一种鲜松茸活性物质的制备方法

摘要

一种鲜松茸活性物质的制备方法，它涉及一种松茸活性物质的制备方法。本发明的方法为：一、原料预处理；二、超声波辅助水提取；三、弱碱盐溶液提取；四、醇溶液提取；五、合并超声提取液、弱碱盐溶液提取液和醇溶液提取液，经过滤，旋转蒸发，蒸馏后，即得。本发明打破了松茸活性物质利用率低的局限性，利用多种提取方式综合提取，大大提高了松茸活性成分的得率，增加了松茸浓缩液的有效成分含量，提取的水溶性多糖、维生素C、黄酮、碱性蛋白质、多酚和三萜等活性成分具有可以增强免疫调节、抗氧化和抗疲劳的功效，更有利于人体吸收，并结合口服液使用简单、方便，便于保藏等优势，大大提高了松茸的利用价值与经济效益。

说明书

技术领域

本发明涉及一种松茸活性物质的制备方法。

背景技术

松茸作为一种珍贵稀有的食药用真菌，其含有丰富的营养活性物质，具有重要的保健 功能和药用价值，其应用已经得到广泛的关注。松茸的商业价值，一直深受日本、美国和 欧洲等国家消费者的青睐。由于松茸的生长、采集受季节、地域、气候等因素的限制，难 以保鲜贮存，致使松茸价格昂贵，浮动频繁，国内外只有极少数人能够食用到，大多数人 很难品尝到松茸制品，享受松茸制品的美味与保健作用。目前国内外对松茸的研究比较少， 栽培方面还仅限于人工促丰产技术，加工方面也只是简单的保鲜技术，市场上松茸加工产 品较少，国内外尚无对松茸功能性有效成分提取与产品开发。

进行松茸功能性浓缩饮品开发，可以在实现松茸资源持续高效利用前提下，为松茸保 健品市场开拓新的思路。此外，作为前瞻性的基础研究，还可为今后陆续开发姬松茸、灵 芝等食用菌类功能性浓缩饮品提供依据。

但受季节、地域、气候等因素的限制，其难以保鲜贮存，导致大量活性物质流失，营 养价值降低。松茸保鲜一度是世界性难题。如何在最大程度上保全松茸营养成分并可长期 储存是亟待解决的问题，也是未来研究的必然趋势。更重要的是目前的方法不能将松茸等 外品和边角料加以利用，不能减少资源的浪费，变废为宝，增收节支，为综合有效利用松 茸资源创造新途径。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述存在的问题，而采超声波辅助水提取、弱碱盐溶液提取、 醇溶液提取，提取出松茸中营养和功能性成分，得到了一种鲜松茸活性物质的制备方法。

本发明的一种鲜松茸活性物质的制备方法，它是按照以下步骤进行的：

一、选择新鲜、无病残、无虫蛀的松茸，于清水中洗净，沥水；将松茸子实体进行切 片处理；加入其20倍体积无菌蒸馏水，将切片后的松茸减压浸渍在含有质量百分含量为 0.03％的柠檬酸、质量百分含量为0.02％正丁醇与质量百分含量为0.02％肉豆蔻酯的混合 溶液中，减压浸渍10min后，加入质量百分含量为0.02％EDTA和质量百分含量为0.2％ 柠檬酸钠，然后捣碎松茸组织，再按体积比为1:1:(1～2)的比例加入6～7g/L的纤维素酶、 6～7g/L的果胶酶和6～7g/L的木瓜蛋白酶进行酶解反应得松茸处理原料；其中，酶解反 应条件为pH＝5、温度为50℃、酶解时间为1.5h、酶与底物浓度比为1:3.3；

二、超声波辅助水提取：将步骤一得到的松茸处理原料置于20倍松茸处理原料体积 的水中进行超声提取，收集松茸超声提取液和残渣；其中，超声处理条件为：声波功率 5～150w，提取时间5～25min，超声波工作时间1～5s，间隔时间1～5s；

三、弱碱盐溶液提取：向步骤二收集的残渣中加入20倍残渣体积的弱碱溶液进行提 取，其中，弱碱溶液含有质量百分含量为0.1～0.5％的碳酸氢钠溶液和质量百分含量为 0.5～2.5％氯化钠溶液，收集松茸弱碱盐溶液提取液和残渣；其中，提取时间为30～150min， 提取温度为50～90℃；

四、醇溶液提取：将步骤三收集残渣置于20倍残渣体积的体积百分含量为50～90％ 的乙醇中，然后在水浴温度为50～90℃的条件下提取30～150min，得松茸醇溶液提取液；

五、收集步骤二得到的松茸超声提取液、步骤三得到的松茸弱碱盐溶液提取液和步骤 四得到的松茸醇溶液提取液，混合后，用100目的尼龙66滤层过滤，利用旋转蒸发装置 以50℃、60r/min的条件对上述混合溶液进行蒸馏浓缩，蒸馏浓缩至原混合溶液体积的 1/10，即完成所述的松茸活性物质提取。

本发明包含以下有益效果：

本发明打破了松茸活性物质利用率低的局限性，通过改变提取方式，增加了松茸浓缩 液的提取率，并结合口服液使用简单、方便，便于保藏等优势，大大提高了松茸的利用价 值与经济效益。

