羟基-鞘磷脂22:1作为健康性老化的生物标志物

摘要

使用基于NMR/MS的代谢组学和靶向脂质组学方法，本发明人在包括百岁老人、较年长者和年轻成年人的群组中研究了老化和长寿的代谢表型。本发明人鉴定了降低的老化相关慢性炎性病症发生风险的生物标志物，提出使用羟基-鞘磷脂SM-OH 22:1作为生物标志物诊断允许延迟和/或避免老化相关慢性炎性病症的生活方式的方法。

说明书

技术领域

本发明一般涉及健康生活方式和老化相关慢性病症的预防。特别地， 本发明涉及生物标志物及其在检测生活方式的改善中的应用。由此，本发 明提供例如羟基-鞘磷脂22:1(SM-OH 22:1)作为生物标志物，还提供使用生 物标志物羟基-鞘磷脂22:1诊断生活方式的方法，其中所述生活方式允许 延迟和/或避免老化相关的慢性炎性病症。

背景技术

老化被定义为：时间依赖性的功能性能力(functional capacity)和压力 抵抗(stress resistance)的下降，与增加的发病和死亡风险相关。此外，人类 的老化表型具有非常大的异质性，可以描述为因各种各样环境的、随机的 和遗传-后生的变量的相互作用引起的复杂镶嵌(complex mosaic)。几十年 的老化研究已经发现与老化过程相关的数百个基因和许多生物学过程，但 是同时，许多基本问题仍未回答、或是激烈争议的对象。

这些问题常常不能通过检查单个基因或单个途径来解决，但是可以在 系统水平得到较好的解决，体现了老化是一个复杂的多因素过程。此外， 老化可以伴有慢性的低度炎性状态，该状态因促炎和抗炎过程之间的失衡 引起，是一种致病性状况，已经被揭示在主要的年龄相关慢性疾病如动脉 粥样硬化、2型糖尿病和神经变性的发病中具有关键性。

在此看法中，后天获得的健康老化和长寿可能不仅反映了较低的炎性 反应累积倾向，也反映了有效的抗炎网络发育。此外，越来越多地意识到 肠道微生物群(microbiota)的变化因其对宿主哺乳动物系统的影响而具有 重要性，肠道微生物群已经在几种疾病如胰岛素抗性、克罗恩氏病、肠易 激惹综合征、肥胖和心血管疾病的病因学中展示了直接的影响。

代谢组学(Metabonomics)现今被认为是表征代谢表型的一种成熟系统 方法，代谢表型由针对各种内在和外在参数的协同生理学反应引起，所述 参数包括环境、药物、饮食模式、生活方式、遗传和微生物组(microbiome)。 与基因表达和蛋白组数据指示生理学改变的可能性不同，代谢物及其浓度 在细胞、组织和器官中的动力学变化是生理调节过程的真正终点。

代谢物组学(Metabolomics)已经成功地应用于小鼠、狗和非人灵长 类动物中研究营养干预后老化过程的调节(包括卡路里限制诱导的代谢变 化)。特别地，在犬群中肠道微生物群代谢的显著改变与老化相关。尽管有 这些发现，但是对影响老化过程的分子机制的全面描绘尚未见报道。此外， 仍然缺少对长寿的代谢表型研究。

因此，本发明的目的是，向本领域提供可以容易地进行检测且允许对 如下生活方式作出诊断的生物标志物，所述生活方式可能允许健康性老化， 且尤其允许延迟和/或避免老化相关的慢性炎性病症。

发明内容

本发明人惊奇地发现，通过独立权利要求的主题，他们能够实现本发 明的目的。从属权利要求进一步拓展本发明的构思。

在尿中使用组合的整体¹H核磁共振(NMR)光谱学，在血清中使用靶 向质谱(MS)和脂质组学(lipidomic)方法，本发明人可以在包括百岁老人、 较年长者和年轻成年人的一个明确限定的老化群组中检测代谢谱的改变。

所选的老化组是意大利北部的一个限制性地理区域中的均质群体，包 括年轻成年人(平均31岁)、较年长者(70岁)和百岁老人(100岁)。在这三个 老化组中，百岁老人是公认的健康性老化和长寿的模型[Sansoni P,等,Exp  Gerontol.2008；43:61-65；Franceschi C,等,Mech Ageing Dev. 2007；128:92-105；Cevenini E,等,Expert Opin Biol Ther. 2008；8:1393-1405]。他们后天获得的成功老化似乎是由促炎力和抗炎力之 间的最佳平衡驱动的[Franceschi C,等,Mech Ageing Dev. 2007；128:92-105]。

本发明人惊奇地发现在较年长者和百岁老人的表型之间存在显著差 异，其中肠道微生物群和宿主之间相互作用的动力学以及炎症反应的中立 平衡在长寿表型中要显著得多。

本发明人通过使用互补的NMR-MS代谢物组学和脂质组学 (lipidomic)方法，在尿和血清两者中表征了老化和长寿的代谢表型(代谢 型，metabotype)。

因为独特的延迟疾病和伤残进入其生命后期岁月的能力，百岁老人达 到人类寿命的最极限。经典临床参数(表1)显示，百岁老人具有非常低的胰 岛素抗性发生率，具有对于其年龄而言最佳的人体测量值(BMI)、代谢值(胆 固醇、LDL-C、HDL-C、甘油三酯)。此外，使用简易精神状态检查表(MMSE) 测量了他们的认知功能，发现严重认知衰退的低发生率。

特别地，百岁老人表现出独特的代谢表型。尿的代谢谱分析揭示了， 长寿表型受到肠道微生物组的高度影响，表现出更高的苯乙酰谷氨酰胺 (PAG)和硫酸对甲酚(PCS)排泄。本发明人提出，肠道微生物群大量代谢蛋 白质和芳族氨基酸，包括苯丙氨酸和酪氨酸，以形成苯乙酰谷氨酰胺和硫 酸对甲酚。

基于MS的靶向代谢组学综合分析揭示了血清中与长寿和健康性老化 相关的重要生物学改变。此外，三个年龄组之间，百岁老人是具吸引力的 用于表征的长寿模型，因为独特的延迟疾病和伤残进入其生命后期岁月的 能力，他们达到人类寿命的最极限。在老化进程中，本发明人观察到溶血 磷脂酰胆碱(LPC 18:2,LPC 20:4)的降低，其浓度在百岁老人中降低更多。 尤其是，LPC 18:0的减少看上去是百岁老人所特有的。尽管有必要注意到 LPC基于脂肪酸链长和饱和度具有不同种类，其生理学和生物学性质不 同，但是磷脂类通常是促炎性的[Aiyar N,等,Mol Cell Biochem. 2007；295:113-120]，具有导致动脉粥样硬化的性质[Schmitz G,等, Atherosclerosis.2010；208:10-18]，常常在2型糖尿病患者中见到其水平增 加[Rabini RA,等,Diabetes.1994；43:915-919]。

