一种气虚型胃肠功能障碍小鼠动物模型的构建方法

摘要

本发明公开了一种气虚型胃肠功能障碍小鼠动物模型的构建方法，所述方法为：用过饱和芒硝水溶液灌胃小鼠10-15天，再灌胃四君子汤7-10天，当小鼠出现下列第(1)、(4)和(6)或多种症状时，气虚型胃肠功能障碍的小鼠动物模型构建成功：(1)体重减少，小鼠毛色变灰暗、无光泽，(2)进食量减少，(3)粪便变稀，(4)小肠粘膜损伤评分变差，(5)胃体积增大以及(6)胃肠碳粉推进指数下降；气虚型胃肠功能障碍的小鼠动物模型构建成功；本发明提供一种稳定性高、易于推广、重复性好、经济实用的气虚型胃肠功能障碍小鼠动物模型，为中医药治疗胃肠功能障碍的临床前期研究提供实验基础。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种气虚型胃肠功能障碍动物模型的建立，通过给ICR 小鼠灌服芒硝过饱和溶液以达到让小鼠产生腹胀、腹泻、体重减轻等中医 气虚临床表现及胃肠动力减退、胃肠黏膜损伤等西医胃肠功能障碍的临床 表现和病理改变，为研发治疗胃肠功能障碍新物提供一个稳定、可靠的动 物模型。

(二)背景技术

胃肠功能障碍是指机体在受到创伤、感染、失血等严重损害时，胃肠 道出现的严重应激反应，表现为各种致病因素导致胃肠黏膜受损及肠道免 疫系统功能下降，肠道屏障功能被破坏，肠道内的细菌与细菌毒素转移到 肠外(即发生细菌移位)。

胃肠功能障碍的病因非常广，近年来有学者对胃肠功能障碍提出了新 的分类：Ⅰ型胃肠功能障碍多指腹部手术后自限性胃肠功能障碍；Ⅱ型胃 肠功能障碍是指危重病人的胃肠功能障碍，这些患者除行小肠广泛切除 外，还并发有感染、代谢和营养并发症；Ⅲ型胃肠功能障碍是指需要长期 甚至终身营养支持的慢性胃肠功能障碍。

通过长期的临床观察发现，很多危重症患者在无明显的创伤、感染、 出血等应激情况下却也出现了严重的胃肠功能障碍，常表现为腹胀、腹泻 和严重营养不良，这类患者符合胃肠功能障碍临床表现但很难归类到以上 三型胃肠功能障碍，西医学很难阐明其发病机理。而中医学却能很好解释 这一理论：《黄帝内经·素问·宣明·五气篇》有云“久卧伤气”；《素问·平人 气象论》又云“人以水谷为本”。重症患者在抢救及恢复过程中往往需要 长期卧床，致使气机失调；这类病人由于病情危重，无法自主进食而依靠 全胃肠外营养，致使丧失了脾胃“后天之本——水谷精微”的濡养，导致 气血本源缺失，进一步导致了脾胃气虚，进而影响小肠的泌清别浊和大肠 通降功能失常，出现腹胀、腹泻等症状，同时脾的运化功能减退，气血生 化无缘，气血虚亏，五脏六腑失去濡养，导致其他脏器功能衰竭，这与胃 肠功能障碍的临床表现相一致。所以大部分此类胃肠功能障碍患者在症型 上符合中医气虚的临床表现，疾病上符合“痞满”和“泄泻”病范畴。

国内没有涉及胃肠功能障碍中医症型动物模型实验研究，因此本发明 将对中医药在胃肠功能衰竭疾病领域治疗优势的发挥起到很大的促进作 用。

(三)发明内容

本发明目的在于通过芒硝过饱和溶液灌胃建立一种气虚型胃肠功能 障碍的小鼠动物模型，为评价治疗胃肠功能障碍药物的疗效提供一种可靠 的动物模型平台。

本发明采用的技术方案是：

本发明涉及一种气虚型胃肠功能障碍小鼠动物模型的构建方法，所述 方法为：用过饱和芒硝水溶液灌胃小鼠10-15天，再灌胃四君子汤7-10 天，当小鼠出现下列第(1)、(4)和(6)或多种症状时，气虚型胃肠功 能障碍的小鼠动物模型构建成功：(1)体重减少，小鼠毛色变灰暗、无光 泽，(2)进食量减少，(3)粪便变稀，(4)小肠粘膜损伤评分变差，(5) 胃体积增大以及(6)胃肠碳粉推进指数下降；所述过饱和芒硝水溶液的 用量为0.1-0.3ml/10g体重，所述四君子汤用量为0.1ml/10g体重；所述四 君子汤为党参、白术、茯苓和炙甘草按重量比3:3:3:2混合后，加水煎煮 而成。上述(1)-(6)症状中出现(1)、(4)和(6)或者还出现其他3 种症状中的一种或多种，则表明模型构建成功。

