一种检测所有11种衣原体的定量PCR的引物、探针及试剂盒

摘要

本发明提供了一种检测所有11种衣原体的定量PCR的引物、探针及试剂盒。所述引物序列如SEQ ID NO.1、2、3所示，所述探针1如SEQ ID NO.4、5、6所示，将上述引物和探针与PCR反应液组成定量PCR检测试剂盒。本发明根据衣原体23S rRNA基因的保守区域设计引物(2条上游引物和1条针对所有11种衣原体的下游引物)和探针(3条探针)。巧妙地设计PCR的引物和探针，可以特异地扩增所有11种衣原体的核酸，并可依据熔解曲线T

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种基于衣原体23S rRNA基因序列，适用于所有11种衣原体的实时FRET-PCR方法检测的定量PCR的引物、探针及试剂盒。

背景技术

衣原体为革兰阴性，介于细菌和病毒之间的病原，属于严格细胞内寄生，在自然界中广泛存在。衣原体能够感染哺乳动物、禽类和人，可引起多种动物和人类的疾病，并且不同种属衣原体还可以在不同宿主之间传播，这对养殖业健康发展、动物产品进出口贸易和人类健康等公共卫生安全领域均造成巨大经济损失。其中沙眼衣原体、肺炎衣原体、流产衣原体及鹦鹉热衣原体为重要人畜共患病病原：沙眼衣原体主要引起人的泌尿生殖道感染、沙眼、结膜炎、婴儿肺炎和淋巴肉芽肿等疾病；肺炎衣原体常引起人的上呼吸道感染，通过呼吸道分泌物在人际间传播，慢性感染也与脑梗死、急性心肌梗死、原发性高血压和哮喘病有一定关系；流产衣原体是全球性引起绵羊、山羊流产和经济损失的重要病原，也可感染人引起流产；鹦鹉热衣原体感染鹦鹉科和其它种类的鸟类，主要存在于感染鸟粪便、鼻腔分泌物和羽毛，还能通过吸入污染病原体的尘埃传播给人类。对动物致病的衣原体主要包括猪衣原体和家畜衣原体：猪衣原体感染引发鼻炎、结膜炎、肺炎、肠炎、无症状感染、母猪流产等；家畜衣原体感染引起肺炎、多发性关节炎、胸膜炎、心包炎和流产。

衣原体根据16S和23S rRNA基因序列的不同分为11个种：肺炎衣原体(C.pneumoniae)、沙眼衣原体(C.trachomatis)、鹦鹉热衣原体(C.psittaci)、流产衣原体(C.abortus)、家畜衣原体(C.pecorum)、鼠衣原体(C.muridarum)、猪衣原体(C.suis)、猫衣原体(C.felis)、豚鼠衣原体(C.caviae)，及新发现的C.avium和C.gallinacea。

衣原体常用的检测方法包括分离培养、吉姆萨染色或荧光抗体染色、间接血凝试验(IHA)、补体结合试验(CF)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、环介导等温扩增法(LAMP)、多聚酶链式反应(PCR)等技术。传统方法主要依赖于分离培养，常用的有细胞培养法、鸡胚分离法和小鼠接种等，但这种方法耗时长、灵敏度有限、检测衣原体种类有限而导致漏检；ELISA方法结果准确，快速易行，适合批量样品检测，但会与其它微生物之间产生交叉反应，不能区分多种衣原体；IHA和CF的特点是方便，对设备要求低，但特异性和灵敏度较低，无法区别免疫接种和自然感染，康复动物抗体也可能存在易造成假阳性；目前报道的单一PCR方法不能同时检测多种衣原体；现存的多重PCR法可以对一种以上的序列同时进行扩增，达到检测衣原体不同种属的目的，但缺乏标准化试剂。目前检测衣原体技术发展很快，方法日渐增多，利用新型分子生物学方法是检测病原新的发展趋势。因此，亟需建立一种针对所有11种衣原体的精准而又快速高效的广谱检测、监控和鉴别技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测所有11种衣原体的定量PCR的引物、探针及试剂盒，以建立一种针对所有11种衣原体的精准而又快速高效的广谱检测、监控和鉴别技术。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