目前，松茸的研究大部分还只局限于对松茸单一成分的提取与利用，而忽略了其他营 养成分及各成分间的相互作用。普通的热水浸提法、水煮醇沉法只能提取少量的营养物质， 要将所有的营养成分提取出来是极其困难的，这对松茸的利用造成了浪费。本发明为了提 高松茸的利用率及松茸整体营养价值，采用分步提取法对松茸中的成分进行全面有效的提 取，既能最大限度的提取出松茸中的各种营养成分，又能保持营养价值不受损失，也有利 于松茸的应用。

本发明的超声波辅助水提取的最佳工艺为：超声波功率125w，提取时间10min，超 声波工作时间4s，间隔时间1s；弱碱盐溶液提取的最佳工艺为：碳酸氢钠浓度0.3％， 氯化钠浓度0.5％，提取时间120min，提取温度80℃；醇溶液提取的最佳工艺为：乙醇 浓度80％，提取时间30min，提取温度70℃。在最佳工艺条件下测得的超声波辅助水提 取中松茸水溶性多糖的得率为0.52g/100g，维生素C的得率为3.0mg/100g，黄酮的得率 为7.1mg/100g；弱碱盐溶液提取出的碱性蛋白质的得率为1.16g/100g；醇溶液提取出的 多酚和三萜的得率分别为1.16mg/100g和0.23g/100g。

本发明对松茸浓缩口服液的品质进行评价，及对其感观、相对密度、pH值、卫生学 指标和营养成分含量进行检测。结果表明，松茸浓缩口服液呈澄明的黄褐色液体，无浑浊 和沉淀，味甘，相对密度为1.10±0.05g/mL，pH值为7.50±0.05，每支装量为10mL，棕 色瓶包装，卫生学检测符合标准，100mL中含有多糖86.7±0.2mg、维生素C 0.50±0.04mg、 黄酮1.18±0.04mg、蛋白质193.3±0.3mg、多酚0.19±0.02mg、三萜38.3±0.1mg，检测出 17种氨基酸，其品质良好。

以小鼠的免疫调节能力、抗氧化性及抗疲劳能力作为检测指标对本发明方法制备的松 茸浓缩口服液进行检测，以灌胃生理盐水小鼠作为对照，检验了灌胃松茸浓缩口服液后小 鼠的各项指标的变化情况。结果表明：灌胃松茸浓缩口服液21d后免疫调节能力中胸腺 指数提高26％，脾脏指数提高9.1％，血清IgG含量提高11％，巨噬细胞吞噬能力提高51％， 与对照组相比差异显著(P＜0.05)；在抗氧化能力检测中，试验组灌胃21d后MDA含量 降低57％，SOD含量提高11％，与对照组相比差异显著(P＜0.05)；在抗疲劳能力检测 中，灌胃21d后，力竭游泳时间提高39％，无显著性差异；血乳酸含量和血清尿素氮分 别降低了29％和49％，与对照组相比差异显著(P＜0.05)。

附图说明

图1为的葡萄糖标准曲线；

图2为维生素C标准曲线；

图3为黄酮标准曲线；

图4为蛋白质标准曲线；

图5为多酚标准曲线；

图6为三萜标准曲线。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的一种鲜松茸活性物质的制备方法，它是按照以下步骤 进行的：

一、选择新鲜、无病残、无虫蛀的松茸，于清水中洗净，沥水；将松茸子实体进行切 片处理；加入其20倍体积无菌蒸馏水，将切片后的松茸减压浸渍在含有质量百分含量为 0.03％的柠檬酸、质量百分含量为0.02％正丁醇与质量百分含量为0.02％肉豆蔻酯的混合 溶液中，减压浸渍10min后，加入质量百分含量为0.02％EDTA和质量百分含量为0.2％ 柠檬酸钠，然后捣碎松茸组织，再按体积比为1:1:(1～2)的比例加入6～7g/L的纤维素酶、 6～7g/L的果胶酶和6～7g/L的木瓜蛋白酶进行酶解反应得松茸处理原料；其中，酶解反 应条件为pH＝5、温度为50℃、酶解时间为1.5h、酶与底物浓度比为1:3.3；

二、超声波辅助水提取：将步骤一得到的松茸处理原料置于20倍松茸处理原料体积 的水中进行超声提取，收集松茸超声提取液和残渣；其中，超声处理条件为：声波功率 5～150w，提取时间5～25min，超声波工作时间1～5s，间隔时间1～5s；

三、弱碱盐溶液提取：向步骤二收集的残渣中加入20倍残渣体积的弱碱溶液进行提 取，其中，弱碱溶液含有质量百分含量为0.1～0.5％的碳酸氢钠溶液和质量百分含量为 0.5～2.5％氯化钠溶液，收集松茸弱碱盐溶液提取液和残渣；其中，提取时间为30～150min， 提取温度为50～90℃；

四、醇溶液提取：将步骤三收集残渣置于20倍残渣体积的体积百分含量为50～90％ 的乙醇中，然后在水浴温度为50～90℃的条件下提取30～150min，得松茸醇溶液提取液；

五、收集步骤二得到的松茸超声提取液、步骤三得到的松茸弱碱盐溶液提取液和步骤 四得到的松茸醇溶液提取液，混合后，用100目的尼龙66滤层过滤，利用旋转蒸发装置 以50℃、60r/min的条件对上述混合溶液进行蒸馏浓缩，蒸馏浓缩至原混合溶液体积的 1/10，即完成所述的松茸活性物质提取。

