一株齐整小核菌及其在发酵生产硬葡聚糖中的应用

摘要

本发明公开了一株适用于工业生产硬葡聚糖的齐整小核菌，该菌株名为齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)SCL2010，菌株已于2014年7月6日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO.M2014325。本发明还公开了所述齐整小核菌在发酵生产硬葡聚糖中的应用，通过采用分阶段控制发酵条件工艺，本发明实现了菌体快速生长与高效产糖的完美结合，保证的发酵过程的稳定运行，使发酵产率、生产强度可分别达到35g/L、0.44g/L/h，收率显著高于现有工艺，所制备的产品粘度高，稳定性良好，粘度变化小，具有良好的应用性能。

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物多糖硬葡聚糖生产菌株，尤其涉及一株齐整小核菌及其在发 酵生产硬葡聚糖中的应用。

背景技术

硬葡聚糖(也称为小核菌多糖或小核菌胶)是由丝状真菌产生的非离子水溶性同多 糖。其分子是由含有β-D-(1,6)-葡萄糖残基侧链的线性β-D-(1,3)-葡萄糖残基链组 成。硬葡聚糖的显著特性是良好的流变性与稳定性，其广泛的在pH(1～12)、矿化度(0～200, 000ppm)和温度(130℃)均具有良好的稳定性。

硬葡聚糖在食品、医药、化妆品、石油等工业都具有良好的应用价值。目前在国际 市场中，硬葡聚糖作为保湿、抗炎、增稠成分普遍应用在化妆品中，常被国际知名化妆 品品牌所采用。硬葡聚糖还能够提高原油采收率，在当前普遍进入三次、四次采油的趋 势下，其具有广阔的应用前景。

由于硬葡聚糖的发酵产率不高导致其价格居高不下，这严重限制了其市场(特别是 石油工业领域)的开发拓展。因此，研究如何提高硬葡聚糖的产量是主要关注点。目前 报道的关于硬葡聚糖发酵生产的研究多集中于发酵培养基的优化，但其仍然存在发酵时 间长(96h以上)，产率低(20g/l左右)，生产成本较高的缺陷。虽然已公开的关于提高 硬葡聚糖发酵生产的国内外专利CN201110006769.0、CN201310283916.8和EP 1417325 A2产率最高可达32g/L，但其工艺控制复杂，且稳定性不足。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决问题是提供一株具有独特发酵规律的适用于工 业化的硬葡聚糖高效发酵生产菌种——齐整小核菌及其在发酵生产硬葡聚糖中的应用。

本发明所述适用于工业生产硬葡聚糖的齐整小核菌，其特征在于：该菌株名为齐整 小核菌(Sclerotium rolfsii)SCL2010，菌株已于2014年7月6日保藏在中国典型培养物 保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC，地址：中国.武汉.武 汉大学)，其保藏编号为CCTCC NO.M2014325。

上述齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)SCL2010菌落形态及显微特征如下：

所述菌在PDA培养基上生长快，28℃条件下培养3天，菌丝长满培养皿，菌丝茂盛， 棉絮状，气生，白色。

菌丝壁薄，直径2.5～6.5μm，分支，具有锁状联合。

菌落边缘产生菌核，初为乳白色，后逐渐变为浅黄色至棕褐色或黑色，球形或卵圆 形，大小0.5～2mm，表面光滑具光泽。

对本发明所述齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)SCL2010测定18S rDNA的基因序列 (PCR通用引物为NS1F和NS8R)的结果显示，其基因序列长度为1694bp，具体核苷 酸序列如SEQ ID NO.1所示。

其中：所述PCR通用引物NS1F和NS8R序列如下：

NS1F：5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’

NS8R：5’-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3’

本发明所述的齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)SCL2010菌种选育的基本方法是：从 山东省潍坊市寿光市、高密市、临朐县感染白绢病的马铃薯植株和块茎上收集白绢病菌 核，以菌核为分离材料，无菌条件下将菌核接种于PDA固体培养基上培养，待菌核萌发 菌丝长出后，进行分离纯化培养，转接于PDA斜面培养基上保存。