年长的百岁老人表现出几种酰基醚PC浓度的平衡改变，其中三种PC， 即PC-O 34:3、PC-O 36:4和PC-O 40:1的含量显著降低，而两种醚PC， 即PC-O 32:1和PC-O 34:1显著更高。尽管对醚磷脂的生理学作用了解较 少，但是含有连接sn-1脂族链至甘油主链的乙烯基醚键的缩醛磷脂是丰度 最大的醚磷脂。在此，酰基醚磷脂酰胆碱类分子的水平差异可能由处理氧 化损伤方面的差异造成。

在年龄进程中，观察到鞘磷脂(SM)类分子(SM 24.1和SM 16:0)中 明显地增加。本发明人还发现在百岁老人中SM24:0和SM-OH 22:1浓度 的特异减低。SM类分子是重要的细胞膜组成成分，在构建、代谢和运输 中与胆固醇紧密结合，富集在脂筏中。SM的生理学作用仍不清楚，先前 的研究显示了升高的SM水平和动脉粥样硬化之间的关系[Kummerow FA, 等,J Nutr Biochem.2001；12:602-607]，而其它研究显示血浆鞘磷脂水平与 增加的CVD事件风险无关。最后，尽管大多数二酰基磷脂酰胆碱类分子 (PC-O)的水平没有显著改变，但百岁老人表现出单独PC-O 36:2水平的改 变。

PC和PC-O含量的变化影响花生四烯酸代谢物合成(前列腺素、血栓 素、白三烯)的活性，这些代谢物是宿主生理反应的关键介质和调节剂，参 与氧化应激、细胞凋亡和免疫及炎症功能的调节。事实上，百岁老人还显 示出具有抗炎和促炎性质的脂质介质的独特平衡网络。

与较年长者相比，观察到更高浓度的白三烯类分子LTB-4和LTE-4。 百岁老人展示出更高水平的15-羟基-二十碳四烯酸(15-HETE)——15-脂加 氧酶(15-LOX)的主要产物。15-HETE抑制5-脂加氧酶形成，减少白三烯 B4和12-HETE的产生，抑制免疫反应。与较年长者相比，在百岁老人中 还观察到CYP途径活化的增加，其中8,9-EpETrE产生增加而 11,12-DiHETrE的浓度降低。EpETrE是心脏和心外组织中许多细胞内信 号传导的重要成分。研究已经证实，EpETrEs通过抑制核因子(NF)-κB介 导的基因转录的激活而表现出抗炎作用。此外，它们还在血管系统中显示 出溶血栓和血管发生性质。EpETrEs可以被可溶性环氧化物水解酶(sEH) 进一步代谢为二羟基-二十碳三烯酸(DiHETrE)。

一般，当EpETrEs被sEH代谢为DiHETrEs时，它们的生物学活性 将变得较不显著，因此，在此11,12-DHET浓度的降低可能揭示了减少的 sEH对其前体11,12-EpETrE的作用。

百岁老人显示出9-HODE(一种生物学活性分子，脂质过氧化的标志物) 和9-氧代-HODE(亚油酸的稳定氧化产物，当氧化应激增加时，其产生增 加)的明显降低。大多数亚油酸以PC和胆固醇亚油酸脂的酯化形式存在， 两者均是LDL的主要成分，并持续暴露于许多类型氧化应激以产生氢氧 (hydroxy)和过氧氢(hydroperoxy)类分子。

增加水平的脂质氧化产物，例如9-氧代ODE先前曾在患有类风湿性 关节炎和动脉粥样硬化的患者血浆样品中被检测到。

此外，与较年长者相比，百岁老人显示出二十碳五烯酸(EPA)的耗竭。 尽管在人体中EPA可以从α-亚油酸合成、或以更大的量直接从含油鱼或 鱼油补充物获得，但是EPA可以转化为n-3类二十烷酸，其具有多种多 样的功能。EPA的耗竭可能反映了n-3类二十烷酸的生物合成增加。

因此，本发明部分地涉及诊断生活方式的方法，所述生活方式允许延 迟和/或避免老化相关的慢性炎性疾病，所述方法包括：

-从受试者获得血清样品；

-确定样品中SM-OH 22:1的水平，和

-将受试者的SM-OH 22:1水平与预定参考值比较，

其中预定参考值以对照群体中的平均血清SM-OH 22:1水平为基础， 其中相比于该预定参考值，样品中较低的血清SM-OH 22:1水平指示延迟 和/或避免老化相关的慢性炎性病症的可能性增加。

本方法具有例如从受试者获取血清是成熟方法的优点。实际的诊断方 法可以在体外血清样品中进行。

样品中羟基-鞘磷脂22:1水平可以通过本领域已知的任何方式进行检 测和定量。例如，可以使用质谱如UPLC-ESI-MS/MS或NMR谱如 ¹H-NMR谱。其它方法，例如其它光谱方法、色谱方法、标记技术、或定 量化学方法也可以使用。

预定参考值以对照群体中平均血清羟基-鞘磷脂22:1水平为基础。对 照群体可以是至少3个，优选至少10个，更优选至少50个具有相似遗传 背景、年龄和平均健康状况的人组成的群体。

对照群体也可以是相同个体，由此预定参考值为先前从相同受试者获 得的值。这将例如允许直接比较目前的生活方式和先前的生活方式，可以 直接评估生活方式的改善。

典型的老化相关慢性炎性病症是本领域熟知的。大部分的老化表型可 以通过炎性和抗炎网络之间的失衡来解释，该失衡导致老化的低度慢性促 炎状态，炎症性老化“inflamm-ageing”(Candore G.,等,Biogerontology. 2010 Oct；11(5):565-73)。

典型的老化相关炎性病症有：例如，动脉粥样硬化、关节炎、痴呆、2 型糖尿病、骨质疏松和心血管疾病。例如，对于这些病症，炎症被视为是 连接老化和年龄相关病理过程的分子改变的可能潜在基础(Chung等, ANTIOXIDANTS&REDOX SIGNALING,Volume 8,Numbers 3&4, 2006,572-581)。

对于本发明的目的，羟基-鞘磷脂(SM-OH)22:1可以作为唯一标志 物使用。

尽管对于本发明诊断方法而言SM-OH 22:1作为唯一标志物是有效工 具，但是如果诊断依赖于一个以上标志物，则可以提高所述诊断的质量和/ 或预测力。

因此，可以与SM-OH 22:1组合使用一种或多种用于延迟和/或避免老 化相关的慢性炎性病症的可能性的其它标志物。

本发明人惊奇地观察到，也可以使用其它生物标志物检测延迟和/或避 免老化相关的慢性炎性病症的可能性。

由此，本发明人鉴定到，增加血清浓度的

1-O-烷基-2-酰基甘油磷酸胆碱(PC-O)32:1,

1-O-烷基-2-酰基甘油磷酸胆碱(PC-O)34:1,

15-羟基-二十碳四烯酸(15-HpETE),

白三烯E4(LTE4),

白三烯B4(4LTB),和/或

8,9-环氧二十碳三烯酸(8,9 EpETre)