本实施方式超声波辅助水提取中松茸水溶性多糖的得率为0.52g/100g：维生素C的 得率为3.0mg/100g：黄酮的得率为7.1mg/100g；

弱碱盐溶液提取出的碱性蛋白质的得率为1.16g/100g；

醇溶液提取出的多酚和三萜的得率分别为1.16mg/100g和0.23g/100g。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中的按体积比为 1:1:1.4的比例加入6.8g/L的纤维素酶、6.8g/L的果胶酶和6.8g/L的木瓜蛋白酶进行酶解 反应。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤二中超声处理条件为： 声波功率100～150w，提取时间5～10min，超声波工作时间2～4s，间隔时间1～3s。其它 与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤二中超声处理条件为： 声波功率125w，提取时间10min，超声波工作时间4s，间隔时间1s。其它与具体实施 方式一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤三中弱碱溶液含有质 量百分含量为0.3％的碳酸氢钠溶液和质量百分含量为0.5％氯化钠溶液。其它与具体实施 方式一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤三中提取时间为 90～150min，提取温度为70～90℃。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤三中提取时间为120 min，提取温度为80℃。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤四中乙醇的体积百分 含量为80％。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤四中在水浴温度为 60～80℃的条件下提取30～90min。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤四中在水浴温度为 70℃的条件下提取30min。其它与具体实施方式一相同。

本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同 样也可以实现发明的目的。

通过以下实施例验证本发明的有益效果：

实施例一

松茸中含有大量的营养及功能性成分，特别是新鲜松茸对人体健康有益，但是新鲜松 茸存在不易保藏、有效成分利用率低等缺点。

针对上述问题，本实施例为了最大限度的提取出松茸中的营养物质与功能性成分，根 据其性质，采超声波辅助水提取、弱碱盐溶液提取、醇溶液提取，提取出松茸中营养和功 能性成分，同时考虑了提取工艺的复杂程度、稳定性及生产成本，得到了鲜松茸浓活性物 质的制备工艺。

以下实施例所需松茸来源黑龙江省牡丹江市东宁县的新鲜松茸。

1、具体方法

2、原材料预处理

选择新鲜、无病残、无虫蛀的松茸，于清水中洗净，沥水。将松茸子实体进行切片处 理；用电子天平称量重量，加入20倍体积无菌蒸馏水，将切片后的松茸减压浸渍在含有 0.03％的柠檬酸、0.02％正丁醇与0.02％肉豆蔻酯的混合溶液中，减压浸渍10min。加入 0.02％EDTA、0.2％柠檬酸钠，用组织捣碎器将组织破坏。加入纤维素酶、果胶酶、木瓜 蛋白酶，按6.8g/L加入进行酶解反应，三种酶的比例为1:1:1.4。

3、对预处理后的原料，以此进行超声波辅助水提取→弱碱盐溶液提取→醇溶液提取：

一、超声波辅助水提取：将步骤一得到的松茸处理原料置于水中进行超声提取(松茸 原料与水的用量比例关系是1:30)，收集松茸超声提取液和残渣；其中，超声处理条件为： 声波功率125w，提取时间10min，超声波工作时间4s，间隔时间1s；

二、弱碱盐溶液提取：向步骤二收集的残渣中加入20倍残渣体积的弱碱溶液进行提 取，其中，弱碱溶液含有质量百分含量为0.3％的碳酸氢钠溶液和质量百分含量为0.5％氯 化钠溶液，收集松茸弱碱盐溶液提取液和残渣；其中，提取时间为120min，提取温度为 80℃；

三、醇溶液提取：将步骤三收集残渣置于20倍残渣体积的体积百分含量为80％的乙 醇中，在醇溶液的温度为70℃的条件下提取30min，得松茸醇溶液提取液。

对松茸经超声波辅助水提取→弱碱盐溶液提取→醇溶液提取过程后，测得的超声波辅 助水提取中松茸水溶性多糖的得率为0.52g/100g，维生素C的得率为3.0mg/100g，黄酮 的得率为7.1mg/100g；弱碱盐溶液提取出的碱性蛋白质的得率为1.16g/100g；醇溶液提 取出的多酚和三萜的得率分别为1.16mg/100g和0.23g/100g。

实施例二

1、制备松茸浓缩口服液

(1)将新鲜松茸进行原料预处理(同第2部分的原料预处理)；

(2)超声波辅助水提取：将上经预处理后的松茸在超声波细胞破碎仪中进行超声提 取，调节超声功率125w、超声时间10min、工作时间4s、间隔时间1s，用4000r/min 的离心机分离10min，得到提取液1和残渣1；

(3)弱碱盐溶液提取：将残渣1浸渍在松茸质量20倍体积含有0.3％碳酸氢钠、0.5％ 氯化钠溶液中，80℃恒温提取120min。然后用4000r/min速度离心分离10min，得到提 取液2和残渣2；

(4)乙醇溶液提取：将残渣2浸渍在松茸质量20倍体积含有80％乙醇溶液中70℃ 恒温水浴锅中提取30min，得到提取液3；

(5)浓缩蒸馏：将三次提取液混合,然后进行过滤，用100筛眼的尼龙66滤层过滤。 利用旋转蒸发装置以50℃、60r/min对上述混合溶液进行蒸馏浓缩，蒸馏浓缩至总体积的 1/10，灭菌灌装。得到黄褐色澄清透明口服液。