将分离纯化转接于PDA培养基上的菌丝分别转接于新的PDA平板上，28℃培养连 续观察，待菌丝生长铺满平板并结出菌核，直至菌核变色成熟为止，记录菌丝生长情况、 结核及菌核变化情况，结合显微镜观察确定其中的齐整小核菌菌株并进行菌株编号；将 已确定为齐整小核菌的菌核转接与PDA平板上，观察记录菌核萌发情况、萌发率、菌丝 生长情况、结菌核时间和菌核量。选取菌核萌发快、萌发率≥75％、结菌核时间快(72h 左右)、菌核量多的菌株进行硬葡聚糖摇瓶发酵实验，通过大量实验，最终获得高产硬葡 聚糖的齐整小核菌，命名为齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)SCL2010菌株，该菌株菌核 萌发率高达80％，发酵最终pH≤2.5，产率可达到35g/L，传代实验表明该菌株遗传稳定 性良好。

本发明所述齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)SCL2010在发酵生产硬葡聚糖中的应用。

为便于发酵过程顺利实现，降低生产成本，应用方法优选的技术方案是：将齐整小 核菌(Sclerotium rolfsii)SCL2010经固体斜面和种子液扩大培养后，按照发酵培养液质 量百分数4～10％的量接种于发酵培养液里，分阶段控制发酵条件，发酵获得硬葡聚糖。

其中，所述应用方法涉及的具体步骤顺序如下：

(1)硬葡聚糖生产菌种齐整小核菌茄形瓶斜面固体培养：

将齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)SCL2010的成熟菌核接种于茄形瓶斜面固体培养 基上，30～34℃静置培养5～7天，获得大量成熟齐整小核菌，用于发酵生产种子液制备。

上述斜面固体PDA组成(单位：g/L)：马铃薯200(经水煮烂后过滤)，葡萄糖20， 琼脂20。

(2)硬葡聚糖发酵生产种子液制备：

将培养成熟的齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)SCL2010用无菌生理盐水洗一下，按 常规量接种于种子培养液里，调整种子培养液的pH至4～5，30～34℃进行通气搅拌培养 30～36h，获得含大量菌丝体的硬葡聚糖发酵生产种子液。

其中：所述的种子培养液由如下质量分数的组分组成(单位：g/L)：

葡萄糖：10～20，酵母膏3～6，硝酸钠2～3，磷酸氢二钾2～5，硫酸镁1～3，聚醚消泡 剂0.2～1，其他为软化水，pH 4～5。

(3)硬葡聚糖发酵生产及分阶段控制发酵条件工艺：

将培养成熟的齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)SCL2010发酵生产种子液按常规量接 种到含有碳源的发酵培养液中，调整培养液的pH，进行通气搅拌发酵培养，通过分阶段 控制发酵条件，生产获得硬葡聚糖。

其中，所述发酵培养液由如下质量百分数的组分组成(单位：g/L)：

碳源：45～60，豆粕粉1～3，玉米浆0.5～2，硝酸钠1～3，磷酸氢二钾1～2，硫酸镁0. 5～1，聚醚消泡剂0.2～1，其他为软化水，pH 4～5。培养液中的碳源选自淀粉、蔗糖和葡 萄糖中的一种或其任意重量比例的混合物。

由于发酵过程分为菌体生长期与产糖期，而且随着发酵进行，发酵液粘度快速上升， 因此优选的技术方案是在不同的发酵阶段进行培养温度、pH、通风比、溶解氧(DO)的 阶段性控制，以有效提高发酵产率。优选的发酵控制条件是：