允许诊断允许延迟和/或避免老化相关慢性炎性病症的生活方式，

而降低血清浓度的

溶血磷脂酰胆碱(LPC)18:0

鞘磷脂(SM)24:0,

1-O-烷基-2-酰基甘油磷酸胆碱(PC-O)34:3,

1-O-烷基-2-酰基甘油磷酸胆碱(PC-O)36:4,

1-O-烷基-2-酰基甘油磷酸胆碱(PC-O)40:1，

磷脂酰胆碱(PC)36:2,

羟基十八碳二烯酸(9-HODE),

9-氧代-十八碳二烯酸(9-氧代-HODE)，

和/或

11,12-环氧二十碳三烯酸(11,12-DiHETre)

允许诊断允许延迟和/或避免老化相关慢性炎性病症的生活方式。

各类脂质分子按如下进行注释：

[脂质类型][碳原子总数]:[双键总数]。例如，PC 34:1反映包含34个 碳原子和1个双键的磷脂酰胆碱类分子。

因此，在本发明的方法中，可以还通过评估，相对于先前获得的参考 值，血清中一种或多种下述生物标志物的浓度是否增加：PC-O 32:1、PC-O 34:1、15-HpETE、LTE4、LTB4、8,9 EpETre和/或血清中一种或多种下 述生物标志物的浓度是否降低：LPC 18:0、SM 24:0、PC-O 34:3、PC-O 36:4、PC-O 40:1、PC 36:2、9-HODE、9-氧代-HODE、11,12-DiHETre， 以提高诊断的准确性。

本发明方法可以包括对至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、 至少6个、至少7个、或至少8个生物标志物的评估。

例如，可以评估SM-OH 22:1连同LPC 18:0。

也可以评估SM-OH 22:1连同SM 24:0。

可以评估SM-OH 22:1连同PC-O 34:1。

可以评估SM-OH 22:1连同LTE4。

可以评估SM-OH 22:1连同PC-O 40:1。

可以评估SM-OH 22:1连同LPC 18:0和SM 24:0。

可以评估SM-OH 22:1连同LPC 18:0，SM 24:0和PC-O 40:1。

可以评估SM-OH 22:1连同LPC 18:0,SM 24:0,PC-O 40:1和 9-HODE。

可以评估SM-OH 22:1连同LPC 18:0,SM 24:0,PC-O 40:1,9-HODE、 和9-氧代-HODE。

可以评估SM-OH 22:1连同LPC 18:0,SM 24:0,PC-O 40:1,9-HODE, 9-氧代-HODE和PC-O 34:1。

可以评估SM-OH 22:1连同LPC 18:0、SM 24:0、PC-O 40:1、9-HODE、 9-氧代-HODE、PC-O 34:1和LTE4。

评估一个以上生物标志物的优点是，评估的生物标志物越多，诊断将 变得越可靠。如果例如如上所述1,2,3,4,5,6或7个以上的生物标志物表 现出升高或降低的浓度，则强烈指示延迟和/或避免老化相关慢性炎性病症 的可能性增加。

因此，本发明方法可以进一步包括确定样品中LPC 18:0，SM 24:0, PC-O 40:1,9-HODE,9-氧代-HODE，PC-O 34:1或LTE4中至少一个的水 平，并将LPC 18:0,SM 24:0,PC-O 40:1,9-HODE,9-氧代-HODE,PC-O 34:1或LTE4中至少一个的受试者水平与预定参考值比较，其中预定参考 值以对照群体中LPC 18:0，SM 24:0,PC-O 40:1,9-HODE,9-氧代-HODE， PC-O 34:1或LTE4的平均血清水平为基础，且其中，相对于预定参考值， 样品中较低血清SM-OH 22:1水平和/或样品中较低血清LPC 18:0，SM 24:0,PC-O 40:1,9-HODE或9-氧代-HODE水平指示，延迟和/或避免老化 相关慢性炎性疾病的可能性增加，和/或其中与预定参考值比较，样品中升 高的血清PC-O 34:1和/或LTE4水平指示，延迟和/或避免老化相关慢性炎 性病症的可能性增加。

本发明诊断的准确性可以通过如下而进一步提高：还评估，相对于先 前获得的参考值，血清中生物标志物PC-O 32:1,15-HpETE,LTB4,8,9 EpETre中一个或多个是否增加，和/或血清中生物标志物PC-O 34:3,PC-O 36:4,PC 36:2,11,12-DiHETre中一个或多个是否降低。

本发明方法可以另外地或备选地用于诊断允许健康和/或更健康的老 化的生活方式。

可以通过将实际的PAG和/或PCS水平与先前从相同个体获得的预定 参考值比较，诊断更健康的老化。因此，在将相同受试者用作对照群体的 情况下，可以直接观察生活方式的改善，从而消除了在其它平均对照群体 中由稍微不同的条件而引起的不确定性。

本发明方法还可以用于诊断长寿；和/或长寿的可能性。这具有优 点——可以直接检测更健康生活方式的后果，可以监测健康生活方式的维 持，以及可以在不健康的生活方式的第一次临床表现出现前纠正不健康的 生活方式。

本发明方法还可以备选地和/或另外地用于诊断更健康的肠道微生物 菌群-宿主相互作用。肠道微生物组对宿主发挥着多种重要的生物化学功 能，微生物组的紊乱与许多且多样的人类疾病过程相关(Kinross等, Genome Medicine 2011,3:14)。不利的肠道微生物菌群-宿主相互作用可以 具有许多临床表现，例如系统疾病状态，如肥胖和心血管疾病；或肠道状 况，如炎症性肠病。

可以在任何受试者中诊断肠道微生物菌群-宿主相互作用，但是可能尤 其重要的是在成年人或较年长者中监测健康的微生物菌群-宿主相互作用。

因此，可以在较年长者中诊断更健康的肠道微生物菌群-宿主相互作 用。

如果受试者超过其来源国的平均预期寿命的前二分之一，优选地其超 过其来源国的平均预期寿命的前三分之二，更优选地其超过其来源国的平 均预期寿命的前四分之三，最优选地其超过其来源国的平均预期寿命的前 五分之四，则该受试者被视为―较年长者‖。

例如，如果受试者是人，则本发明方法可以在至少45岁，至少60岁， 或至少75岁的成年人上实施。

待使用本发明方法检查的受试者可以是人或动物，尤其是例如哺乳动 物。典型的动物可以是例如陪伴动物如猫或狗或农场动物。

本发明方法可以另外地或备选地用于检测生活方式改变的结果。因此， 可能有利的是，将SM-OH 22:1水平以及任选地本文提及的其它生物标志 物的水平与先前(例如在生活方式改变之前或生活方式改变的较早期)获自 受试者的SM-OH 22:1水平和任选地其它生物标志物的水平进行比较。

因此，本发明方法可以诊断更健康的生活方式，其中预定参考值基于 从生活方式改变前的受试者获得的血清SM-OH 22:1水平和任选地其它生 物标志物的水平。

生活方式改变可以是任何改变，例如不同的工作、更多的睡眠、较少 的饮酒、更多的挑战、较少的压力、较少的吸烟、更多的运动、不同的工 作和/或生活环境，等等。

生活方式的改变还可以是饮食的变化。

饮食变化可以是例如使用先前未用过的或以不同量使用的至少一种营 养产品。

由此，本发明方法可以用于检查新营养方案、营养产品和/或药物的有 效性。

营养产品可以是例如声称对健康性老化和/或避免老化相关的慢性炎 性病症有作用的产品。

典型地，营养产品可以是食品、饮品、宠物食品、食物增补物、营养 药、食物添加剂、或营养配方产品。

样品中生物标志物的水平例如SM-OH 22:1的水平和任选地其它生物 标志物的水平可以通过本领域已知的任何方式检测和定量。例如，可以使 用质谱如UPLC-ESI-MS/MS，或NMR光谱如¹H-NMR光谱。