2、制得的松茸浓缩口服液进行品质评价分析

2.1品质评价指标

(1)感观评价

取3批松茸浓缩口服液，由10位专业人士对其色泽、香味及组织状态进行评分，取 平均值进行评价。

(2)相对密度检查

分别取3批松茸浓缩口服液样品用比重计测定其相对密度，每批样品重复测定3次， 取平均值。

(3)pH值检查

分别取3批松茸浓缩口服液样品，参照2010版国家药典附录ⅦG pH值测定法，用酸 度计进行测定，测定前用硼砂标准缓冲溶液校正，每批样品重复测定3次，取平均值。

(4)卫生学检查

参照《中国药典》(2010版一部)附录IG合剂的微生物限度有关规定，依据附ⅫC微 生物限度检测法所述步骤，分别对松茸浓缩口服液中细菌数、霉菌和大肠埃希菌数进行了 检测。

(5)营养成分含量测定

1)多糖

(1)水溶性多糖的得率测定

①葡萄糖标准曲线的绘制

采用苯酚硫酸法测定松茸多糖含量。准确称取葡糖标准品100mg，蒸馏水定容至100 mL，得到浓度为1.0mg/mL的标准溶液。精密吸取葡萄糖标准液0.1mL、0.2mL、0.4mL、 0.6mL、0.8mL、1.0mL，补水至2.0mL。加入50g/L的苯酚溶液1.0mL，浓硫酸5.0mL， 混匀，沸水浴2min。冷却后在495nm处测吸光值，以多糖浓度(mg/mL)为横坐标， 以吸光值(OD₄₉₅)为纵坐标，如图1所示。

②水溶性多糖得率的计算

取1mL提取液，按照上述标准曲线方法测定吸光值，根据标准曲线求出提取液中多 糖的浓度，可计算：

水溶性多糖得率＝提取液中水溶性多糖质量/松茸质量×100％。

2)维生素C

维生素C的得率

①维生素C标准曲线的绘制

精确称取草酸6.30g，EDTA0.0584g，充分溶解后定容至100mL，准确称取干燥的 维生素C 5mg，用草酸-EDTA溶液定容至500mL，分别吸取0.8mL、1.2mL、1.6mL、 2.0mL、2.4mL、2.8mL、3.2mL的标准抗坏血酸溶液于50mL的容量瓶中，然后加人 草酸-EDTA溶液，使总体积达到10mL。再加入1.0mL的偏磷酸一醋酸溶液和5％的硫 酸2.0mL，摇匀加人4.0mL的铝酸铵，在705nm下测定吸光值，以维生素C浓度(μg/mL) 为横坐标，以吸光值(OD₇₀₅)为纵坐标，如图2所示。

②维生素C得率的计算

取1mL提取液，按照上述标准曲线方法测定吸光值，根据标准曲线求出提取液中维 生素C的浓度，可计算：

维生素C得率＝提取液中维生素C质量/松茸质量×100％。

③黄酮

3)黄酮的得率

①黄酮标准曲线的绘制

精确称取20mg芦丁标准品，用50％乙醇溶液定容至100mL，得0.2mg/mL芦丁标 准溶液，量取标准溶液1.0mL、3.0mL、5.0mL、7.0mL、13.0mL、17.0mL、23.0mL。 分别置于100mL容量瓶中，每个容量瓶中加入5％亚硝酸钠溶液1.0mL，放置6min后， 再分别加入10％硝酸铝溶液1.0mL，静置6min后分别加入4％氢氧化钠溶液10mL，使 用50％乙醇溶液定容，静置10min后，于508nm处测吸光值，以芦丁浓度(μg/mL)为 横坐标，以吸光值(OD₅₀₈)为纵坐标，如图3所示。

②黄酮得率的计算

取1mL提取液，按照上述标准曲线方法测定吸光值，根据标准曲线求出提取液中黄 酮的浓度，可计算：

黄酮得率＝提取液中黄酮质量/松茸质量×100％。

4)蛋白质

碱溶性蛋白质的得率

①蛋白质标准曲线的绘制

首先将牛血清白蛋白用0.15mol/mL的氯化钠溶液配成1.0mg/mL的标准蛋白质溶 液。再准确称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL95％的乙醇后，加入120mL 85％ 的磷酸，用蒸馏水稀释至1L。取6支试管分别加入1.0mg/mL的标准蛋白质溶液0.1mL、 0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL，然后用0.15mol/mL氯化钠溶液补充到1mL， 最后个试管分别加入5.0mL考马斯亮蓝G-250试剂。每加完一管，立即在旋涡混合器上 混匀。加完试剂2-5min后，于595nm处测吸光值。以牛血清白蛋白浓度(mg/mL)为 横坐标，以吸光值(OD₅₉₅)为纵坐标，如图4所示。

②碱溶性蛋白质得率的计算

取1mL提取液，按照上述标准曲线方法测定吸光值，根据标准曲线求出提取液中碱 溶性蛋白质的浓度，可计算：

碱溶性蛋白质得率＝提取液中碱溶性蛋白质量/松茸质量×100％。

5)多酚

多酚的得率

①多酚标准曲线的绘制

精确称取没食子酸标准品25mg，用水溶解并定容至250mL，得到0.1mg/mL的标 准溶液。精密吸取标准溶液0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL于100mL 容量瓶中，加入1mL福林酚显色剂，摇匀后再加入2mL15％碳酸钠溶液，定容至100mL， 室温下反应2h后于760nm处测吸光值，以没食子酸浓度(μg/mL)为横坐标，以吸光值 (OD₇₆₀)为纵坐标，如图5所示。