本发明所述小鼠为ICR小鼠，优选所述小鼠为健康成年ICR小鼠， 体重18-22g。

本发明所述过饱和芒硝水溶液的用量优选为0.3ml/10g体重。

本发明所述四君子汤用量为0.1ml/10g体重，所述四君子汤的生药量 为500mg/ml。

本发明的有益效果主要体现在：现有盲肠结扎穿刺法大鼠脓毒症胃肠 功能衰竭模型存在造模不稳定，致死率高，且无法观测治疗效果等缺点， 本发明提供一种稳定性高、易于推广、重复性好、经济实用的气虚型胃肠 功能障碍小鼠动物模型，为中医药治疗胃肠功能障碍的临床前期研究提供 实验基础。

(四)附图说明

图1为小肠组织标本HE染色的光学显微镜图，其中A为对照组(100 倍)，B为对照组(400倍)，C为造模安慰剂组(100倍)，D为造模安慰 剂组(400倍)，E为模型组(100倍)，F为模型组(400倍)，G为自愈 组(100倍)，H为自愈组(400倍)，I为四君子汤组(100倍)，J为四君 子汤组(400倍)。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此：

本发明实施例所述党参、白术、茯苓、炙甘草均采用药学2010版中 国药典制备。

实施例1:药物的制备

(1)四君子汤：党参9g、白术9g、茯苓9g、炙甘草6g

各生药均用清水浸泡30分钟，由浙江省中医院中药房煎熬至每mL 含生药材500mg。按照体表系数换算法，与人临床剂量等效的小鼠剂量 为42.9mg/10g·d(计算公式为：小鼠用量g/kg·d＝人一天剂量*0.0026/0.02)。

(2)芒硝过饱和水溶液：将芒硝(十水合硫酸钠Na₂SO₄·10H₂O)粉 碎后过20目筛网，逐渐加入到室温(约20℃)蒸馏水中，用磁力搅拌器 搅拌，直到出现芒硝结晶体析出，再搅拌15分钟，析出的结晶体不再溶 解，此时的溶液即为芒硝过饱和水溶液。

实施例2:动物模型的构建及验证

1.动物分组

健康成年雄性ICR小鼠120只，体重18-22g，根据数字随机表随机 选取24只为对照组，24只为造模安慰剂组，72只为实验组。实验组小鼠 再随机分成模型组、自愈组、四君子汤组各24只。

2.分组给药方法

对照组给予小鼠饲料正常饮食10天，造模安慰剂组正常饮食的同时 给予生理盐水0.3ml/10g的剂量灌胃10天。实验组小鼠正常饮食的同时 给予芒硝过饱和水溶液0.3ml/10g的剂量灌胃10天。10天后，对照组、 造模安慰剂组、模型组的部分小鼠立即处死进行(一般情况观察，平均稀 便级，体重变化增值曲线，胃体积，碳粉推进指数，显微镜下肠上皮损伤 情况大体及chiu评分等指标检测检测，剩余小鼠进行实验；四君子汤组 小鼠继续正常饮食的同时给予四君子汤0.1ml/10g灌胃7天，进行检测(一 般情况观察，平均稀便级，体重变化增值曲线，胃体积，碳粉推进指数， 显微镜下肠上皮损伤情况大体及chiu评分等指标检测)；自愈组小鼠继续 正常饮食的同时给予0.1ml/10g生理盐水灌胃7天，进行检测(一般情况 观察，平均稀便级，体重变化增值曲线，胃体积，碳粉推进指数，显微镜 下肠上皮损伤情况大体及chiu评分等指标检测)。

3.一般情况观察

对照组与造模安慰剂组小鼠毛色光亮、爪尾红润、食欲正常，粪便成 形，纺锤状，含水量适中，未出现异常特征，无死亡。实验组小鼠体毛光 亮度减退、毛色偏黄、爪尾苍白、食欲明显减退，粪便稀软糊状，排泄物 异味重，活动减少，精神出现不同程度的萎靡。经历7天恢复期后，自愈 组小鼠体毛仍无光泽、毛色发黄、爪尾苍白、进食量略有增加、粪便质软 不成形、静卧少动。四君子汤组小鼠体毛光亮度仍不满意、进食量较自愈 组明显增多、粪便成形、活动正常。

4.平均稀便级

(1)小鼠稀便级表示稀便的程度，反映小鼠消化吸收能力，以稀便 污染滤纸形成污迹的直径大小定级。本实验采用平均稀便级(见表1)

表1平均稀便级分级标准

级数 0 1 2 3 4 5 6 7 污迹直径(cm) 0 0-0.9 1.0-1.9 2.0-2.9 3.0-3.9 4.0-4.9 5.0-5.9 6.0-6.9

注:平均稀便级的计算方式M＝(X1+X2+X3+......+Xn) /(1+2+3+......n)；Xn表示某个大便的稀便级，n表示待检测大便份数。

(2)结果

从平均稀便级上看，①实验组较对照组的平均稀便级别显著升高，差 异具有统计学意义(P<0.01)；②实验组较造模安慰剂组的平均稀便级别 显著升高，差异具有统计学意义(P<0.01)；③经历7天恢复期后，自愈 组和四君子汤组较模型组的平均稀便级别明显降低，差异具有统计学意义 (均P<0.05)。见表2。

