抑制多酚氧化酶的高活性美拉德流份及其分离方法

摘要

本发明公开了一种抑制多酚氧化酶的高活性美拉德流份及其分离方法，具体按照以下步骤实施：(1)美拉德反应产物制备，透析及萃取获得小分子量且极性在乙醇范围的流份；(2)正相硅胶柱分离；(3)凝胶柱分离；(4)阴离子交换柱静态吸附，最后获得抑制多酚氧化酶的高活性流份。该流份活性好、稳定性高、色泽浅、无风味，能有效控制易褐变果蔬及海产品在保鲜与加工中的酶促褐变，同时宜用于化妆品中作为美白剂。

说明书

技术领域

本发明属于食品技术领域，具体涉及一种抑制多酚氧化酶的高活性美拉 德流份，本发明还涉及一种抑制多酚氧化酶的高活性美拉德流份的分离方 法。

背景技术

食品体系，如苹果、香蕉、梨、土豆、莲藕、对虾等，易发生酶促褐变。 引起食品体系酶促褐变的关键因子便是多酚氧化酶(PPO)。多酚类底物与 多酚氧化酶(PPO)的区室化被破坏之后，在有氧的情况下，多酚氧化酶(PPO) 便催化发生酶促褐变，使食品体系变黑。在食品体系中直接添加褐变抑制剂 因方便有效、应用范围广而历来被采用。亚硫酸盐等含硫制剂是系列高效且 低廉的褐变抑制剂。多年来，其在食品工业广泛被采用。然而，因其潜在的 安全性问题，FDA已经禁止了其在食品中的应用。因此，寻找适宜的替代物 正成为热点。

从作用机理的角度来讲，目前已被筛选的褐变抑制剂一般分为以下几种 类型：(1)自身具有还原作用的一类，如抗坏血酸及其类似物、含硫制剂。 其通过自身被氧化而达到遏制体系褐变的目的。(2)EDTA、DIECA等螯合 剂。其能螯合PPO所需的Cu²⁺从而抑制PPO的活性。(3)能和反应体系中 的一些物质形成复合物的复合剂，如环糊精、壳聚糖等。环糊精的疏水腔能 与疏水基团的多酚氧化酶底物形成包合物，而壳聚糖自身带的负电荷能与带 正电荷的物质形成复合物，半胱氨酸等硫醇化合物和醌结合形成稳定的无色 化合物。(4)抗坏血酸、柠檬酸、磷酸等酸化剂。通过降低体系pH，使多 酚氧化酶远离最适pH。(5)酶抑制剂。酶抑制剂又分为两种，竞争性抑制 剂和非竞争性抑制剂。如苯甲酸和4-己基间苯二酚是竞争性抑制剂，而蜂蜜 中的多肽以及大蒜提取物对多酚氧化酶活性具有非竞争性抑制作用。有一些 抑制剂的作用机理有几种，如曲酸既能和醌结合，又能起到抑制多酚氧化酶 活性的作用。抗坏血酸、4-羟基己基间苯二酚等非硫抗褐变剂在商业应用上 已取得了一定的成功。然而，抗坏血酸属于消耗性的，其有效作用时间有限， 4-羟基己基间苯二酚已被确证安全性有问题。

总体来说，目前尚无焦亚硫酸盐等含硫制剂的有效替代剂。最新研究显 示，部分美拉德产物具有极强(效果和焦亚硫酸盐等含硫制剂等同或接近) 的抑制食品体系酶促褐变的作用(Billaud,et al.,2005)。美拉德反应产物是复 杂的混合物，包含很多有色和无色的物质，这些物质具有很宽广的极性范围 和分子量范围。Wu,et al(2008)指出，美拉德产物作为褐变抑制剂时还存在 一些局限性，如活性流份不稳定、色泽偏深、风味较强等特点。因此，通过 对美拉德产物中活性流份进行分离纯化，去除其中的不良流份，富集、纯化 其中的活性流份已成为一个研究热点。针对上述问题，已有一些针对性研究 开展。Wijewickreme,et al(1997)采用制备型反向HPLC对美拉德产物中的 抗氧化成分进行了初步的分离，而Wu,et al(2008)采用C₁₈柱子对酪氨酸酶 (多酚氧化酶的一种)具有抑制作用的流份进行了分离而纯化，发现得到的 纯化单流份不具有抑制活性，而部分具有活性的混合多流份因为极性太高， 未能进一步实现有效纯化。活性碳和C₁₈胶柱(Sep-Pak Cartridge C₁₈)被用 于美拉德产物的脱色，同时结果显示，脱好色的美拉德产物同时散失了大部 分抑制草虾中PPO的能力(Matmaroh,et al.,2005)。从上述文献不难看出，美 拉德产物中的抑制PPO的高活性流份的分离纯化及表征是件非常具有挑战 性的工作。