②多酚得率的计算

取1mL提取液，按照上述标准曲线方法测定吸光值，根据标准曲线求出提取液中多 酚的浓度，可计算

多酚得率＝提取液中多酚质量/松茸质量×100％。

6)三萜

三萜得率的计算

①三萜标准曲线的绘制

精确称取熊果酸标准品1.150mg，溶于10mL无水乙醇中，得0.115mg/mL标准溶 液。精确吸取0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL标准溶液于10 mL试管中，水浴蒸干溶剂。分别向每支试管中加入5％香草醛-冰醋酸0.5mL、高氯酸1 mL，密封。60℃水浴加热15min，取出置于冰水中冷却。再向每支试管中加入5mL冰 醋酸溶液，摇匀。于548nm处测吸光值，以熊果酸质量(μg)为横坐标，以吸光值(OD₅₄₈) 为纵坐标，如图6所示。

②三萜得率的计算

取1mL提取液，按照上述标准曲线方法测定吸光值，根据标准曲线求出提取液中多 糖的浓度，可计算

三萜得率＝提取液中三萜质量/松茸质量×100％。

⑦氨基酸

利用氨基酸分析仪测定。

3、结果与分析

3.1感观评价

口服液的感观是消费者对于口服液的第一认识与评价，所以口服液的感观直接影响了 其品质的好坏，本试验由10位经专业训练人士对松茸浓缩口服液的感观进行评价，结果 如表1所示。

表1 松茸浓缩口服液性状感官评价

由表1可知，每批松茸浓缩口服液的性状良好，感观评价得分均在90分以上，制得 的松茸浓缩口服液呈黄褐色，香气浓郁，澄清。

3.2相对密度的检测

松茸浓缩口服液3批样品的相对密度为1.10±0.05g/mL。

3.3pH值的检测

分别检测了松茸浓缩口服液3批样品的pH值，制备松茸浓缩口服液的pH值为 7.50±0.05。

3.4卫生学检测

经检测松茸浓缩口服液中细菌、霉菌和大肠埃希菌数符合国家标准，未检测出致病菌。

3.5营养成分含量的检测

营养成分的含量决定了口服液的品质，本试验对制得的松茸浓缩口服液中各营养成分 含量进行检测，结果如表2和表3。

表2 松茸浓缩口服液各成分含量

由表2可知，3批次口服液每支中各营养成分含量差异不大，其中多糖含量为86.7±0.2 mg/100mL、维生素C为0.50±0.04mg/100mL、黄酮为1.18±0.04mg/100mL、蛋白质为 193.3±0.3mg/100mL、多酚含量为0.19±0.02mg/100mL、三萜含量为38.3±0.1mg/100mL。 与松茸子实体相比，松茸浓缩口服液较全面的保留了其营养物质与功能成分。

表3 松茸浓缩口服液氨基酸含量

由表3可得，松茸浓缩口服液中除胱氨酸、蛋氨酸砜、半胱氨酸未检测出，检测出 17种氨基酸。与文献相比，检测出的氨基酸种类与文献基本一致，谷氨酸、蛋氨酸、异 亮氨酸和赖氨酸的含量略小于文献，其他13种氨基酸含量均高于文献平均值。

本实施例对松茸口服液的外观性质、pH值、相对密度、卫生学和营养成分含量等进 行了检测，建立了品质评价的初步标准。经检测，松茸浓缩口服液呈澄明的黄褐色液体， 无浑浊和沉淀，味甘，相对密度为1.10±0.05g/mL，pH值为7.50±0.05，每支装量为10mL， 棕色瓶包装，卫生学检测符合标准，100mL中含有多糖86.7±0.2mg、维生素C 0.50±0.04 mg、黄酮1.18±0.04mg、蛋白质193.3±0.3mg、多酚0.19±0.02mg、三萜38.3±0.1mg， 氨基酸种类与文献一致，13种氨基酸含量大于文献的平均值。

实施例三

松茸浓缩口服液功能性验证

松茸作为一种珍稀名贵菌类，具有很高的营养价值与药用价值。研究表明，松茸具有 抗肿瘤、增强免疫力、抗氧化、抗突变等多种生物活性功能。本实施例对松茸浓缩口服液 的增强免疫能力、抗氧化性以及抗疲劳性进行了验证。

1、试验动物

昆明小鼠(Mus musculus)雌性，SPF级，6-8周龄，体重18±2g，购于中国农业科 学院哈尔滨兽医研究所SPF级动物中心，小鼠饲养于清洁级动物房。小鼠饲养于标准条 件下(湿度50％±10％；12h白昼/12h黑夜交替)，饲喂经过灭菌的鼠粮及蒸馏水。

2、试验方法

2.1试验小鼠分组及处理

小鼠经3天适应性饲养后，随机分为四组，每组12只。用不锈钢食盒及塑料饮水 瓶分笼饲养，每天早晚各添饲料一次。试验开始、结束时各称体重一次，所有小鼠可以自 由接触到饲料和水。其中两组小鼠灌胃无菌生理盐水，另外两组灌胃松茸浓缩口服液，每 只小鼠每天灌胃一次，每次0.2mL/10g，连续21d。