其它方法，例如其它光谱方法、色谱方法、标记技术或定量化学方法 也可以使用。

本发明方法包括将测试的受试者的SM-OH 22:1水平和任选地其它生 物标志物的水平与预定参考值比较，所述预定参考值可以源自可比对照受 试者的血清SM-OH 22:1水平和任选地其它生物标志物的水平。

受试者的SM-OH 22:1水平和任选地其它生物标志物的水平与相应的 对照值之间的差异程度也可以用于表征风险程度，并由此确定哪些受试者 将最为得益于某些治疗。

SM-OH 22:1的参考值以及任选地其它生物标志物的参考值优选使用 如下单位度量，所述单位与表征从测试的受试者获得的SM-OH 22:1及任 选地其它生物标志物的水平时使用的单位相同。因此，如果SM-OH 22:1 及任选地其它生物标志物的水平是绝对值，例如SM-OH 22:1的单位(μmol/ l(μM))，则参考值也基于一般群体或选择的对照受试者群体中的个体的 SM-OH 22:1单位((μmol/l(μM))。

此外，参考值可以是单个截断值，例如中值或平均值。在获得的血清 样品中SM-OH 22:1和任选地其它生物标志物的参考值，例如平均水平、 中值水平或―截断‖水平，可以通过分析一般群体或所选群体中的大样本个 体，使用统计学模型而建立，例如预测值方法用于选择阳性标准，或受试 者工作特征曲线(receiver operator characteristic curve)定义最佳特异性 (最高的真阴性率)和灵敏度(最高的真阳性率)，描述见并入此处作为参考的 Knapp,R.G.和Miller,M.C.(1992).Clinical Epidemiology and  Biostatistics.William and Wilkins,Harual Publishing Co.Malvern,Pa.。

本领域技术人员知晓如何分派正确的参考值，其将随着性别、种族、 基因遗传、健康状况或年龄等而变。

例如，预定参考平均值可以是

-2μM的1-O-烷基-2-酰基甘油磷酸胆碱(PC-O)32:1,

-7.80μM的1-O-烷基-2-酰基甘油磷酸胆碱(PC-O)34:1,

-1.25ng/100μl血清的15-羟基-二十碳四烯酸(15-HpETE),

-0.013ng/100μl血清的白三烯E4(LTE4),

-0.020ng/100μl血清的白三烯B4(4LTB)，和/或

-0.070ng/100μl血清的8,9-环氧二十碳三烯酸(8,9EpETre)

-16.07μM的羟基-鞘磷脂(SM-OH)22:1,

-52.00μM的溶血磷脂酰胆碱(LPC)18:0,

-25.00μM的鞘磷脂(SM)24:0,

-5.07μM的1-O-烷基-2-酰基甘油磷酸胆碱(PC-O)34:3,

-14.30μM的1-O-烷基-2-酰基甘油磷酸胆碱(PC-O)36:4,

-1.41μM的1-O-烷基-2-酰基甘油磷酸胆碱(PC-O)40:1,

-10.00μM的磷脂酰胆碱(PC)36:2,

-0.34ng/100μl血清的羟基十八碳二烯酸(9-HODE),

-0.043ng/100μl血清的9-氧代-十八碳二烯酸(9-氧代-HODE),和/或

-0.017ng/100μl血清的11,12-环氧二十碳三烯酸(11,12-DiHETre)。

较高或较低的值指示增加的延迟和/或避免老化相关慢性炎性病症的 可能(如上详述)。

本发明人也惊奇地发现可以用于诊断生活方式的尿中的其它生物标志 物，所述生活方式允许延迟和/或避免老化相关慢性炎性病症。

由此，本发明人鉴定了，苯乙酰谷氨酰胺(PAG)和/或硫酸对甲酚(PCS) 的增加的尿浓度允许诊断如下生活方式，所述生活方式允许延迟和/或避免 老化相关慢性炎性病症。

苯乙酰谷氨酰胺(PAG)和/或硫酸对甲酚(PCS)可以使用本发明的方法 评估，其中唯一的差异在于使用尿样品。

尿样品具有其可以非侵入式获得和分析的优点。

PAG和PCS的预定参考值可以由本领域技术人员确定，并且随情形 而变化很大。例如，尿中，典型的参考值对于PCS可以是63μmol/mmol 肌酐，对于PAG可以是81μmol/mmol肌酐。更高的值指示增加的延迟和 /或避免老化相关慢性炎性病症的可能性。

本发明也延及新生物标志物的发现，所述新生物标志物可以用于诊断 允许延迟和/或避免老化慢性炎性病症的生活方式。

因此，本发明包括用于诊断允许延迟和/或避免老化慢性炎性病症的生 活方式的生物标志物，其中所述生物标志物是SM-OH 22:1。

该生物标志物可以在血清中检测，其具有待测样品能够容易获得(可以 在为其它目的分析血清时)的优点。

本领域技术人员理解，他们可以自由地组合本文描述的所有本发明特 征，而不偏离所公开的本发明的精神。尤其是，针对本发明方法描述的特 征可以应用于本发明的生物标志物，反之亦然。

本领域技术人员也将理解，尽管在文中将生物标志物及其在诊断方法 中的应用描述为

-诊断允许延迟和/或避免老化相关慢性炎性病症的生活方式,

-诊断允许健康老化的生活方式,

-诊断长寿，和/或

-诊断更健康的肠道微生物菌群-宿主相互作用,

但是所述生物标志物同样也可以应用于方法中以

-诊断促进老化相关慢性炎性病症发生的生活方式,

-诊断可能防止健康老化的生活方式,

-诊断寿命缩短的风险，和/或

-诊断较不健康的肠道微生物菌群-宿主相互作用。

在其它方面，本发明提供方法用于：

-延迟、避免和/或防止老化相关慢性炎性病症的发生,

-促进健康老化，

-促进长寿，

-降低寿命缩短的风险，

-促进更健康的肠道微生物菌群-宿主相互作用，和/或

-防止较不健康的肠道微生物菌群-宿主相互作用。

典型地这些方法包括步骤：对受试者实施本文描述的诊断方法；和基 于其结果，改变受试者的生活方式。例如，该方法可以包括：如果诊断步 骤的结果指示：在受试者中

-增加的发生老化相关慢性炎性病症的可能性,

-可能防止健康老化的生活方式，

-寿命缩短的风险，和/或

-较不健康的肠道微生物菌群-宿主相互作用；

则改变受试者的生活方式。

受试者生活方式的改变可以是本文所述的任何改变，例如饮食变化、 不同工作、更多睡眠、较少饮酒、更多挑战、较少压力、较少吸烟、更多 运动、不同的工作和/或生活环境，等等。

