一种利用双水相体系与超声集成提取黄皮叶总黄酮的方法

摘要

本发明公开了一种利用双水相体系与超声集成提取黄皮叶总黄酮的方法；所述方法首先将黄皮叶粉碎，加入一定浓度的异丙醇和硫酸铵水溶液形成双水相体系，以超声提取黄皮叶中总黄酮，所述方法在单因素试验结果基础上设计正交试验，优选出总黄酮的提取工艺条件；最佳提取条件确定为硫酸铵浓度310mg/mL，40％异丙醇溶液，超声时间20min，料液比1∶40；本发明的方法操作简便，缩短提取时间，有效的提高了提取效率。

说明书

技术领域

本发明属于提取总黄酮的技术领域，特别涉及一种利用异丙醇-硫酸铵双水相体系与超声集成提取黄皮叶总黄酮的方法。

背景技术

黄皮[Clausena lansium(Lour.)Skeels]属芸香科柑桔亚科植物，为多年生常绿大灌木或小乔木，原产我国南部，台湾、福建、广东、海南、广西、贵州南部、云南及四川金沙江河谷均有栽培。枝叶可做药材，具有解表散热、顺气化痰、杀菌、止血等功效。黄酮类化合物广泛存在于植物组织中，黄皮叶中含有丰富的黄酮类化合物。黄酮类化合物能预防许多疾病的突发，如心血管疾病等。传统提取植物中黄酮的方法有超临界CO₂萃取法、溶剂浸提法等。双水相萃取(Aqueous two-phase extraction，ATPE)技术是一种新型分离技术，其方法是一种或几种物质以适当的浓度溶解在水中，在一定条件下形成的互不相溶的水溶液系统，依据预分离物质在双水相体系(Aqueous two-phase system，ATPS)中分配的差异而达到萃取目的。ATPE具有操作简便、条件温和、产物纯度高、生物亲和性好、溶剂易回收、易于与其它技术集成等优点。

CN103211926A提出了一种双水相体系萃取葡萄籽中总黄酮的方法，该方法先用提取剂提取植物成分，过滤后得到提取液，再向提取液中加入乙醇、硫酸铵或丙醇、硫酸铵形成双水相体系，萃取、分液得到主要成分，步骤多，时间长。

针对现有技术的不足，本发明提出了一种新的提取黄皮叶总黄酮的方法，直接用异丙醇和一定量的硫酸铵配成双水相体系溶液，作为提取剂提取植物成分，边提取边萃取，步骤少、时间短、效率高。

发明内容

本发明公开了一种利用异丙醇-硫酸铵双水相体系与超声集成提取黄皮叶总黄酮的方法，所述方法包括以下步骤：

S100：将鲜黄皮叶经阴干后粉碎，过40目筛，密封贮存备用；

S200：向粉碎的黄皮叶中加入双水相体系；

S300：以超声提取黄皮叶中总黄酮，在单因素试验结果基础上设计正交试验，选择总黄酮的提取工艺条件。

所述步骤S200中双水相体系为无机盐与异丙醇组成的双水相体系。

所述的无机盐优选为硫酸铵、硫酸钠、氯化钠、碳酸钠、碳酸铵中的任一种，优选为硫酸铵。

在所述双水相体系中，所述无机盐的浓度优选为200-400mg/mL，所述异丙醇优选为20-40％异丙醇水溶液。

所述步骤S300中超声波额定功率为250W，超声提取时间为在20min。

所述黄皮叶质量与双水相体系的体积比值为1∶30。

所述无机盐浓度310mg/mL，所述异丙醇为40％异丙醇水溶液，黄皮叶与双水相体系的料液比1∶40(g/mL)，超声时间20min。

本发明的方法直接用异丙醇和一定量的硫酸铵配成双水相体系溶液，作为提取剂提取植物成分，边提取边萃取，步骤少、时间短、效率高。

用本发明的方法提取黄皮叶成分，过滤、分液后取异丙醇部分，低温蒸发烘干得总提取物，称重，分析其中黄酮含量为71.34％。

附图说明

图1为不同盐与异丙醇组成的双水相体系对黄皮叶黄酮提取率的影响；图中：a为(NH₄)₂SO₄，b为Na₂SO₄，c为(NH₄)₂CO₃，d为NaCl，e为Na₂CO₃；