2.2免疫调节能力指标的测定

2.2.1胸腺指数、脾指数测定

分别于试验的第7d、14d和21d摘眼球放血处死小鼠，剥去胸腺(脾)，并将周围 组织剥离干净后，称重。

按下式计算免疫脏器指数：胸腺(脾)指数＝胸腺(脾)重量(mg)/体重(g)。

2.2.2血清IgG含量

血清中的免疫球蛋白IgG与实际中特异性的IgG抗体，形成抗原抗体复合物而产生 浑浊度，其浊度高低在一定量抗体存在时与血清中IgG成比。通过测定特定波长的吸光 度值，参照校准曲线即可计算出血清中IgG的含量。

分别于试验的第7d、14d和21d摘眼球放血处死小鼠，按照IgG试剂盒说明书操作。

2.2.3巨噬细胞吞噬功能

(1)将印度墨汁按1:3比例稀释，于试验的第7d、14d和21d按小白鼠每10g体 重0.1mL计算，经尾静脉注入体内，待墨汁注射完毕立即计时。

(2)注入墨汁后2min、10min时，分别从眼眶后静脉丛取血20μL，于2mL碳酸 钠溶液中摇匀，用紫外分光光度计在600nm波长下测OD值，以碳酸钠为空白对照。

根据公式计算碳颗粒廓清指数(Clearance index ofcarbon particles,CICP)和校正廓清 指数(Adjusted clearance index ofcarbon particles,ACICP)。

$\mathrm{CICP}=\frac{(\lg {\mathrm{OD}}_1-\lg {\mathrm{OD}}_2)}{t_2-t_1}$

式中OD₁，OD₂分别为2min(t₁)，10min(t₂)时取血样测得的吸光度值；t₁，t₂为注 射印度墨汁后采血的时间。

2.3抗氧化活性指标的测定

2.3.1丙二醛含量测定

过氧化脂质降解产物中的丙二醛可与硫代巴比妥酸缩合，形成红色产物，在532nm 处有最大吸收峰。

分别于试验的第7d、14d和21d摘眼球放血处死小鼠，按照MDA试剂盒说明书操 作。

按以下公式计算血清MDA含量(nmol/mL)：

2.3.2超氧化物歧化酶活性测定

分别于试验的第7d、14d和21d摘眼球放血处死小鼠，按照SOD试剂盒说明书操 作。

(1)按公式计算SOD的抑制率：

(2)按公式计算SOD的活力：

SOD活力＝SOD抑制率÷50％×反映体系稀释倍数×样本测试前稀释倍数。

2.4抗疲劳功能指标的测定

2.4.1力竭游泳时间测定

根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)测定小鼠的负重游泳时间。每天灌 胃1次，分别连续灌胃7d、14d和21d。末次灌胃30min后，在小鼠尾根部负荷5％体 重铅丝置于游泳箱中游泳。水深不低于30cm，水温25±1.0℃。参照力竭判断标准(即 小鼠头部沉入水中，经10s还不能返回水面视为力竭)，记录自游泳开始至力竭的时间， 作为游泳时间。数据以均数和标准差()表示。

2.4.2血乳酸含量测定

分别于灌胃后第7d、14d和21d，将试验组与对照组小鼠尾部负5％体重的铅丝放 入30℃的游泳箱中游泳10min；游泳后即刻取小鼠内眦静脉血20μL，按照血乳酸含量 试剂盒说明书操作。

2.4.3血清尿素氮含量测定

分别于灌胃后第7d、14d和21d，将试验组与对照组小鼠同时放入30℃的游泳箱 中游泳60min，即刻取小鼠眼静脉丛血，离心，取血清，按照血清尿素氮含量试剂盒说 明书操作。

计算公式：

2.4.4统计学方法

所得数据以表示，应用T-Test检验处理，P＜0.05表示显著差异，P＜0.01 表示差异极其显著。

3、结果与分析

3.1、松茸浓缩口服液对小鼠免疫调节能力的影响

3.1.1对胸腺指数的影响

胸腺内含有丰富的淋巴细胞，它对T淋巴细胞的成熟和细胞介导的免疫的发展是必 不可少的。通过试验可以初步认为松茸浓缩口服液能够促进小鼠胸腺的发育，结果如表4。

表4 松茸浓缩口服液对小鼠胸腺指数影响

注：*表示P＜0.05水平的差异显著。

从表4中可以看出，随着时间的增加，各组胸腺指数呈上升趋势，其中试验组胸腺指 数均高于对照组。在灌胃松茸浓缩口服液7d、14d后，试验组胸腺指数高于对照组，分 别提高了12％和16％，但是差异不显著。21d后，试验组的胸腺指数明显高于对照组， 提高了26％，且差异显著(P＜0.05)。

3.1.2对脾脏指数的影响

脾脏含有大量吞噬细胞，是单核吞噬细胞系统的主要组成部分。脾脏主要的免疫学功 能是通过截流血液里的微生物并与之产生免疫应答来过滤血液。试验发现松茸浓缩口服液 可以促进小鼠脾脏的发育。结果如表5。