优选地，所述改变是使用先前未用过或以不同量用过的至少一种营养 产品，例如对健康老化和/或避免老化相关慢性炎性病症有作用的营养产品 (包括食品、饮料、宠物食品、食物补充物、营养药、食物添加剂或营养配 方产品)。

改变受试者生活方式也包括指明受试者需要改变他/她的生活方式，例 如向受试者开处方、推荐和/或建议如上所述的生活方式改变。例如，该方 法可以包括步骤：向受试者施用或提供至少一种上述营养产品。

从下面的表格、实施例和附图，本发明的其它优点和特点将是明显的。

表1显示募集的老化群组的人口统计学和临床特征。数值表示为平均 值(^±SD)，括号中显示范围。¹BMI＝身体质量指数，²糖尿病:糖尿病史、空 腹血浆葡萄糖≥126mg/dl，³HDL＝高密度脂蛋白，⁴LDL＝低密度脂蛋白， ⁵MMSE＝使用简易精神状态检查表(MMSE)的认知功能量度。分析中使用 的分值对于老年人通过年龄和受教育年数进行校正。对于较年长者的认知 损伤，MMSE分级为重度(分值0-17)、轻度(分值18-23)、或不存在(分值 24-30)。对于百岁老人，MMSE≥20不存在严重认知下降；<12存在严重 认知下降。⁶CRP＝C反应蛋白；⁷A-SAA＝血清淀粉样蛋白A(SAA)蛋白质。

表2展示所选老化群之间的辨别模型的特征和模型总结。

表3显示通过¹H-NMR检测到的3个年龄组在尿中的所有被显著调节 的代谢物。为了获得半定量信息，针对所述三个代谢物，进行原始光谱中 的峰面积的积分，通过使用Wilcoxon秩和检验验证具有统计学显著性的差 异，并标记如下：*p<0.05.,**p<0.01,***p<0.001。

表4展示通过LC-MS检测到的3个年龄组在血清中的所有被显著调 节的代谢物。数值表示为平均值±SD,并标记如下:*p<0.05.,**p<0.01, ***p<0.001。

表5展示通过UPLC-ESI-MS/MS分析的3个年龄组在血清中的炎性 标志物的浓度水平(ng/100μl)，并标记如下:*p<0.05.,**p<0.01, ***p<0.001。

图1为来自老化群组的典型尿600Mhz谱，显示由主要低分子量分子 引起的峰，所述主要低分子量分子为例如酮体、有机酸、氨基酸、以及源 自哺乳动物和肠道微生物代谢的代谢物(PAG和PCS)。

图2显示(A)来自较年长者和百岁老人及(B)来自年轻成年人和百岁老 人的尿¹H-NMR谱的OPLS-DA分值。

图3显示自较年长者和百岁老人的尿¹H-NMR谱产生的系数图。

图4显示有关半定量信息的盒式图，源自原始光谱中PAG和PCS的 峰面积(曲线下面积)。统计学显著性通过使用Wilcoxon秩和检验验证， 并列于表3中。

图5a和5b显示通过靶向UPLC-ESI-MS/MS代谢组学分析测量的、 三个老化时间点之间脂质组谱(平均脂质浓度)的差异。盒式图反映变化， 从左到右指示百岁老人、较年长者和年轻个体。浓度为μM。平均值±SD 来自三个老化组的靶向MS，统计学显著性通过使用Wilcoxon秩和检验验 证并列于表4中。仅显示显著差异，并通过Mann-Whitney U检验进行了 评估。

图6显示通过靶向UPLC-ESI-MS/MS代谢组学分析测量的、三个老 化时间点之间脂质组学谱的差异(结果表示为ng/100μl，代表平均脂质浓 度)。盒式图反映变化，从左到右指示百岁老人、较年长者和年轻个体。平 均值±SD来自三个老化组的靶向MS，统计学显著性通过使用Wilcoxon 秩和检验验证并列于表5中。仅显示显著差异，并通过Mann-Whitney U 检验进行了评估。

实施例：

受试者和研究组别

对于要进行的研究，每个个体和他们的家庭均给出了知情同意书。总 共，在意大利北部(包括博洛尼亚、佛罗伦萨、帕尔马、米兰)，入选了 属于不同年龄组的541名受试者用于本研究。百岁老人组由156名个体(125 名女性和31名男性)组成，较年长者组由363名个体(205名女性和158名 男性)组成，年轻成年人组由22名个体(10名女性和12名男性)组成。

研究方案得到Sant’Orsola-Malpighi大学医学院(Bologna,Italy)的伦 理委员会批准。得到的生物学样品(血清和尿)在代谢组学分析前储存在 -80℃。

临床化学

使用Roche Diagnostics的相应酶学试剂盒，采用自动分析仪(Roche  Diagnostics Hitachi 917,Hitachi Ltd,Tokyo,Japan)，测量了血清总的、高 密度脂蛋白胆固醇(HDL)和甘油三酯浓度。使用Friedewald的公式 (Friedewald WT等,Clinical Chemistry18(6):499–502)，计算了低密度脂蛋 白胆固醇(LDL)浓度。细胞因子，包括小鼠干扰素γ(INFγ)、白介素 1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)、白介素10(IL-10)、白介素12p70(IL-12p70)、 角质细胞来源的趋化因子(KC)和肿瘤坏死因子(TNF)，使用小鼠促炎多重 试剂盒(Meso Scale Discoveries,Gaithersburg,Maryland,USA)测量。根据 制造商的手册，进行测定试验。高灵敏C反应蛋白(CRP)使用灵敏的双重 抗体夹心ELISA以兔抗人CRP和过氧化物酶缀合的兔抗人CRP测量。

用于¹H NMR光谱的样品准备。来自三个老化组的1ml尿样品在冻 干设备(Freeze-Dryer Fisher Scientific)中干燥，并使用含有1mM 3-(三甲基 甲硅烷基)-[2,2,3,3-2H4]-1-丙酸钠(TSP)的580μL磷酸盐缓冲溶液 (KH2PO4,终浓度0.2M)调整至pH6.8，并放入5mm NMR管。在配备 反向5mm低温探头的Bruker Avance III 600MHz光谱仪上以300K (Bruker Biospin,Rheinstetten,Germany)测量代谢谱。对于每个尿样品， 使用脉冲序列(包括标准1H检测，带水峰压制)，记录1H NMR谱。该标 准谱采用4s的驰豫延迟和100ms的混合时间tm获取。获取的1H NMR 谱采用Topspin软件包(2.1版；Bruker Biospin,Rheinstetten,德国)处理， 并参照在δ＝0.0的标准(TSP)。使用内部化合物文库和文献，给峰分派特 定代谢物，并通过在选定的样品上的标准二维NMR谱(JRES,TOCSY, HSQC,HMBC)验证。对于统计学分析，将所有NMR谱转化为在δ0.4-10.0 范围上的12K数据点，并输入MATLAB软件(7.11.0版(R2010b)；The  MathWorks Inc.,Natick,MA)，排除水残基(水δ＝4.7120-4.84)。该谱相对 于规定范围内的所有强度的总和进行标化。