0～24h：温度30～34℃、pH 4.0～5.0、通风量0.1～0.4v.v.m.、压力为0.04～0.05MPa、溶 解氧30％～50％。

24h～放罐(60～72h)：温度26～28℃、pH 2.5、通风量0.5～2.0v.v.m.、压力为 0.04～0.05MPa、溶解氧5％～15％。

应用上述方法制备的硬葡聚糖性能指标检测结果如下：

(1)产率测定

根据文献中一般采用的方法如下：

A.所用仪器：恒温箱、分析天平(0.001g)。

B.测定方法：准确量取一定体积的发酵液，调节pH至7.0，采用90％～95％的乙醇 沉淀多糖，过滤后再用90％～95％的乙醇洗涤一遍，滤干后置于105℃恒温箱里干燥至恒 重，降温后称重。

产率＝样品干重/发酵液体积×100％

C.检测结果：采用齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)SCL2010及以上发酵方法所得硬 葡聚糖的产率为32～35g/L，高于现有研究报道。

D.文献：刘如林，衡斌，赵大健、周与良.由淀粉生产小核菌葡聚糖的研究[J]南开大 学学报(自然科学)，1990，4:15-22。

Y.Wang，B.McNeil.Effect of temperature on scleroglucan synthesis and organic acid  production by Sclerotium glucanicum[J].Enzyme and Microbial Technology，1995，17: 893-899.

Shrikant A.Survase，Parag S.Saudagar，Rekha S.Singhal.Enhanced production of  scleroglucan by Sclerotium rolfsii MTCC2156by use of metabolic precursors[J].Bioresource  Technology，2007，98:410-415.

(2)产品粘度测定

(1)所用仪器：NDJ-1型旋转粘度计，3#转子，60r/min，20℃测定。

(2)测定方法：准确称取采用本发明方法制备的硬葡聚糖产品2.0g溶于200.0mL 蒸馏水中，充分溶胀60min后，采用高剪切均质机均质3～5min，静置30min进行粘度测 定。

(3)测定结果：采用齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)SCL2010及以上发酵方法所得 硬葡聚糖产品1％(w/v)的粘度在800mPa.s以上。

本发明所取得的实质性特点和显著的技术效果在于：

1、本发明公开了一株能够发酵生产硬葡聚糖的齐整小核菌，即齐整小核菌(Sclerotium  rolfsii)SCL2010CCTCC No.M2014325。

2、采用本发明所述齐整小核菌及其应用方法发酵生产硬葡聚糖，收率显著高于现有 工艺，所制备的产品粘度高，稳定性良好，粘度变化小，具有良好的应用性能。

3、本发明发酵培养液组分采用淀粉、蔗糖和葡萄糖为基础碳源，价格便宜；氮源则 采用豆粕粉、玉米浆等常见有机氮源，操作简单、安全，价格低廉。

4、本发明按照发酵过程中不同阶段的功能特点采用分阶段控制发酵条件(尤其是温 度、pH和溶解氧的控制)工艺，实现了菌体快速生长与高效产糖的完美结合，保证的发 酵过程的稳定运行。

附图说明

图1：本发明所述齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)SCL2010平板生长图。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行完整详细地描述，显然，所描述的实施例仅 是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技 术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范 围。

实施例1：齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)SCL2010的选育

从山东省潍坊市寿光市、高密市、临朐县感染白绢病的马铃薯植株和块茎上收集白 绢病菌核，以菌核为分离材料，无菌条件下将菌核接种与PDA固体培养基上培养，待菌 核萌发菌丝长出后，进行分离纯化培养，转接于PDA斜面培养基上保存。

将分离纯化转接于PDA培养基上的菌丝分别转接于新的PDA平板上，28℃培养连续 观察，待菌丝生长铺满平板并结出菌核，直至菌核变色成熟为止，记录菌丝生长情况、 结核及菌核变化情况，结合显微镜观察确定其中的齐整小核菌菌株并进行菌株编号；将 已确定为齐整小核菌的菌核转接与PDA平板上，观察记录菌核萌发情况、萌发率、菌丝 生长情况、结菌核时间和菌核量。选取菌核萌发快、萌发率≥75％、结菌核时间快(72h 左右)、菌核量多的菌株进行硬葡聚糖摇瓶发酵实验，通过大量实验，经过进一步分离筛 选，选育得到一株遗传性质稳定、菌核萌发率高达80％，硬葡聚糖产率最高达37g/L的齐 整小核菌，该菌株命名为齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)SCL2010菌株。