表2.各组小鼠平均稀便级的变化(n＝24)

注：★：与对照组比较，p<0.01；△：与造模安慰剂组比较，P<0.01； #：与模型剂组比较，p<0.05

5.体重增值变化曲线

(1)每天上午10点实验前测量小鼠体重，每只小鼠测量三次，取平 均值记录。

(2)从体重增值变化上看，①造模10天后，模型组、自愈组、四君 子汤组小鼠体重较对照组均有明显降低，差异具有统计学意义(均 P<0.01)；②模型组小鼠体重较造模安慰剂组降低，存在统计学意义 (P<0.01)；③17天时，四君子汤组小鼠体重较自愈组增长更多，差异具 有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3.各组小鼠体重的变化(n＝24)

注：★：与对照组比较，p<0.01；△：与自愈组比较，p<0.05；#： 与造模安慰剂组比较，P<0.01

6.胃体积测量与碳粉推进指数

(1)胃体积：处死当天小鼠禁食不禁水12h后颈椎脱臼处死，剖腹， 止血钳夹闭食管下段与胃连接处，止血钳上方离断食道，离断胃与十二指 肠，(因胃上口封闭，下口会自动挛缩闭合，胃内容物不会流出)。将取出 的胃体置于盛有生理盐水的10ml量筒，测量体积大小。

(2)碳粉推进指数测定：小鼠禁食不禁水12h后，碳粉(0.3ml/10g 小鼠)灌胃，30min后将小鼠颈椎脱臼处死，剖腹取出全部胃肠道，测 量碳粉前端至幽门括约肌距离(cm)和幽门括约肌至小肠末端距离(cm)。计 算无张力下胃肠碳粉推进指数＝碳粉前端至幽门括约肌(cm)/幽门括约肌 至小肠末端距离(cm)x100％。

胃体积和碳粉推进指数测定反应胃肠胀气情，侧面反应胃肠动力指 标。

(3)结果

从胃体积看，①模型组、自愈组、四君子汤组小鼠胃体积较对照组明 显增大，差异具有统计学意义(均P<0.01)；②自愈组与四君子汤组小鼠 经历了7天恢复之后，胃体积较模型组减小，差异具有统计学意义(均 P<0.01)；③四君子汤组较自愈组之间没有存在差异，无统计学意义 (P>0.05)。见表4。

表4.各实验组小鼠胃体积(n＝8)

注：★与对照组相比较，p<0.01；△与模型组相比较，p<0.01；# 与自愈组相比较，p>0.05

从胃肠碳粉推进指数看，①模型组、自愈组、四君子汤组小鼠指数较 对照组均降低非常显著，差异具有统计学意义(均p<0.01)；②自愈组和 四君子汤组小鼠指数较模型组相比明显升高，差异具有统计学意义 (p<0.01)；③自愈组与四君子汤组之间没有差异，差异无统计学意义 (p>0.05)。见表5。

表5.各组小鼠胃肠碳粉推进指数(n＝8)

注：★：与对照组比较，p<0.01；△：与模型组相比较，P<0.01；

7.小肠粘膜损伤评分

(1)所有小鼠禁食不禁水12h后颈椎脱臼处死，取小肠组织标本(距 离回盲部约5cm处留取小肠组织)，10％甲醛固定24h后，行HE染色。 利用光学显微镜观察各段肠黏膜的肠绒毛、肠腺、肠上皮细胞的变化，见 图1所示。

(2)小肠黏膜损伤Chiu’s分级评分(见表6)

表6 Chiu’s分级(from:Arch Surg Vol 101,Oct 1970)评分标准

(3)结果

Chiu’s分级评分结果显示：①模型组小肠黏膜损伤程度较对照组明显 增高，差异存在统计学意义(p<0.01)；②造模安慰剂组、自愈组、四君 子汤小肠黏膜损伤程度较模型组均明显降低，差异有统计学意义(均 p<0.01)；③自愈组损伤程度较四君子汤组增高，差异存在统计学意义 (p<0.05)。见表7。

表7.各组小肠黏膜损伤Chiu’s分级评分(n＝8)

注：★：与对照组比较，p<0.01；△：与模型组比较，P<0.01；#： 与自愈组比较p<0.05；

按Chiu’s分级评分标准对各组小鼠肠黏膜损伤程度进行评分，对照组 肠黏膜组织结构完整，绒毛清晰，评分为0分；造模安慰剂组可见来自固 有膜的肠黏膜上皮抬高以及肠上皮下间隙的扩张，评分为2级；模型组肠 黏膜损伤最为严重，病理可见固有膜蜕变、出血及溃疡形成，评分为5分。 经历了7天的恢复后，自愈组损伤程度有所减轻，大片肠黏膜上皮抬高， 绒毛向两侧倒伏，部分绒毛顶端脱落，评分为3分；四君子汤组肠粘膜损 伤程度明显减轻，仅可见来自固有膜的肠黏膜上皮抬高以及肠上皮下间隙 的扩张，评分为2分。