用于Biocrates Life Sciences绝对IDQTM试剂盒分析的样品准备

如先前公布的(-Margl,W.,C.Prehn,R.Bogumil,C.K.Suhre,J.Adamski,用于高通量靶向代谢物组学的组织样品准备和代谢 物提取的程序(Procedure for tissue sample preparation and metabolite  extraction for high-throughput targeted metabolomics)，Metabolomics, 2011，首先网上公布)，在来自所选老化群组的血清样品上使用Biocrates  Life Sciences绝对IDQTM试剂盒。根据制造商的说明，进行孔板准备和 样品施用及提取。将10μl终体积的血清上样至所提供的96孔板上，板包 含同位素标记的内标。在Dionex Ultimate 3000超高压液体色谱(UHPLC) 系统(Dionex AG,Olten,Switzerland)上进行液相色谱，其中所述色谱系统 与安装有TurboV离子源以电喷雾离子化(ESI)模式运行的3200 Q TRAP 质谱仪(AB Sciex；Foster City,CA,USA)偶联。使用梯度流速0-2.4min:30 μl/min,2.4-2.8min:200μl/min,2.9-3min:30μl/min，通过直接输注，注射 样品提取物(20μl)两次(以正和负ESI模式)。MS源参数设置为：脱溶剂温 度(TEM):200℃，高电压：-4500V(ESI-),5500V(ESI+)，气帘(CUR)和 雾化器(GS1和GS2)气体；氮气；20,40,和50psi；分别地，氮气碰撞气 压：5mTorr。以计划的反应监测模式(SRM)进行MS/MS获取，其中对于 本测定试验中筛选的163种代谢物具有优化的去簇电位值(potential  values)。将原始数据文件(Analyst软件,版本1.5.1；AB Sciex,Foster City, CA,USA)输入提供的分析软件MetIQ，以计算代谢物浓度。所有可检测 代谢物的列表可从Biocrates Life Sciences,Austria(http://biocrates.com)获 得。使用同位素稀释技术通过UPLC-ESI-MS/MS进行样品准备和炎症标 志物定量。

基于先前公布的工作(Naga等,PROG.LIPID RESEARCH,2001,40, 199-299)，内部开发了测量一组63个炎症标志物的方法。来自三个年龄组 (n＝15个百岁老人,n＝30个较年长者,n＝50个年轻成年人)的剩余可获得的 生物材料的300μl血清样品，使用24系统，以10μl BHT缓冲 液(丁基化羟基甲苯；79.2mg/ml PBS)匀浆。对于每个样品，总共50μl血清 与5μl内标溶液(0.1ng/μl)混合。添加15μl柠檬酸(1N)酸化混合物。为了 沉淀蛋白质，加入550μl体积的甲醇/乙醇(1:1,v:v)，4℃混合样品15分钟， 之后离心(3500rpm,10min,4℃)。在恒定氮气流下蒸发有机相至干，残余 物用80μl水溶解，之后加入20μl乙腈，然后4℃3500rpm离心1min。 将上清液转移至LC-MS小瓶中，然后分析。通过与串联质谱偶联的液相 色谱(LC-MS/MS)，进行分析。LC在Dionex Ultimate 3000超高压液相色 谱(UPLC)系统(Dionex AG,Olten,Switzerland)上进行。MS检测在以ESI 模式运行的5500Q TRAP质谱仪(AB Sciex；Foster City,CA,USA)上进 行。在Acquity BEH C18柱(2.1x 150mm,1.7μm；Waters,Milford,USA) 上，进行梯度色谱分离。注射体积5μl，柱子维持在50℃。流动相由含有1 ％乙酸(洗脱剂A)和乙腈(洗脱剂B)的水组成，设定在450μl/min的恒定流 速。梯度洗脱开始于20％B，线性增加，在6分钟至50％B，在13分钟从 50％至95％B，在95％B保持3分钟，之后在16.1分钟返回到20％B，重 新平衡柱子另外11分钟。分析物以Analyst软件(版本1.5.1；AB Sciex, Foster City,CA,USA)中提供的计划选择反应监测(scheduled SRM)模式 监测。所有质量变迁(mass transition)和MS源参数在补充数据中提供。 SRM检查窗时间设置为120sec,靶扫描时间0.5sec。使用氮气作为气帘和 脱溶剂气，压力分别为CUR：20,GS1:70,GS2:20(任意单位)。Block源 温度维持在600℃,电压分别为:ISV:-4000V,EP:-10V,CXP:-5V。在样 品分析前，通过测量不同稀释度的标准溶液(0-10ng)，绘出15点的校准曲 线。数据处理使用Analyst软件(版本1.5.1；AB Sciex,Foster City,CA, USA)进行。计算每个分析物相对于其对应内标或替代标志物的峰面积比。 值得提及的是，血清样品中PGJ2,PGF2a,PGE2,PGE1,15-氧代-HETE, 15-脱氧-Δ12,14-PGJ2,6-酮基PGF1a,和5-氧代-ETE低于其检测限，因此 在统计学分析中未加考虑。

多变量数据分析(MVA)

在几种软件环境中进行MVA。因此，对于1H NMR和靶向MS数据， 数据输入和预处理步骤使用写在MATLAB(版本7.11.0,The Mathworks  Inc.,Natick,MA,USA)中的―内部‖程序完成。在NMR数据分析中，使用 SIMCA-P+软件(版本12.0,Umetrics AB,Sweden)，实施OPLS-DA 模型。通过随机森林(Random Forests)，使用‘randomForest’包(A.Liaw and  M.Wiener(2002).Classification and Regression by randomForest.R News 2(3),18--22.)，在R环境中运行(R Development Core Team(2011).R:A  language and environment for statistical computing.R Foundation for  Statistical Computing,Vienna,Austria.ISBN 3-900051-07-0,URL  http://www.R-project.org/.)，分析靶向MS数据。最后，用于验证的单变 量显著性检验也在R中进行。

老化群组的临床特征

表1显示老化群组的身体和生物化学特征。与较年长者相比，BMI (p<0.001),稳态模型评估(HOMA)(p<0.001),总胆固醇(p＝0.001),甘油三 酯(p＝0.004)，HDL(p＝0.001),和LDL(p＝0.04)在百岁老人中较低，而血 清淀粉样蛋白A(A-SAA)蛋白质(p<0.001)和C反应蛋白(CRP)(p<0.001) 在百岁老人中较高。与年轻个体相比，较年长者表现出较高的BMI (p<0.001)，总胆固醇(p<0.001),甘油三酯(p<0.001),LDL(p<0.05),和 CRP(p<0.001)。