上述菌株齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)SCL2010，已于2014年7月6日保藏在中 国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC，地址： 中国.武汉.武汉大学)，其保藏编号为CCTCC NO.M2014325。

上述斜面培养基组成为(单位：g/L)：马铃薯200(经水煮烂后过滤)，葡萄糖20， 琼脂20。

上述种子培养基组成(单位：g/L)：葡萄糖10，酵母膏3，磷酸氢二钾2.5，硫酸镁 1.5，聚醚消泡剂0.2，其他为软化水，pH 4～5。

上述发酵培养基的组成(单位：g/L)：葡萄糖55，豆粕粉1，玉米浆2，磷酸氢二钾 2，硫酸镁1，聚醚消泡剂0.8，其他为软化水，pH 4～5。

实施例2：齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)SCL2010菌株18S rDNA的基因序列测 序

将实施例1选育得到的齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)SCL2010菌株即CCTCC NO. M2014325菌株委托华大基因测序。

实验方法：

(1)将一定量新结菌核用生理盐水洗入种子培养基里，28℃培养36h，菌核萌发产 生大量菌丝后，8000r/min离心获得菌丝体；

(2)采用Takara9765真菌DNA提取试剂盒从获得的菌丝体里提取基因组后送测序 公司测序。

测序结果：齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)SCL2010菌株18S rDNA的基因序列长 度为1694bp，具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

通过使用美国生物工程信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)BLASTN程序比对，发现CCTCC NO.M2014325菌株18S rDNA序列与NCBI 注册的多株齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)18S rDNA序列具有高度同源性，说明CCTCC  NO.M2014325菌株是一株齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)。进一步的，其18S rDNA序列 中碱基之间的序列又不是完全相同，产物用途也有别，说明本发明菌株与已公开菌株不 是同一菌株。