1)基因选择：

目前对衣原体基因组的研究主要集中于16S rRNA基因，23S rRNA，OmpA基因等。本系统选择所有11种衣原体的23S rRNA基因作为目的基因，对其序列进行比对分析，筛选出序列相似的区域，利用在线引物设计软件设计特异性的引物和探针各三条，两条上游引物和一条下游引物扩增区域具有一定的多态性，能鉴别不同种属的衣原体。

2)获得23S rRNA基因的序列：

从GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)获取如下代表株的23S rRNA基因序列：肺炎衣原体(C.pneumoniae)：NR076161；沙眼衣原体(C.trachomatis)：NR103960；鹦鹉热衣原体(C.psittaci)：NR102574；流产衣原体(C.abortus)：NR077001；家畜衣原体(C.pecorum)：NR103180；鼠衣原体(C.muridarum)：NR076163；猪衣原体(C.suis)：U68420；猫衣原体(C.felis)：NR076260；豚鼠衣原体(C.caviae)：NR076195；C.avium：NR121988；C.gallinacea：AWUS01000004(270483-273417bp)。用Clustal Multiple Alignment Algorithm的方法对所有序列进行比对分析，寻找衣原体23S rRNA基因的相对保守序列。据此，设计的引物和探针如下：

一种检测所有11种衣原体的定量PCR的引物、探针，所述引物和探针如下：

上游引物1：5’-GGGGTTGTAGGGTCGATAAYATGRGATC-3’(SEQ ID NO.1)

上游引物2：5’-GGGGTTGTAGGRTTGRGGAWAAAGGATC-3’(SEQ ID NO.2)

下游引物：5’-TGGAGAGTGGTCTCCCCAGATTCANACTA-3’(SEQ ID NO.3)

探针1：5’-(Cy5.5660)-YDCCTGAGTAGRNCTAGACACGTGAAAC-磷酸-3'(SEQ ID NO.4)

探针2：5’-ACGAAAAAACAAAAGACTCTATTCGAT-(6-FAM)-3’(SEQ ID NO.5)

探针3：5’-ACGAAAGGAGAKMAAGACYGACCTCAAC-(6-FAM)-3’(SEQ IDNO.6)。

3)FRET-PCR技术：

此法使用针对衣原体23S rRNA基因序列特异性的引物和探针进行PCR检测。荧光共振能量转移(FRET)技术明显优于SYBR Green Ⅰ荧光染料法。SYBRGreen Ⅰ荧光染料法不能区分特异的PCR产物和引物二聚体等非特异产物，特异性劣于本发明使用的FRET技术。

本发明还提供了一种检测所有11种衣原体的定量PCR的试剂盒，所述试剂盒包含的引物序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示，探针序列如SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.6所示。

所述试剂盒每20μl包括：DNA模板10.00μl、100μM上游引物0.20μl、100μM下游引物0.20μl、100μM探针-10.04μl、100μM探针-20.02μl、100μM探针-30.02μl、5×PCR缓冲液4.00μl、10μM dNTP 0.40μl、5U/μl Taq酶0.30μl、PCR级超纯水4.82μl。

23S rRNA基因-PCR特异性的确定

本发明的特异性从三个方面得到保证：

(1)设计的引物和探针经过NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的BLAST搜索，确认本发明设计的引物能特异地扩增11种衣原体的核酸，而不扩增其它非衣原体尤其是与其相近种属病原体的核酸。通过BLAST确认，RT-PCR探针和引物能特异地扩增和检测所有11种衣原体的核酸，但不扩增其他病原体核酸；

(2)本发明可以检测所有11种衣原体(肺炎衣原体；沙眼衣原体；鹦鹉热衣原体；流产衣原体，家畜衣原体，鼠衣原体，猪衣原体，猫衣原体，豚鼠衣原体，C.avium，C.gallinacea)。结果表明，本发明系统可以特异、高效、稳定地扩增所有11种衣原体的核酸；

(3)观察以上扩增对象在PCR过程中荧光强度(660nm)的变化。荧光在660nm波长出现或增强，显示阳性；根据扩增对象FRET-PCR熔解曲线T_m值的差异，可分为8个类别共11种衣原体(图18)。T_m值相近或重合的衣原体种属可进行PCR产物测序，将测序结果与GenBank公布的衣原体23S rRNA基因序列进行比对分析，证实这种衣原体23S rRNA基因-PCR方法的特异性较高。