来自三个老化组(92名百岁老人,283名较年长者，和21名年轻成年 人)的可得样品的尿600 MHz ¹H-NMR，用于代谢谱分析。为了探索三个年 龄组之间年龄诱导的改变和代谢差异以及最小化无关代谢物变异性的任何 影响，在来自三个时间点的全分辨率NMR数据集合上应用尿NMR谱的 监督式化学计量分析。隐变量正交投影-辨别分析(OPLS-DA)在单位方差尺 度归一化数据(unit variance scaled data)上进行(图2)。百岁老人和年轻成 年人组之间的辨别模型，通过使用13.7％的光谱方差(spectral variance, R²X),提供了1.0的分类词验证错误(表达为ROC曲线下面积, AuROC(Fawcett,T.,An introduction to ROC analysis,Pattern Recogn. Lett.,2006,27:861-874))(表2)。同样地，再次使用13.7％的总X方差， 百岁老人和较年长者组之间的模型产生了具有0.93的AuROC验证错误的 模型(表2)。为了确定与年龄组之间差异相关的代谢物标签，使用了 OPLS-DA模型的第一性预测成分的加载值(loadings)，根据变量的相关 系数进行颜色编码[30](图3)。由此，百岁老人和较年长者个体之间的尿辨 别模型展示相对较高量的苯乙酰谷氨酰胺(PAG)、硫酸对甲酚(PCS)。为了 获得半定量信息，针对这三种代谢物，对原始光谱上的峰面积进行积分， 通过使用Wilcoxon秩和检验验证了具有统计学显著性的差异(图4，表3)。 总之，这些结果显示，肠道微生物高度参与长寿过程。靶向的和定量的 LC-MS代谢组学展示了血清中与老化相关的代谢改变。

为了确定血清中年龄相关的代谢差异，在三个老化组(143名百岁老人, 90名较年长者和20名年轻成年人)的可得生物样品上应用靶向 LC-MS/MS代谢组学方法。使用随机森林(RF^TM)(Breiman,L.,Random  Forests,Machine Learning,2001,45:5-32)，在160种代谢物的预处理半定 量数据上，进行多变量数据分析，其中所述代谢物包括氨基酸、糖、酰基- 肉毒碱、鞘脂类和甘油磷脂类。使用在RF^TM中实行的变量重要性特征，可 以确定更好地区分三个老化组的代谢物标签。为了评价标签的每个组分的 各自辨别能力，在这些年龄组中进行Wilcoxon秩和检验(表4中列出了所 有显著调节的代谢物)。尽管甘油磷脂类和鞘脂类的总体浓度随着脂肪酸组 成而增加和减少，但三种一致倾向是明显的：随着年龄增加或减少(统计学 有效)的化合物集合，例如减少浓度的溶血磷脂酰胆碱(LPC 18:2,LPC 20:4)，增加水平的PC32:0和增加浓度的鞘磷脂(SM 24:1,SM 16:0)；(ii)仅 特异于百岁老人的化合物集合，在较年长者和年轻个体之间无统计学改变, 如鞘磷脂和特定甘油磷酸脂类(SM-OH 22:1,LPC 18:0,SM 24:0,PC-O 34:3,PC-O 36:4,PC-O 40:1,PC 36:2)的减少和特定甘油磷酸脂类(PC-O 32:1,PC-O 34:1)的增加。

此外，在3个老化组的剩余可得血清样品(12名百岁老人,37名较年 长者和18名年轻成年人)上，使用靶向LC-MS/MS方法，以调查类二十烷 酸合成的浓度改变。在此，在定量数据上的RF^TM显示三个年龄组之间的统 计学相关改变(图6)。通过Wilcoxon秩和检验评价年龄组之间的统计学显 著性(增补表5中列出了所有显著调节的代谢物)。百岁老人展示出较低浓 度的11,12-二羟基-二十碳三烯酸(11,12-DiHETrE)、9-羟基-十八碳二烯酸 (9-HODE)和9-氧代-十八碳二烯酸(9-氧代-HODE)，以及同时增加浓度的 15-羟基-二十碳四烯酸(15-HETE)和白三烯E4(LTE4)。与较年长者相比， 百岁老人中二十碳五烯酸(EPA)的水平降低。此外，在百岁老人和较年长 者之间进行成对MRC分析以最大化两个年龄组中的变化，展示出在百岁 老人中增加血清浓度水平的8,9-环氧二十碳三烯酸(8,9-EET)和白三烯B4 (LTB4)。

本发明还提供下述编号段落中公开的其它实施方案：

1.诊断允许延迟和/或避免老化相关慢性炎性病症的生活方式的方法， 包括

-从受试者获得血清样品,

-确定样品中9-氧代-HODE的水平，和

-比较受试者的9-氧代-HODE水平与预定参考值,

其中预定参考值基于对照群体中的平均血清9-氧代-HODE水平,且

其中与预定参考值相比，样品中降低的血清9-氧代-HODE水平指示 增加的延迟和/或避免老化相关慢性炎性病症的可能性。

2.诊断允许延迟和/或避免老化相关慢性炎性病症的生活方式的方法, 包括

-从受试者获得血清样品，

-确定样品中PC-O 40:1的水平，和

-比较受试者的PC-O 40:1水平与预定参考值,

其中预定参考值基于对照群体中平均血清PC-O 40:1水平，且

其中与预定参考值相比，样品中较低血清PC-O 40:1水平指示增加的 延迟和/或避免老化相关慢性炎性病症的可能性。

3.段落1或段落2的方法，还包括

-确定PC-O 40:1,SM-OH 22:1,LPC 18:0,SM 24:0,PC-O 34:1, 9-HODE,9-氧代-HODE,或LTE4中的至少一种在样品中的水平，和

-将受试者中PC-O 40:1,SM-OH 22:1,LPC 18:0,SM 24:0,PC-O 34:1,9-HODE,9-氧代-HODE,或LTE4之至少一种的水平与预定参考值 比较，

其中预定参考值基于对照群体中的平均血清PC-O 40:1,SM-OH 22:1, LPC 18:0,SM 24:0,PC-O 34:1,9-HODE,9-氧代-HODE或LTE4水平，且

其中与预定参考值相比，样品中降低的血清PC-O 40:1,SM-OH 22:1, LPC 18:0,SM 24:0,PC-O 40:1,9-HODE,和/或9-氧代-HODE水平指示增 加的延迟和/或避免老化相关慢性炎性病症的可能性，和/或

其中与预定参考值相比，样品中增加的血清LTE4，PC-O 34:1水平指 示增加的延迟和/或避免老化相关慢性炎性病症的可能性。

4.段落1至3之一的方法，其中还通过与先已获得的参考值比较，评 价生物标志物PC-O 32:1,15-HpETE,LTB4,8,9 EpETre中的一个或多个 在血清中是否增加，和/或生物标志物PC-O 34:3,PC-O 36:4,PC 36:2, 11,12-DiHETre中的一个或多个在血清中是否降低，以增加诊断的准确性。