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供抑制多酚氧化酶的高 活性美拉德流份，同时对高活性流份进行相关表征。

本发明的另一目的还在于提供一种上述的抑制多酚氧化酶的高活性美 拉德流份的分离方法。

本发明所采用的第一技术方案是，一种抑制多酚氧化酶的高活性美拉德 流份，其以葡萄糖或木糖与半胱氨酸及其衍生物或谷胱甘肽及其衍生物的混 合物溶液为原料。

本发明所采用的第二技术方案是，一种上述的抑制多酚氧化酶的高活性 美拉德流份的分离方法，具体按照以下步骤实施：

(1)调节原料的pH值为1～3，在温度105～115℃条件下反应1h～2.5 h，反应结束，进行透析得到低分子量的美拉德产物，冷冻干燥后以乙醇萃 取；

(2)将步骤(1)中得到的美拉德产物进行硅胶柱层析，收集对多酚氧 化酶的抑制率最强的流份；

(3)将步骤(2)中得到的流份进行葡聚糖凝胶柱层析，收集对多酚氧 化酶的抑制率最强的流份；

(4)将步骤3中的组份进行阴离子交换树脂的静态吸附，连续用pH8～1 的水溶液进行连续解吸，得到pH为4、3、2、1时解吸下来的流份或其任意 合并液皆具有高活性。

本发明的特点还在于，

优选使用透析袋或超滤膜进行透析，孔径小于或等于3500U。

硅胶柱层析的洗脱剂选自不同比例的氯仿、甲醇、水以及它们的组合。

硅胶柱层析的洗脱剂为梯度溶剂，具体为氯仿：甲醇＝1:1～8，纯甲醇， 甲醇:水＝9～1:1；或者，洗脱剂为甲醇:水＝4～1:1。

葡聚糖凝胶柱层析的洗脱剂选自甲醇、乙醇或水以及它们的组合。

葡聚糖凝胶柱层析的洗脱剂为甲醇:水＝3～1:1；或者洗脱剂采用梯度溶 剂，具体为氯仿：甲醇＝1:1～5，纯甲醇，甲醇:水＝4～1:1。

上述美拉德流份或分离方法制备得到的美拉德流份用于抑制果蔬、海产 品等褐变的用途。

上述美拉德流份或分离方法制备得到的美拉德流份用于化妆品添加剂 的用途。

本发明的有益效果是：通过本发明中提到的方法，能将美拉德产物中的 高活性、稳定性好、色泽浅、无风味的高效流份进行有效的分离和纯化，得 到的高活性流份的IC₅₀(按摩尔浓度算)要远低于焦亚硫酸盐等含硫制剂。

附图说明

图1是本发明实施例1中正相硅胶柱不同流份的薄层层析；

图2是本发明实施例1中正相硅胶柱不同流份的浓缩状；

图3是本发明实施例1中Sephadex LH-20层析柱不同流份的薄层层析；

图4是本发明实施例1中Sephadex LH-20层析柱不同流份的浓缩状；

图5是本发明实施例1中不同浓度的pH＝2解吸液对PPO的抑制率；

图6是本发明实施例1中pH＝2解吸液的MRPs对PPO的抑制类型和抑 制常数的测定；

图7是本发明实施例1中pH＝2解吸液的分析型高效液相色谱图；

图8是本发明实施例1中pH＝2解吸液的质谱图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明提供一种抑制多酚氧化酶的高活性美拉德流份，其以葡萄糖或木 糖与半胱氨酸及其衍生物或谷胱甘肽及其衍生物的混合物溶液为原料。通过 实施例1-3分离得到目标流份，改变了分离纯化顺序的案例为实施案例4。

实施例1：

步骤1、美拉德产物的制备

配制浓度均为1mol/L的葡萄糖与半胱氨酸盐酸盐溶液，两种溶液等体 积混合，用NaOH溶液调节混合液pH值为2。然后将混合液置于压力反应 釜中，在温度为110℃条件下反应1h。反应结束后，待反应产物冷却，采 用截留分子量为3500u的透析袋对对MRPs进行透析，4℃下放置24h,中 间换三次水，得到两种物质分别为MW>3500u和MW<3500u的MRPs，冷 冻干燥以备待用。选择MW<3500u的MRPs，料液比为1:50，用无水乙醇， 摇床提取，提取次数为3次，冷冻干燥以备用；

步骤2、硅胶柱层析

称取95％乙醇萃取的MRPs与等重的粗硅胶搅拌均匀，所得干粉即为上 样样品。再称取细硅胶，氯仿装柱，干法上样，采用梯度溶剂(氯仿：甲醇 ＝1:2，氯仿：甲醇＝1:4，纯甲醇，甲醇:水＝9:1，甲醇:水＝4:1，甲醇:水＝3:2) 洗脱，分管收集不同的流份，显色合并及活性追踪。