图2为硫酸铵浓度对黄酮提取率的影响；

图3为异丙醇浓度对黄酮提取率的影响；

图4为超声时间对黄酮提取率的影响；

图5为料液比对黄酮提取率的影响。

具体实施方式

实施例1

一种利用异丙醇-硫酸铵双水相体系与超声集成提取黄皮叶总黄酮的方法，所述方法包括以下步骤：

S100：将鲜黄皮叶经阴干后粉碎，过40目筛，密封贮存备用；黄皮叶，采自柳州沙塘镇，经覃逸明博士鉴定为黄皮属芸香科柑桔亚科植物鲜叶。

S200：向粉碎的黄皮叶中加入双水相体系；准确称取黄皮叶粉末1.00g置于100mL圆底烧瓶中，分别按一定料液比加入不同浓度的异丙醇溶液与不同浓度的硫酸铵形成异丙醇-硫酸铵双水相溶液。

S300：以超声提取黄皮叶中总黄酮，在单因素试验结果基础上设计正交试验，选择总黄酮的提取工艺条件。

将所述含有黄皮叶的双水相溶液超声一定时间，将黄皮叶过滤，滤液置于分液漏斗中静置2h，分液后取上层溶液，用30％异丙醇定容至25mL，摇匀。

实施例2

本发明按下公式计算总黄酮提取率

总黄酮提取率(％)＝总黄酮质量(g)/黄皮叶粉末的质量(g)×100％

实施例3

盐类的选择 

取30mL 30％的异丙醇溶液，分别按300mg/mL加入硫酸铵、硫酸钠、氯化钠、碳酸钠、碳酸铵固体，震荡溶解，形成双水相体系，准确称取黄皮叶粉末1.00g，超声提取15min，过滤，滤渣用少量30％异丙醇溶液洗涤几次，收集滤液置于分液漏斗中静置2h，取上层溶液，用30％异丙醇定容至25mL，摇匀，按实施例2的方法测定黄酮含量，计算黄酮的提取率，实验结果见图1。

结果表明，用硫酸铵和异丙醇组成的双水相体系作为提取液黄酮的提取率比其他四种盐高，其黄酮提取率为2.68％，因此实验选用硫酸铵与异丙醇组成双水相体系对黄酮进行提取。

实施例4

单因素实验 

硫酸铵用量对提取率的影响

准确称取黄皮叶粉末1.00g 5份，取30mL 30％的异丙醇溶液，分别按240、260、280、300、320mg/mL加入硫酸铵固体，震荡溶解，形成稳定的双水相体系，超声15min，过滤，用少量30％异丙醇溶液洗涤几次，收集滤液置于分液漏斗中静置2h，取上层溶液，用30％异丙醇定容至25mL，摇匀，按实施例2的方法测定黄酮含量，计算黄酮提取率。

异丙醇浓度对提取率的影响

称取1.00g黄皮叶粉末6份，分别按浓度为300mg/mL加入硫酸铵，以料液比(m∶V)为1∶30分别加入20％、25％、30％、35％、40％、45％的异丙醇溶 液，超声时间15min，过滤，用少量30％异丙醇溶液洗涤几次，收集滤液置于分液漏斗中静置2h，取上层溶液，用30％异丙醇定容至25mL，摇匀，按实施例2的方法测定黄酮含量，计算黄酮提取率。

超声时间对提取率的影响

称取1.00g黄皮叶粉末6份，分别按料液比(m∶V)为1∶30加入40％的异丙醇溶液，分别超声5、10、15、20、25、30min，过滤，用少量30％异丙醇溶液洗涤几次，收集滤液置于分液漏斗中静置2h，分取上层溶液，用30％异丙醇定容至25mL，摇匀，按实施例2的方法测定黄酮含量，计算黄酮提取率。

料液比对提取率的影响

称取1.00g黄皮叶粉末7份，分别按1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45加入40％异丙醇溶液和300mg/mL硫酸铵组成的双水相体系溶液，超声20min，过滤，用少量30％异丙醇溶液洗涤几次，收集滤液置于分液漏斗中静置2h，分液，取上层溶液，用30％异丙醇定容至25mL，摇匀，按实施例2的方法测定黄酮含量，计算黄酮提取率。