上述种子培养基组成(单位：g/L)：葡萄糖10，酵母膏3，磷酸氢二钾2.5，硫酸镁 1.5，聚醚消泡剂0.5，其他为软化水，pH 4～5。

实施例3：齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)SCL2010菌株发酵生产硬葡聚糖的方法

(1)将齐整小核菌CCTCC No.M2014325的成熟菌核接种于茄形瓶斜面固体培养基 上，30～34℃静置培养5～7天，以获得大量成熟菌核用于种子培养。

(2)将培养成熟的齐整小核菌CCTCC No.M2014325菌核用无菌生理盐水洗下，适 量接种于种子培养基里，34℃通气搅拌培养30h。

(3)硬葡聚糖发酵生产工艺：

将通过种子培养成熟的齐整小核菌CCTCC No.M2014325作为发酵菌种适量接种到 发酵培养基里，通气搅拌控制发酵以生产硬葡聚糖。

优选的发酵控制条件：

0～24h：温度32～34℃、pH 4.0～5.0、通风量0.1v.v.m.、压力为0.04～0.05MPa、DO 40％。

24～放罐(60～72h)：温度26～28℃、pH 2.5、通风量1.5v.v.m.、压力为0.04～0.05MPa、 DO 10％。

(4)本实施例的工艺硬葡聚糖收率为35g/L，发酵强度为0.49g/L/h，1％(w/v)粘 度为1100mPa.s。

上述茄形瓶斜面培养基组成为(单位：g/L)：马铃薯200(经水煮烂后过滤)，葡萄 糖20，琼脂20。

上述种子培养基组成(单位：g/L)：葡萄糖20，酵母膏3，硝酸钠3，磷酸氢二钾2； 硫酸镁3，聚醚消泡剂0.5；其他为软化水，pH 4～5。

上述发酵培养基组成为(单位：g/L)：蔗糖35，葡萄糖25，豆粕粉3，玉米浆0.5， 磷酸氢二钾1，硫酸镁0.5，聚醚消泡剂0.5，其他为软化水，pH 4～5。

实施例4：齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)SCL2010菌株发酵生产硬葡聚糖的方法

(1)将齐整小核菌CCTCC No.M2014325的成熟菌核接种于茄形瓶斜面固体培养基 上，30～34℃静置培养5～7天，以获得大量成熟菌核用于种子培养。

(2)将培养成熟的齐整小核菌CCTCC No.M2014325菌核用无菌生理盐水洗下，适 量接种于种子培养基里，34℃通气搅拌培养30h。

(3)硬葡聚糖发酵生产工艺：

将通过种子培养成熟的齐整小核菌CCTCC No.M2014325作为发酵菌种适量接种到 发酵培养基里，通气搅拌控制发酵以生产硬葡聚糖。

优选的发酵控制条件：

0～24h：温度32～34℃、pH 4.0～5.0、通风量0.2v.v.m.、压力为0.04～0.05MPa、DO 50％。

24～放罐(60～72h)：温度26～28℃、pH 2.5、通风量1.5v.v.m.、压力为0.04～0.05MPa、 DO 12％。

(4)本实施例的工艺硬葡聚糖收率为32g/L，发酵强度为0.44g/L/h，1％(w/v)粘 度为1220mPa.s。

上述茄形瓶斜面培养基组成为(单位：g/L)：马铃薯200(经水煮烂后过滤)，葡萄 糖20，琼脂20。

上述种子培养基组成(单位：g/L)：葡萄糖15，酵母膏4，硝酸钠2.5，磷酸氢二钾 2；硫酸镁2，聚醚消泡剂0.5；其他为软化水，pH 4～5。

上述发酵培养基组成为(单位：g/L)：淀粉25，葡萄糖25，豆粕粉1，玉米浆2， 硝酸钠1.5，磷酸氢二钾2，硫酸镁1，聚醚消泡剂0.8，其他为软化水，pH 4～5。

实施例5：齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)SCL2010菌株发酵生产硬葡聚糖的方法

(1)将齐整小核菌CCTCC No.M2014325的成熟菌核接种于茄形瓶斜面固体培养基 上，30～34℃静置培养5～7天，以获得大量成熟菌核用于种子培养。

(2)将培养成熟的齐整小核菌CCTCC No.M2014325菌核用无菌生理盐水洗下，适 量接种于种子培养基里，32～34℃通气搅拌培养33h。

(3)硬葡聚糖发酵生产工艺：

将通过种子培养成熟的齐整小核菌CCTCC No.M2014325作为发酵菌种适量接种到 发酵培养基里，通气搅拌控制发酵以生产硬葡聚糖。

优选的发酵控制条件：

0～24h：温度32～34℃、pH 4.0～5.0、通风量0.3v.v.m.、压力为0.04～0.05MPa、DO 40％。

24～放罐(60～72h)：温度26～28℃、pH 2.5、通风量1.2v.v.m.、压力为0.04～0.05MPa、 DO 7％。

(4)本实施例的工艺硬葡聚糖收率为34g/L，发酵强度为0.47g/L/h，1％(w/v)粘 度为1016mPa.s。

上述茄形瓶斜面培养基组成为(g/L)：马铃薯200(经水煮烂后过滤)，葡萄糖20， 琼脂20。

上述种子培养基组成(g/L)：葡萄糖10，酵母膏2，硝酸钠2，磷酸氢二钾2；硫酸 镁3，聚醚消泡剂1；其他为软化水，pH 4～5。

上述发酵培养基组成为(g/L)：淀粉10，蔗糖45，豆粕粉15，玉米浆15，硝酸钠1， 磷酸氢二钾1.5，硫酸镁1，聚醚消泡剂1，其他为软化水，pH 4～5。