步骤3、葡聚糖凝胶柱层析

甲醇溶剂溶胀葡聚糖凝胶24小时后待用，将从步骤2中得到的最高活 性(同时兼具高稳定性)的样品用少量溶剂溶解，过滤除去杂质，以甲醇: 水＝3:2作为洗脱剂，常压过柱，分管收集不同的流份，显色合并及活性追 踪。

步骤4、阴离子静态吸附

称取一定量阴离子树脂置于50mL锥形瓶中，加入浓度为5mg/mL的 从步骤3中得到的高活性流份(兼具高稳定性)，控温摇床中震荡至平衡状 态。抽干，收集所得滤液。然后依次用pH为8、7、6、5、4、3、2、1的水 溶液解吸，置于恒温摇床中振荡。将各个所得滤液真空浓缩，称其质量，并 进行多酚氧化酶抑制活性的测定。活性及稳定性测试结果见表1。

表1实施案例1中流份的活性及稳定性

实施例2：

步骤1、美拉德产物的制备

配制浓度均为1mol/L的葡萄糖与谷胱甘肽盐酸盐溶液，两种溶液等体 积混合，用NaOH溶液调节混合液pH值为3。然后将混合液置于压力反应 釜中，在温度为115℃条件下反应2h。反应结束后，待反应产物冷却，采 用1000u的超滤膜对MRPs进行膜过滤，4℃下放置24h,中间换三次水， 得到两种物质分别为MW>1000u和MW<1000u的MRPs，冷冻干燥以备待 用。选择MW<1000u的MRPs，料液比为1:50，用无水乙醇，摇床提取， 提取次数为3次，冷冻干燥以备用；

步骤2、硅胶柱层析

称取无水乙醇萃取的MRPs与等重的粗硅胶搅拌均匀，所得干粉即为上 样样品。再称取细硅胶，氯仿装柱，干法上样，采用梯度溶剂(氯仿：甲醇 ＝1:1.5，氯仿：甲醇＝1:3.5，纯甲醇，甲醇:水＝9.5:1，甲醇:水＝4.5:1，甲醇: 水＝3.5:2)洗脱，分管收集不同的流份，显色合并及活性追踪。

步骤3、葡聚糖凝胶柱层析

甲醇溶剂溶胀葡聚糖凝胶24小时后待用，将从步骤2中得到的最高活 性(同时兼具高稳定性)的样品用少量溶剂溶解，过滤除去杂质，以甲醇: 水＝2:1作为洗脱剂，常压过柱，分管收集不同的流份，显色合并及活性追 踪。

步骤4、阴离子静态吸附

取一定量阴离子树脂置锥形瓶中，加入浓度为8mg/mL的从步骤3中得 到的高活性流份(兼具高稳定性)，控温摇床中震荡至平衡状态。抽干，收 集所得滤液。依次先用pH为5、1的水溶液解吸，置于恒温摇床中振荡。将 各个所得滤液真空浓缩，称其质量，并进行多酚氧化酶抑制活性的测定。活 性及稳定性测试结果见表2。

表2实施案例2中流份的活性及稳定性

实施例3：

步骤1、美拉德产物的制备

配制浓度均为1mol/L的葡萄糖与谷胱甘肽盐酸盐溶液，两种溶液等体 积混合，用NaOH溶液调节混合液pH值为3。然后将混合液置于压力反应 釜中，在温度为115℃条件下反应2h。反应结束后，待反应产物冷却，采 用1000u的超滤膜对MRPs进行膜过滤，4℃下放置24h,中间换三次水， 得到两种物质分别为MW>1500u和MW<1500u的MRPs，冷冻干燥以备待 用。选择MW<1500u的MRPs，料液比为1:50，用无水乙醇，摇床提取， 提取次数为3次，冷冻干燥以备用；

步骤2、硅胶柱层析

称取90％乙醇萃取的MRPs与等重的粗硅胶搅拌均匀，所得干粉即为上 样样品。再称取细硅胶，氯仿装柱，干法上样，采用梯度溶剂(氯仿：甲醇 ＝1:2.2，氯仿：甲醇＝1:4.5，纯甲醇，甲醇:水＝9:1.2，甲醇:水＝4:1.2，甲醇: 水＝3:3)洗脱，分管收集不同的流份，显色合并及活性追踪。

步骤3、葡聚糖凝胶柱层析

甲醇溶剂溶胀葡聚糖凝胶24小时后待用，将从步骤2中得到的最高活 性(同时兼具高稳定性)的样品用少量溶剂溶解，过滤除去杂质，以氯仿: 甲醇＝1:1，氯仿:甲醇＝1:3，氯仿:甲醇＝1:5，纯甲醇，甲醇:水＝8:1，甲醇:水 ＝4:1，甲醇:水＝3:2进行梯度洗脱，常压过柱，分管收集不同的流份，显色合 并及活性追踪。