表5 松茸浓缩口服液对小鼠脾脏指数影响

注：*表示P＜0.05水平的差异显著。

从表5中可以看出小鼠脾脏指数逐渐增加，且试验组均高于对照组，7d、14d和21d 脾脏指数分别提高了6.4％、7.3％和9.1％，21d时试验组与对照组相比差异显著(P＜0.05)， 具有统计学意义。说明小鼠受到松茸浓缩口服液的作用后，促进了脾脏的发育。

3.1.3对血清IgG含量的影响

血清中IgG含量是机体免疫器官组织中的体液免疫活性细胞产生的体液免疫分子， 是体液免疫系统功能状态的重要指标。试验表明松茸浓缩口服液对小鼠血清IgG含量的 影响与对照组相比有增加的趋势，松茸浓缩口服液有增加血清中IgG含量的作用，如表 6。

表6 松茸浓缩口服液对小鼠血清IgG含量影响

注：**表示P＜0.01水平的差异显著。

从表6中不难看出，灌胃口服液7d后，试验组IgG含量与对照组变化不大，没有 显著差异，而灌胃14d及21d后，小鼠血清IgG含量分别提高了10％和11％，差异极其 显著(P＜0.01)。

3.1.4对巨噬细胞吞噬功能的影响

当静脉注入特定大小的惰性碳粒后，它即可被巨噬细胞迅速吞噬，而从血流中廓清。 因此可借助测定血清中碳粒的消失速度来反映巨噬细胞吞噬异物的能力。经过试验后发 现，松茸浓缩口服液有提高巨噬细胞的吞噬功能的效果。结果如表7。

表7 松茸浓缩口服液对小鼠巨噬细胞吞噬指数影响

注：*表示P＜0.05水平的差异显著。

从表7中可以发现，在灌胃松茸浓缩口服液7d及14d后，试验组与对照组相比较， 吞噬能力分别提高了28％、32％，但没有显著差异。灌胃21d后，试验组远高于对照组， 提高了51％，差异性显著(P＜0.05)。

3.2、松茸浓缩口服液对小鼠抗氧化活性的影响

3.2.1、对丙二醛含量的影响

MDA是动物体内多元不饱和脂质氧化的终产物之一，其浓度的高低可以反映体内不 饱和脂质的过氧化程度，间接地反映出细胞膜的损伤程度。松茸浓缩口服液对小鼠体内 MDA含量的影响见表8。

表8 松茸浓缩口服液对小鼠MDA含量影响

注：**表示P＜0.01水平的差异显著。

由表8可知，试验组MDA含量均低于空白组，在第7d和14d时，MDA含量分别 下降了10％和16％，在灌胃21d后对照组与试验组相比，降低了57％，差异性极其显著 (P﹤0.01)。说明松茸浓缩口服液可以降低小鼠体内血清中MDA含量，从而减轻小鼠体 内膜脂质过氧化过程。

3.2.2、对超氧化物歧化酶活力的影响

SOD是生物体内一种重要的酶类自由基清除剂，具有维持活性氧代谢平衡，保护膜 结构的功能。SOD能够清除体内的O₂^ˉ，从而对机体的氧化与抗氧化平衡起重要用。SOD 活力的高低可间接反映机体清除自由基能力的强弱。本试验测定了血清中SOD活力，具 体活力结果见表9。

表9 松茸浓缩口服液对小鼠SOD活力影响

注：*表示P＜0.05水平的差异显著。

从表9中可以看出，试验组中小鼠血清的SOD活力均高于空白组，但是在灌胃7d 及14d时并无显著性差异，分别提高了7％和6％。在灌胃21d后，试验组小鼠血清内 的SOD活力则明显高于对照组，提高了11％，差异显著(P＜0.05)。小鼠体内抗氧化酵 的活力高低反映了机体清除自由基能力的强弱说明试验组的松茸浓缩口服液可以清除小 鼠体内过量的超氧阴离子自由基，提高小鼠体内血清的抗氧化能力。

3.3、松茸浓缩口服液对小鼠抗疲劳功能的影响

3.3.1、对小鼠力竭游泳时间的影响

游泳至力竭的时间是反映运动能力的常用指标，而运动能力的提高是机体抗疲劳能力 加强最有力的宏观体现。长时间的剧烈运动将导致机体相对缺氧和糖酵解作用加快，进而 产生大量的乳酸，乳酸积累过多会影响体内环境的相对稳定和体内的正常代谢过程。

表10 松茸浓缩口服液对小鼠负重游泳时间影响

由表10可见，灌胃松茸浓缩口服液7d、14d和21d后，试验组与空白对照组比较， 游泳时间有所延长，分别提高了43％、41％和39％，但无显著性差异，可以初步认为松茸 浓缩口服液能延长小鼠负重游泳时间，但机制其还需进一步试验验证。

3.3.2、对小鼠血乳酸含量的影响

乳酸是无氧糖酵解的产物，经过短时间大强度剧烈运动后，无氧糖酵解，使乳酸量迅 速增加。短时剧烈运动后血乳酸降低的幅度是判断疲劳消除速度、机体恢复程度的重要指 标之一。

表11 松茸浓缩口服液对血乳酸含量影响

注：*表示P＜0.05水平的差异显著。

从表11中可以发现，在灌胃松茸浓缩口服液7d后，试验组与对照组无明显变化。 14d与21d后，试验组小鼠血清中血乳酸含量明显低于对照组组，分别降低了21％和29％， 有显著性差异(P＜0.05)，随着灌胃时间的增加，血清中血乳酸含量呈明显的下降趋势。