23S rRNA基因-PCR灵敏度的确定

根据所有11种衣原体23S rRNA基因标准序列的分子量和绝对重量以及PicoGreen的DNA定量技术，计算靶序列所含的基因拷贝的绝对数目。随后，对其进行稀释，制备每10μl稀释液中含10，000拷贝、1，000拷贝、100拷贝、10拷贝、1拷贝的基因。此系统的灵敏度为每个系统可检测单拷贝的23S rRNA基因。

本发明的有益效果是：

本发明根据衣原体23S rRNA基因的保守区域设计引物(2条上游引物和1条针对所有11种衣原体的下游引物)和探针(3条探针)。总体的思路是：巧妙地设计PCR的引物和探针，可以特异地扩增所有11种衣原体的核酸，并可依据熔解曲线T_m值分型，适用于大量临床样品的检测。

1)本发明可以特异地检测所有11种衣原体。

目前衣原体根据16S和23S rRNA基因序列的不同分为11种：肺炎衣原体(C.pneumoniae)、沙眼衣原体(C.trachomatis)、鹦鹉热衣原体(C.psittaci)、流产衣原体(C.abortus)、家畜衣原体(C.pecorum)、鼠衣原体(C.muridarum)、猪衣原体(C.suis)、猫衣原体(C.felis)、豚鼠衣原体(C.caviae)，及新发现的C.avium和C.gallinacea。所有11种衣原体均可不同程度地感染哺乳动物、禽类和人类，因此，同时检测衣原体的所有种属很重要，这将有利于发现新的衣原体种属，并及时更新衣原体的分类，从而更好地认识该病原体。

2)本发明可以对所有11种衣原体进行分型。

依据其熔解曲线T_m值的不同，将11种衣原体分为8个类别，T_m值相近或重合的衣原体种属可进行PCR产物测序，将测序结果与GenBank公布的衣原体23SrRNA基因序列进行比对分析，确定具体种属。

3)本发明操作便捷，适用于检测大批量样品。

本发明可以快速、准确地检测所有11种衣原体，并能根据RT-PCR熔解曲线T_m值的不同进行分型，操作便捷，且具有较高的特异性和灵敏度。我们对全国24个省市共4045份禽类咽喉和泄殖腔拭子样品进行检测，结果显示本发明适用于临床大批量样品的检测。

附图说明

图1是本发明所使用PCR系统的上游引物1

上游引物1序列：5’-GGGGTTGTAGGGTCGATAAYATGRGATC-3’(28bp)。此引物序列中有2个兼并碱基Y和R，其中兼并碱基Y可以同时扩增T和C碱基，兼并碱基R可以同时扩增A和G碱基。因此，此引物序列与肺炎衣原体(C.pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(C.psittaci)、流产衣原体(C.abortus)、猫衣原体(C.felis)、豚鼠衣原体(C.caviae)，及新发现的C.avium和C.gallinacea完全吻合，与家畜衣原体(C.pecorum)有1个错配碱基。

图2是本发明所使用PCR系统的上游引物2

上游引物2的序列：5’-GGGGTTGTAGGRTTGRGGAWAAAGGATC-3’(28bp)。此引物序列中有3个兼并碱基，2个R和1个W，兼并碱基R可以同时扩增A和G碱基，兼并碱基W可以同时扩增A和T碱基。因此，此引物序列与沙眼衣原体(C.trachomatis)、鼠衣原体(C.muridarum)、猪衣原体(C.suis)完全吻合。

图3是本发明所使用PCR系统的探针1

探针1的序列：5’-(Cy5.5660)-YDCCTGAGTAGRNCTAGACACGTGAAAC-(磷酸)-3'(28bp)。此探针序列中有4个兼并碱基Y、D、R和N，兼并碱基Y可同时扩增C和T碱基，兼并碱基D可同时扩增A、G和T碱基，兼并碱基R可同时扩增A和G碱基，兼并碱基N可同时扩增A、T、G、C碱基。因此，此探针序列与C.avium和C.gallinacea衣原体有1个错配碱基，与其他9种完全吻合。

