采用MS+35g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.6mg/L2,4-D+55mL/L（CW）；

愈伤组织继代培养基采用MS+25g/L蔗糖+6g/L琼脂+0.4mg/L（TDZ）+90ml/L（CW），或采用MS+35g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.6mg/L（TDZ）+110ml/L（CW）；

不定芽分化培养基采用MS+25g/L蔗糖+6g/L琼脂+0.1mg/L（NAA）+8mg/L6-BA+90mL/L（CW）+450 mL/L脯氨酸+90mL/L谷氨酰胺，或采用MS+35g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.15mg/L（NAA）+12mg/L6-BA+110mL/L（CW）+550 mL/L脯氨酸+110mL/L谷氨酰胺，最后也能达到和实施例1相同的技术效果。