5.用于诊断允许延迟和/或避免老化相关慢性炎性病症的生活方式的 体外方法，包括

-从受试者获得尿样品,

-确定样品中硫酸对甲酚(PCS)的水平,和

-比较受试者的PCS水平与预定参考值,

其中预定参考值基于对照群体中的平均尿PCS水平,且

其中与预定参考值相比，样品中升高的尿PCS水平指示增加的延迟和 /或避免老化相关慢性炎性病症的可能性。

6.段落5的方法，还包括

-确定样品中苯乙酰谷氨酰胺(PAG)的水平，和

-比较受试者PAG水平与预定参考值，

其中预定参考值基于对照群体中的平均尿PAG水平,且

其中与预定参考值相比，样品中升高的尿PCS和PAG水平指示增加 的延迟和/或避免老化相关慢性炎性病症的可能性。

7.用于诊断允许延迟和/或避免老化相关慢性炎性病症的生活方式的 非侵入式方法，包括

-从受试者获得尿样品，

-确定样品中苯乙酰谷氨酰胺(PAG)的水平，和

-比较受试者的苯乙酰谷氨酰胺(PAG)水平与预定参考值，

其中预定参考值基于对照群体中的平均尿PAG水平，且

其中与预定参考值相比，样品中升高的尿PAG水平指示增加的延迟 和/或避免老化相关慢性炎性病症的可能性。

8.段落7的方法，还包括

-确定样品中硫酸对甲酚(PCS)的水平，和

-比较受试者的PCS水平与预定参考值,

其中预定参考值基于对照群体中的平均尿PCS水平，且

其中与预定参考值相比，样品中升高的尿PAG和PCS水平指示增加 的延迟和/或避免老化相关慢性炎性病症的可能性。

9.段落1至8之一的方法，用于诊断允许健康老化的生活方式。

10.段落1至9之一的方法，用于诊断长寿。

11.段落1至10之一的方法，用于诊断更健康的肠道微生物菌群-宿 主相互作用。

12.段落11的方法，其中在较年长者中诊断更健康的肠道微生物菌 群-宿主相互作用。

13.段落1至12之一的方法，用于诊断更健康的生活方式，其中预 定参考值基于从生活方式改变前的受试者获得的血清或尿水平。

14.段落13的方法，其中生活方式的改变是饮食的改变。

15.段落14的方法，其中饮食的改变是使用先前未用过的或以不同 量用过的至少一种营养产品。

16.段落14或15的方法，用于检查新的营养方案的有效性。

17.段落1至16之一的方法，其中通过¹H-NMR和/或质谱在样品中 及在参照中确定生物标志物的水平。

18.段落1至17之一的方法，用于诊断更健康的生活方式，其中预 定参考平均值为

2μM的1-O-烷基-2-酰基甘油磷酸胆碱(PC-O)32:1,

7.80μM的1-O-烷基-2-酰基甘油磷酸胆碱(PC-O)34:1,

1.25μg/100μl血清的15-羟基-二十碳四烯酸(15-HpETE),

0.013μg/100μl血清的白三烯E4(LTE4),

0.020μg/100μl血清的白三烯B4(4LTB),和/或

0.070μg/100μl血清的8,9-环氧二十碳三烯酸(8,9 EpETre)

16.07μM的羟基-鞘磷脂(SM-OH)22:1,

52.00μM的溶血磷脂酰胆碱(LPC)18:0,

25.00μM的鞘磷脂(SM)24:0,

5.07μM的1-O-烷基-2-酰基甘油磷酸胆碱(PC-O)34:3,

14.30μM的1-O-烷基-2-酰基甘油磷酸胆碱(PC-O)36:4,

1.41μM的1-O-烷基-2-酰基甘油磷酸胆碱(PC-O)40:1,

10.00μM的磷脂酰胆碱(PC)36:2,

0.34μg/100μl血清的羟基十八碳二烯酸(9-HODE),

0.043μg/100μl的9-氧代-十八碳二烯酸(9-氧代-HODE),和/或

0.017μg/100μl血清的11,12-环氧二十碳三烯酸(11,12-DiHETre).

19.段落1至18之任何的方法，还包括：

-从受试者获得尿样品，

-确定样品中苯乙酰谷氨酰胺(PAG)和/或硫酸对甲酚(PCS)的水平，和

-比较受试者的苯乙酰谷氨酰胺(PAG)和/或PCS水平与预定参考值，

其中预定参考值基于对照群体中的平均尿PAG和/或PCS水平，且其 中与预定参考值相比，样品中升高的尿PAG和/或PCS水平指示增加的延 迟和/或避免老化相关慢性炎性病症的可能性。

20.用于诊断允许延迟和/或避免老化相关慢性炎性病症的生活方式 的生物标志物，其中所述生物标志物是9-氧代-HODE。

21.用于诊断允许延迟和/或避免老化相关慢性炎性病症的生活方式 的生物标志物，其中所述生物标志物是PC-O 40:1。

22.段落20或21的生物标志物，其中在血清中检测所述生物标志物。

23.用于诊断允许延迟和/或避免老化相关慢性炎性病症的生活方式 的生物标志物，其中所述生物标志物是苯乙酰谷氨酰胺(PAG)。

24.用于诊断允许延迟和/或避免老化相关慢性炎性病症的生活方式 的生物标志物，其中所述生物标志物是硫酸对甲酚(PCS)。

25.段落23或24的生物标志物，其中在尿中检测所述生物标志物。

26.用于诊断(i)促进老化相关慢性炎性病症发生的生活方式,(ii)可 能防止健康老化的生活方式,(iii)寿命缩短的风险，和/或(iv)较不健康的 肠道微生物菌群-宿主相互作用的方法,包括

-从受试者获得血清样品,

-确定样品中9-氧代-HODE和/或PC-O 40:1的水平和

-比较受试者的9-氧代-HODE和/或PC-O 40:1水平与预定参考值,

其中预定参考值基于对照群体中的平均血清9-氧代-HODE和/或 PC-O 40:1水平，且

其中与预定参考值相比，样品中增加的血清9-氧代-HODE和/或PC-O 40:1水平指示(i)促进老化相关慢性炎性病症发生的生活方式,(ii)可能 防止健康老化的生活方式,(iii)增加的寿命缩短的风险，和/或(iv)较不健 康的肠道微生物菌群-宿主相互作用。

27.用于诊断(i)促进老化相关慢性炎性病症发生的生活方式,(ii)可 能防止健康老化的生活方式,(iii)寿命缩短的风险，和/或(iv)较不健康的 肠道微生物菌群-宿主相互作用的方法，包括

-从受试者获得尿样品，

-确定样品中PAG和/或PCS的水平，和

-比较受试者的PAG和/或PCS水平和预定参考值,

其中预定参考值基于对照群体中的平均尿PAG和/或PCS水平,且

其中与预定参考值相比，样品中较低的尿PAG和/或PCS水平指示(i) 促进老化相关慢性炎性病症发生的生活方式,(ii)可能防止健康老化的生 活方式,(iii)增加的寿命缩短的风险，和/或(iv)较不健康的肠道微生物菌 群-宿主相互作用。

28.用于(i)延迟、避免和/或防止老化相关慢性炎性病症发生，(ii)促 进健康老化,(iii)促进长寿,(iv)降低寿命缩短的风险,(v)促进更健康的 肠道微生物菌群-宿主相互作用，和/或(vi)防止较不健康的肠道微生物菌群- 宿主相互作用的方法，包括：

(a)实施段落26或27所述的诊断方法；和

(b)如果受试者具有(i)增加的老化相关慢性炎性病症发生的可能性，(ii) 可能防止健康老化的生活方式，(iii)增加的寿命缩短的风险，和/或(iv)较 不健康的肠道微生物菌群-宿主相互作用，则改变受试者的生活方式。

29.段落28的方法，其中受试者的生活方式改变包括饮食改变。

30.段落29的方法，其中饮食的改变包括向受试者施用至少一种营 养产品，其中所述营养产品对健康老化和/或避免老化相关慢性炎性病症有 作用。

表1:

表2：

表3：

表4

表5