单因素实验结果

硫酸铵浓度对黄酮提取率的影响

实验结果如图2所示。

图2表明，总黄酮提取率随硫酸铵浓度先增加后下降，硫酸铵浓度在240～300mg/mL间，总黄酮提取率随着硫酸铵浓度的增加而增大，而硫酸铵浓度达到320mg/mL后，总黄酮提取率开始降低，可看出硫酸铵浓度为300mg/mL左右时总黄酮提取率最大。

异丙醇浓度对黄酮提取率的影响

实验结果如图3所示。

由图3可看出，随异丙醇浓度的增大，总黄酮提取率先增后减；其浓度在20％～40％时，总黄酮提取率随异丙醇浓度增大而增高；异丙醇为45％时总黄酮提取率下降。因此，实验选择40％异丙醇效果较佳。

超声时间对黄酮提取率的影响

实验结果如图4所示。

由图4可见，随超声时间的增加，总黄酮提取率逐步增高，在5～20min内增加较快，20min后增加幅度较小，这是因为黄酮提取已接近完全，因此超声时 间为在20min左右为宜。

料液比对黄酮提取率的影响

实验结果如图5所示。

由图5可看出，料液比在1∶15～1∶30时增长快，1∶35后开始下降，可以看出总黄酮提取率在料液比1∶30时最大，因此料液比为1∶30提取效果较好。

实施例5

正交实验

根据单因素实验结果，用L₉(3⁴)表设计安排正交实验，实验因素水平见表1，正交实验安排及结果见表2。

表1 正交实验因素水平表

由实施例4中单因素实验可知，超声-双水相集成提取黄皮叶总黄酮时，其提取率受硫酸铵浓度、异丙醇浓度、超声时间、料液比四个因素进行，为进一步对黄酮提取条件进一步优化，进行4因素3水平的正交实验，正交实验因素水平见表1，实验安排及结果见表2。

表2 正交实验安排及实验结果

根据正交实验结果的极差R可得各因素对总黄酮提取率的主次从大到小依次为B＞C＞D＞A，即异丙醇浓度＞料液比＞超声时间＞硫酸铵用量；根据k值大小确定最佳提取条件为A₃B₃C₃D₃，即40％异丙醇，料液比1∶40，超声时间20min，硫酸铵浓度310mg/mL。

实施例6

黄酮含量的测定方法，：

准确称取10.00mg芦丁对照品，加甲醇10mL，微热溶解，冷却至室温，转移至50mL容量瓶，用甲醇溶液定容，摇匀，得浓度为0.20mg/mL芦丁对照品溶液，移取0.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0mL芦丁对照品溶液于25mL容量瓶中，加水至10ml左右，加5％NaNO21.00mL，摇匀，放置5min，加10％Al(NO3)31.0mL，摇匀，放置5min，加4％NaOH 10mL，加水至刻度线，摇匀，放置15min，以空白为参比，在最大吸收波长510nm处测吸光度值。以芦丁标准溶液的浓度为纵坐标，以吸光度A为横坐标，绘制标准曲线，用最小二乘法进行回归，得到吸光度和芦丁标准溶液的浓度c(mg/mL)的回归方程：c＝0.1825A+0.001，相关系数r＝0.9973，这表明该方法在0.00-0.08mg/mL浓度范围内有良好的线性关系，可用于黄皮叶中总黄酮含量的测定。

量取供试品溶液一定量，按上述方法分别加入溶液并测定吸光度值，将吸光度值代入回归方程计算总黄酮浓度和样品中总黄酮质量，按实例2方法计算总黄酮提取率。

实施例7

一种利用异丙醇-硫酸铵双水相体系与超声集成提取黄皮叶总黄酮的方法，几个不同条件下总黄酮提取得率的比较：

S100：准确称取黄皮叶粉末置于100mL圆底烧瓶中； 

S200：将硫酸铵用一定浓度(20％～45％)异丙醇水溶液配成双水相体系溶液(浓度为240～320mg/mL)；

S300：按一定料液比(1∶15至1∶40间)准确量取双水相体系溶液，倒入上述圆底烧瓶中与黄皮叶粉末混合；

S400：超声提取一定时间(5～30min)，过滤、分液后，测得总黄酮提取得率为1.62％。

改变硫酸铵浓度、异丙醇浓度、料液比和超声时间，测得不同条件下几个结果如下：

表3 不同条件下总黄酮提取得率的比较

注：实验5为本方法最优条件的提取效果。