3.3.3对小鼠血清尿素氮含量的影响

血尿素含量的变化可说明体内含氮物质分解代谢状况，较长时间运动、激烈运动及强 体力劳动后会使血尿素含量增高。当能量平衡遭到破坏时，蛋白质和含氮化合物的分解代 谢加强，伴随着尿素的形成增加，机体尿素氮含量随劳动或运动负荷的增加而增加，机体 对负荷适应能力越差，血尿素氮增加就越明显。血尿素含量对于机体在负荷时的反应是一 个灵敏的指标，因此通过减少蛋白质的分解，降低血清尿素氮水平，可提高对运动负荷的 适应能力。

表12 松茸浓缩口服液对血清尿素氮含量影响

注：**表示P＜0.01水平的差异显著。

从表12中可以发现，在灌胃松茸浓缩口服液7d后，对照组与试验组血清中尿素氮 含量基本不变，14d与21d后，对照组与试验组相比血清尿素氮含量均明显下降，分别 下降了38％和49％，差异极其显著(P＜0.01)。

本实施例考察了松茸浓缩口服液对小鼠免疫调节作用、抗氧化活性以及抗疲劳功能的 影响。结果表明，小鼠力竭游泳时间有所提高，但差异不明显；胸腺指数、脾脏指数、巨 噬细胞吞噬功能、丙二醛和超氧化物歧化酶含量在灌胃21d后有显著性提高或降低，差 异显著(P＜0.05)；血清IgG含量和血清中尿素氮含量从灌胃后14d后就出现极其显著 的差异(P＜0.01)。从而可以初步认为松茸浓缩口服液对小鼠的免疫调节能力、抗氧化 活性及抗疲劳功能都有一定的增强作用。

4、松茸浓缩口服液功能性验证结果分析

4.1、免疫功能验证

本试验以小鼠的胸腺指数、脾脏指数、血清IgG含量和巨噬细胞吞噬能力为检测指 标。研究结果显示，灌胃松茸浓缩口服液组小鼠与生理盐水组小鼠比较，胸腺指数和脾脏 指数呈上升趋势，且当灌胃21d时试验组小鼠胸腺指数与脾脏指数均显著上升(P＜0.05)， 表明松茸浓缩口服液能有效的促进小鼠胸腺与脾脏的发育。在研究小鼠血清中IgG含量 和巨噬细胞吞噬能力时发现，试验组IgG含量均高于对照组，在灌胃14d及21d时， 差异极其显著(P＜0.01)。而巨噬细胞吞噬能力则在灌胃后21d产生显著性差异(P＜ 0.05)。可以初步说明，松茸浓缩口服液能显著提高小鼠的免疫调节能力，与其他研究结 果一致。

4.2、抗氧化功能验证

通过本试验研究发现，对照组与试验组相比，试验组小鼠血清中MDA含量均低于对 照组，且随着灌胃时间的增加，MDA含量显著下降，在灌胃21d后对照组与试验组存 在及其显著性差异(P＜0.01)。这可能是因为松茸中的营养物质在生物体内直接参与猝灭 自由基的途径，并通过参与调动或激活机体的内源性抗氧化剂，使其数量增大和活性增强 到机体需要的水平，从而避免或减轻自由基对机体的损伤。而试验组中小鼠血清的SOD 活力虽然高于对照组，但是在灌胃7d和14d时并无明显差异，当灌胃21d后，试验组 小鼠血清内的SOD活力才明显高于对照组，存在明显差异(P＜0.05)。这可能是由于松 茸浓缩口服液虽然可以提高血清内SOD活力，但是提高SOD活力的能力与修复受损细胞 并不能快速的完成，而需要较长时间的累积作用。综上可知，通过较长时间灌胃松茸浓缩 口服液，小鼠的抗氧化能力得到了显著性的提高，与其他研究结果一致。

4.3、抗疲劳功能验证

通过小鼠力竭游泳后发现，对照组与试验组相比较，小鼠力竭游泳的时间虽然有提高， 但是并没有明显的差异，这可能是由于试验小鼠数量较少，灌胃时间短，个体间的差别不 大造成的。而小鼠血清中血乳酸含量与BUN浓度均有所下降，在灌胃松茸浓缩口服液14 d后，就开始有显著(P＜0.05)和及其显著(P＜0.01)的差异。松茸中含有皂甙、多糖、 黄酮、多种氨基及酸、硒、锌、铜等多种微量元素，其中皂苷可以增加肌糖原储存以提供 运动所需的能量，也可增加LDH活性，加速乳酸代谢，防止乳酸在体内聚集；糖类是主 要的能量物质，其供应不足时会通过蛋白质分解供能，进而产生大量尿素氮并释放到血液 中，BUN含量正是糖类供能充足与否的衡量标准，BUN清除效率与运动产生的肌肉疲劳 效应呈负相关；黄酮类物质，能降低蛋白质的分解速度，增强蛋白质的合成能力，以及促 使胰岛素水平升高有关。正是由于松茸浓缩口服液中营养物质丰富，所以松茸浓缩口服液 可以增强小鼠抗疲劳性并对小鼠疲劳有一定的缓解作用，与其他研究结果一致。