图4是本发明所使用PCR系统的探针2

探针2的序列：5’-ACGAAAAAACAAAAGACTCTATTCGAT-(6-FAM)-3’(27bp)。此探针序列与家畜衣原体(C.pecorum)完全吻合，与鹦鹉热衣原体(C.psittaci)、流产衣原体(C.abortus)、猫衣原体(C.felis)有1个错配碱基，与肺炎衣原体(C.pneumoniae)、豚鼠衣原体(C.caviae)，及新发现的C.avium和C.gallinacea有2个错配碱基。

图5是本发明所使用PCR系统的探针3

探针3的序列：5’-ACGAAAGGAGAKMAAGACYGACCTCAAC-(6-FAM)-3’(28bp)。此探针序列有3个兼并碱基，其中兼并碱基K可以同时扩增G和T碱基，兼并碱基M可以同时扩增A和C碱基，兼并碱基Y可以同时扩增T和C碱基。因此，此探针序列与沙眼衣原体(C.trachomatis)、鼠衣原体(C.muridarum)、猪衣原体(C.suis)完全吻合。

图6是本发明所使用PCR系统的下游引物

下游引物序列：5’-TGGAGAGTGGTCTCCCCAGATTCANACTA-3’(27bp)，此序列为图中获得序列对称链的核苷酸序列。此引物序列中有1个兼并碱基N，可以同时扩增A、T、G和C碱基。因此，此引物序列11种衣原体的序列完全吻合。

图7是C.avium的扩增曲线(A)和熔解曲线(B)

扩增曲线(A)表明本发明系统可以检测到反应体系中单拷贝的C.avium DNA分子，且具有可重复性；熔解曲线(B)表明本发明系统对于C.avium具有稳定的T_m值。

图8是C.gallinacea的扩增曲线(A)和熔解曲线(B)

扩增曲线(A)表明本发明系统可以检测到反应体系中单拷贝的C.gallinaceaDNA分子，且具有可重复性；熔解曲线(B)表明本发明系统对于C.gallinacea具有稳定的T_m值。

图9是肺炎衣原体(C.pneumoniae)的扩增曲线(A)和熔解曲线(B)

扩增曲线(A)表明本发明系统可以检测到反应体系中单拷贝的肺炎衣原体(C.pneumoniae)DNA分子，且具有可重复性；熔解曲线(B)表明本发明系统对于肺炎衣原体(C.pneumoniae)具有稳定的T_m值。

图10是鹦鹉热衣原体(C.psittaci)的扩增曲线(A)和熔解曲线(B)

扩增曲线(A)表明本发明系统可以检测到反应体系中单拷贝的鹦鹉热衣原体(C.psittaci)DNA分子，且具有可重复性；熔解曲线(B)表明本发明系统对于鹦鹉热衣原体(C.psittaci)具有稳定的T_m值。

图11是家畜衣原体(C.pecorum)的扩增曲线(A)和熔解曲线(B)

扩增曲线(A)表明本发明系统可以检测到反应体系中单拷贝的家畜衣原体(C.pecorum)DNA分子，且具有可重复性；熔解曲线(B)表明本发明系统对于家畜衣原体(C.pecorum)具有稳定的T_m值。

图12是流产衣原体(C.abortus)的扩增曲线(A)和熔解曲线(B)

扩增曲线(A)表明本发明系统可以检测到反应体系中单拷贝的流产衣原体(C.abortus)DNA分子，且具有可重复性；熔解曲线(B)表明本发明系统对于流产衣原体(C.abortus)具有稳定的T_m值。

图13是豚鼠衣原体(C.caviae)的扩增曲线(A)和熔解曲线(B)

扩增曲线(A)表明本发明系统可以检测到反应体系中单拷贝的豚鼠衣原体(C.caviae)DNA分子，且具有可重复性；熔解曲线(B)表明本发明系统对于豚鼠衣原体(C.caviae)具有稳定的T_m值。

图14是猫衣原体(C.felis)的扩增曲线(A)和熔解曲线(B)

扩增曲线(A)表明本发明系统可以检测到反应体系中单拷贝的猫衣原体(C.felis)DNA分子，且具有可重复性；熔解曲线(B)表明本发明系统对于猫衣原体(C.felis)具有稳定的T_m值。

