齐整小核菌木质纤维素降解能力及硬葡聚糖合成途径的研究

摘要

木质纤维素生物质可混合糖发酵为生物能或其它类型的生物材料，一直以来都被认为是一种潜在的可持续利用的资源。但目前该资源仍未被充分利用，究其原因，主要在于该生物质难于降解和转化。
　　丝状真菌齐整小核菌Sclerotium rolfsii作为白腐菌，在前期实验中发现它具有很强的木质纤维素降解能力，可直接利用生物质，具有高价值化木质纤维素资源的迷人前景。同时它也是一种用来生产硬葡聚糖的载体微生物，可高效实施生物炼制。硬葡聚糖是一种价值很高的多糖聚合物，是生物炼制的绝佳产物，具有广泛用途，如工业、医药业、食品加工等，现已迅速崛起成为一种重要的有应用前景的的工业资源。但对 Sclerotium rolfsii 生物合成机制并不了解，本研究为Sclerotium rolfsii硬葡聚糖高效产业化的实现提供理论基础。
　　Sclerotium rolfsii木质纤维素降解能力的研究。
　　1. 通过前期系列比对试验发现，Sclerotium rolfsii具有强大的降解木质纤维素的能力，基于此，我们对 Sclerotium rolfsii 做全基因组测序。根据基因组结果对Sclerotium rolfsii做了进化树分析，发现该菌与黄孢原毛平革菌等多种木质纤维素强降解菌株具有近缘关系。对木质纤维素降解酶相关基因进行分析注释，得知该菌含有碳水化合物酶基因 1558 个，含有木质素降解酶相关基因 21 个，这两个数值远高于或相近于相应基因在有些已报道的相关降解菌中的个数 (如木质纤维素降解模式菌Dichomitus squalens含有碳水化合物酶基因391个，木质素降解酶相关基因12个)。
　　2. 做大量比对实验进一步验证Sclerotium rolfsii强降解木质纤维素能力。主要与其它已报道的木质纤维素降解菌对比(Tv: Trametes versicolor, Ds: Dichomitus squalens, Tr:Trichoderma reesei)。通过这些白腐菌对三种典型生物质底物（滤纸、碱性木质素及小麦秸秆）的降解，得出现象：20 天处理后，各菌对滤纸均有不同程度的降解，其中Sclerotium rolfsii培养基中滤纸坍塌效果最为明显，该菌对滤纸降解效率高达65％，纤维素酶活约2500U/g；20天处理后，Sclerotium rolfsii对碱木质素降解率可达 38%；30 天处理后的小麦秸秆被各菌不同程度的的分解， Sclerotium rolfsii 对小麦秸秆的降解效果比木质纤维素强降解白腐菌 Trametes versicolor 更明显，半纤维素，纤维素和木质素各成分与对照相比都有不同程度的减少，其中纤维素量减少尤为明显。同样监测各培养基中纤维素酶活性，Sclerotium rolfsii纤维素酶活性最高。这些现象充分证明齐整小核菌具有高效降解木质纤维素的能力，本次实验结果为高效降解木质纤维素菌株提供新的可能性，对深入探究Sclerotium rolfsii降解木质纤维素机制提供理论依据。
　　Sclerotium rolfsii 硬葡聚糖生物合成途径研究。
　　1.基于文献报道关于Sclerotium rolfsii合成硬葡聚糖假想代谢通路图，注释出该通路中所有相关酶基因，重点分析合成代谢途径中第五步关键酶基因。
　　2.稳定两种不同产硬葡聚糖体系（高产糖及低产糖），并分别做转录组测序，找出两种产糖条件下的差异显著基因并做差异基因GO富集分析及KEGG富集分析，结果表明在高产硬葡聚糖条件下，与多糖结合位点、碱基化合物转运相关基因明显富集。分析硬葡聚糖合成假想通路图中所有关键酶基因在两种产糖条件下mRNA表达差异，得出高产糖条件下，该通路中大部分相关酶基因均上调。
　　3.基于Sclerotium rolfsii转录组数据及文献报道挑出16个候选内参基因，在8种不同胁迫条件下（pH、温度、碳氮源及碳氮比）对这些候选基因进行 qRT-PCR定量，并用四个评估程序对定量结果进行稳定性评估，综合分析四种评估结果，最终筛选出三个稳定表达的内参基因DUF、HYP与β-TUB,其中前两个基因是基于转录组结果筛选出新的内参基因。为验证筛选结果的准确性，选取两个靶基因ZinP及DimL，以DUF、HYP及β-TUB为内参基因，在高产及低产糖条件下对这两个靶基因进行qRT-PCR相对定量，其定量结果与转录结果完全一致，充分验证了筛选结果的可行性。本次实验首次为S. rolfsii挑选合适内参基因，为该菌后续的基因水平定量提供有力保障，同时也为其它白腐菌内参基因的选择提供了参考。
　　4. Sclerotium rolfsii硬葡聚糖生物合成途径分析。
　　（1）对Sclerotium rolfsii合成硬葡聚糖通路所有关键酶基因在两种产糖条件下做qRT-PCR定量，分析定量结果预测每一步关键基因，尤其第五步关键酶基因。
　　（2）结合qRT-PCR定量结果、转录组测序结果最终确定Sclerotium rolfsii产硬葡聚糖通路中第五步关键基因为GME5438、GME4711，及S. rolfsii硬葡聚糖代谢途径中其它相关酶基因。

目录

第1章 绪论

1.1木质纤维素生物降解综述

1.2 齐整小核菌产硬葡聚糖综述

1.3 研究目的与意义

1.4 研究内容与技术路线

第2章 Sclerotium rolfsii基因组测序

2.1 Sclerotium rolfsii 培养及DNA提取

2.2 Sclerotium rolfsii 基因组测序及注释

2.3 本章小结

第3章 Sclerotium rolfsii降解木质纤维素能力探究

3.1. 菌株来源

3.2 实验方法

3.3 实验结果与讨论

3.4 本章小结

第4章 Sclerotium rolfsii内参基因的筛选

4.1 实验材料与方法

4.2 实验结果与讨论

4.3. 本章小结

第 5 章 Sclerotium rolfsii 产硬葡聚糖途径的探究

5.1 Sclerotium rolfsii产硬葡聚糖实验体系

5.2 两种产糖条件下的转录组测序分析

5.3. Sclerotium rolfsii产硬葡聚糖代谢途径分析

5.4 本章小结

第6章 结论与展望

6.1 结论

6.2 展望

参考文献

致谢

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