图15是猪衣原体(C.suis)的扩增曲线(A)和熔解曲线(B)

扩增曲线(A)表明本发明系统可以检测到反应体系中单拷贝的猪衣原体(C.suis)DNA分子，且具有可重复性；熔解曲线(B)表明本发明系统对于猪衣原体(C.suis)具有稳定的T_m值。

图16是鼠衣原体(C.muridarum)的扩增曲线(A)和熔解曲线(B)

扩增曲线(A)表明本发明系统可以检测到反应体系中单拷贝的鼠衣原体(C.muridarum)DNA分子，且具有可重复性；熔解曲线(B)表明本发明系统对于鼠衣原体(C.muridarum)具有稳定的T_m值。

图17是沙眼衣原体(C.trachomatis)的扩增曲线(A)和熔解曲线(B)扩增曲线(A)表明本发明系统可以检测到反应体系中单拷贝的沙眼衣原体(C.trachomatis)DNA分子，且具有可重复性；熔解曲线(B)表明本发明系统对于沙眼衣原体(C.trachomatis)具有稳定的T_m值。

图18是同一检测体系所有11种衣原体的熔解曲线

熔解曲线表明本发明系统对于所有11种衣原体具有稳定的T_m值，同时依据熔解曲线T_m值的不同区分为8个类别11种衣原体。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明做一进步说明。

本发明的技术方案通过以下步骤建立：

1.衣原体23S rRNA基因-PCR检测方法所用引物和探针的核苷酸序列

上游引物1：5’-GGGGTTGTAGGGTCGATAAYATGRGATC-3’

上游引物2：5’-GGGGTTGTAGGRTTGRGGAWAAAGGATC-3’

下游引物：5’-TGGAGAGTGGTCTCCCCAGATTCANACTA-3’

探针1：5’-(Cy5.5660)-YDCCTGAGTAGRNCTAGACACGTGAAAC-磷

酸-3'

探针2：5’-ACGAAAAAACAAAAGACTCTATTCGAT-(6-FAM)-3’

探针3：5’-ACGAAAGGAGAKMAAGACYGACCTCAAC-(6-FAM)-3’

表-1：特异性引物和探针扩增11种衣原体23S rRNA错配碱基情况

2.制备PCR用的标准定量试剂

由金斯瑞(金斯瑞生物科技，中国南京)合成7种衣原体(流产衣原体、家畜衣原体、鼠衣原体、猪衣原体、猫衣原体、豚鼠衣原体、C.avium)目的DNA序列的质粒。依据合成物的分子量和绝对重量，计算合成物所含基因拷贝的绝对数目。本实验室已有4种衣原体(肺炎衣原体、沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、C.gallinacea)，提取其核酸作为模板，计算所含基因拷贝的绝对数目。然后，对合成质粒和另外4种衣原体核酸样品进行稀释，制备每10μl合成物的稀释剂含10，000拷贝、1000拷贝、100拷贝、10拷贝、1拷贝的目的基因作为标准品。本发明试剂盒中提供浓度为10⁶/10μl的标准品。

3.制备待检样品的DNA模板

本发明所用的检测模板包括禽类咽喉和泄殖腔拭子样品、衣原体分离样品等。

1)收集禽类咽喉和泄殖腔拭子样品保存于含有500μl核酸保护剂的1.5mlEP管中，取200μl样品用商业化罗氏试剂盒提纯核酸；最后洗脱用200μl ElutionBuffer洗脱液作为PCR的扩增模板；

2)临床采集的衣原体阳性样品用Hep-2细胞分离培养，获得纯培养物，取200μl培养液保存于1.5mlEP管中，用商业化罗氏试剂盒提纯核酸，最后洗脱在200μl Elution Buffer洗脱液作为PCR的扩增模板。

具体方法如下：

吸取40μl蛋白酶K加入到200μl样品中；

加入200μl Binding Buffer到上述离心管中，涡旋混匀仪混匀15s；

72℃孵育20min，600rpm；瞬离；

加入200μl异丙醇到样品中，涡旋混匀仪混匀15s；瞬离；

将上述样品转移至带有内置滤膜的离心柱上，10000rpm离心1min；弃去含有滤液的2ml收集管，换上新的收集管；

打开离心柱盖子，加入500μl Inhabitor Buffer，10000rpm离心1min；弃去含有滤液的2ml收集管，换上新的收集管；

打开离心柱盖子，加入600μl Washing Buffer，10000rpm离心1min；弃去含有滤液的2ml收集管，换上新的收集管；

打开离心柱盖子，加入400μl Washing Buffer，12500rpm离心2min；弃去含有滤液的2ml收集管，换上新的收集管；

小心打开盖子，加入100μl洗脱液，置于恒温混匀仪上，72℃，600rpm孵育5min。10000rpm离心1min。再重复一次该步骤；

将洗脱下来的滤液吸取到新的1.5mlEP管中，-20℃或-80℃保存。

4.PCR扩增体系

所使用的反应体系为20μl时，各组成成分的用量分别是：DNA模板10.00μl、100μM上游引物0.20μl、100μM下游引物0.20μl、100μM探针-10.04μl、100μM探针-20.02μl、100μM探针-30.02μl、5×PCR缓冲液4.00μl、10μM dNTP0.40μl、5U/μl Taq酶0.30μl、PCR级超纯水4.82μl。

5.PCR扩增循环参数

PCR扩增包括18个温度递减的高严谨循环和30个欠严谨的荧光获得循环。95℃ for 2 minutes,18个温度递减的高严谨循环：6×1sec95℃,12sec64℃，8sec72℃；9×1sec95℃,12sec62℃，8sec72℃；3×1sec95℃,12sec60℃,8sec72℃。30个欠严谨的荧光获得循环：40×1sec95℃,12sec51℃,30sec67℃,and 10sec72℃。

6.PCR结果的判定和定量分析

DNA模板的制备过程均设有DNA提取的阴性和阳性对照，随后的PCR扩增对象包括待测样品的DNA模板、阴性和阳性对照、定量的标准试剂(每10μl标准品中含10⁴，10³，10²，10¹，1拷贝的23S rRNA基因)。

7.琼脂糖凝胶电泳

配制2％琼脂糖凝胶，取5μl PCR扩增产物，并用Safe DNA Gel Stain染色。在紫外灯下观察，所有11种衣原体在170bp处有目的条带，对熔解曲线相近或重合的衣原体种属可通过PCR产物测序方法进行分型。

实施例1：PCR法扩增肺炎衣原体ATCC株的核酸

肺炎衣原体标准株(ATCC株)经常规的Hep-2细胞培养收获，取200μl样品用于本发明所述的核酸提纯及PCR扩增。经合成标准品的定量换算，确定每ml收获样品中约含5×10⁸拷贝23S rRNA基因。

实施例2：PCR法检测禽类咽喉和泄殖腔拭子样品

采集自全国24个省市的4045份禽类咽喉和泄殖腔拭子样品。拭子样品采集后立即保存于1.5ml含有500μl核酸保护剂的EP管，后用本发明所述的方法进行核酸提纯，最后洗脱在200μl Elution Buffer洗脱液中，作为PCR的扩增模板。将衣原体核酸标准品10⁶/10μl的样品用ddH₂O稀释为10⁴/10μl和10³/10μl作为阳性对照，用本发明所述的特异性引物和探针检测拭子样品的核酸，根据不同种属衣原体的熔解曲线进行分类，T_m相近或重合的几种衣原体通过PCR产物测序方法等分型。使用本发明，我们在禽类拭子样品中共检测到5种不同的衣原体，分别为家畜衣原体、猪衣原体、鼠衣原体、鹦鹉热衣原体和C.gallinacea。

实施例3：PCR法检测细胞分离培养的衣原体阳性样品

临床采集的禽类咽喉和泄殖腔拭子阳性样品用Hep-2细胞分离培养，共分离到10株衣原体。收获样品用于核酸提纯，洗脱在200μl Elution Buffer洗脱液中，作为PCR扩增模板。将衣原体的23S rRNA核酸标准品10⁶/10μl的样品用ddH₂O稀释为10⁴/10μl和10³/10μl作为阳性对照，用23S rRNA基因的特异引物和探针检测，确定通过细胞培养分离到的衣原体为鹦鹉热衣原体和C.gallinacea，并经过PCR产物测序证实与分离培养结果相符。