步骤4、阴离子静态吸附

取一定量阴离子树脂置锥形瓶中，加入浓度为8mg/mL的从步骤3中得 到的高活性流份(兼具高稳定性)，控温摇床中震荡至平衡状态。抽干，收 集所得滤液。依次用pH为7.5、6.5、5.5、4.5、3.5、2.5、1.5、0.5的水溶液 解吸，置于恒温摇床中振荡。将各个所得滤液真空浓缩，称其质量，并进行 多酚氧化酶抑制活性的测定。活性及稳定性测试结果见表3。

表3实施案例3中流份的活性及稳定性

实施例4：

步骤1、美拉德产物的制备

配制浓度均为1mol/L的木糖与谷胱甘肽盐酸盐溶液，两种溶液等体积 混合，用NaOH溶液调节混合液pH值为1.5。然后将混合液置于压力反应 釜中，在温度为105℃条件下反应2.5h。反应结束后，待反应产物冷却， 采用截留分子量为3500u的透析袋对对MRPs进行透析，4℃下放置24h， 中间换三次水，得到两种物质分别为MW>3500u和MW<3500u的MRPs， 冷冻干燥以备待用。选择MW<3500u的MRPs，料液比为1:50，用无水乙 醇，摇床提取，提取次数为3次，冷冻干燥以备用；

步骤2、阴离子静态吸附

取一定量阴离子树脂置锥形瓶中，加入浓度为5mg/mL的从步骤1中得 到的无水乙醇萃取的MRPs，控温摇床中震荡至平衡状态。抽干，收集所得 滤液。然后依次用pH为8、7、6、5、4、3、2、1的水溶液解吸，置于恒温 摇床中振荡。将各个所得滤液真空浓缩，称其质量，并进行多酚氧化酶抑制 活性的测定。

步骤3、硅胶柱层析

称取步骤2得到的最高活性(同时兼具高稳定性)的样品与粗硅胶拌匀， 所得干粉即为上样样品。再称取细硅胶，氯仿装柱，干法上样，采用梯度溶 剂(氯仿：甲醇＝1:2，氯仿：甲醇＝1:4，纯甲醇，甲醇:水＝9:1，甲醇:水＝4:1， 甲醇:水＝3:2)洗脱，分管收集不同的流份，显色合并及活性追踪。

步骤4、葡聚糖凝胶柱层析

甲醇溶剂溶胀葡聚糖凝胶24小时后待用，将从步骤3中得到的高活性 流份(兼具高稳定性)，用少量溶剂溶解，过滤除去杂质，以甲醇:水＝3:2作 为洗脱剂，常压过柱，分管收集不同的流份，显色合并及活性追踪。活性及 稳定性测试结果见表3。

表4实施案例4中流份的活性及稳定性

高活性流份的性质表征(以实例1为例)：

(1)IC₅₀测定以及抑制类型和抑制常数的测定；

(2)分析型HPLC；

色谱条件(色谱柱:Agilent C18柱(100mm×4.6mm，3.5μm)；流动相： 乙腈-水，比例为10:40(v/v)检测波长:230nm；柱温:25℃；进样量:10μl；流 速:0.8mL·min-1)；

(3)基质辅助激光解析电离飞行时间质谱

将得到的较纯流份进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF MS)分析鉴定；

1)通过步骤2正相硅胶柱，无水乙醇MRPs用(氯仿:甲醇＝1:2，氯仿: 甲醇＝1:4，纯甲醇，甲醇:水＝9:1，甲醇:水＝4:1，甲醇:水＝3:2)洗脱液梯度洗 脱，得到的7个流份对多酚氧化酶的抑制率见表1的第一步。由表1可见， 得到的7个流份中对多酚氧化酶的抑制作用最强的是A抑制率达到80％以 上。通过稳定性的测定发现，A不仅活性很高，并且具有很好的稳定性，而 B虽然最初也具有很好的活性，抑制率达到68.75％，但是经过一段时间的 放置后，活性降低甚至有激活作用。其他流份对多酚氧化酶的抑制率是负值， 表明它们对多酚氧化酶不但没有抑制作用，反而具有激活作用。因此，选择 流份A进行第二次柱层析。通过点板发现，大多数物质集中在前面部分，这 与抑制率的测定也是一致的(见图1)。通过浓缩物的颜色对比发现，前5 个流份的颜色呈现深橙黄色，后面两个流份的颜色呈黑褐色(见图2和图3)。

将A分成两部分，选取一半过Sephadex LH-20层析柱，得到的5个流 份对多酚氧化酶的抑制率见表1的第二步。由表1可见，得到的5个流份中， 对多酚氧化酶的抑制作用最强的是D，抑制率达到90％以上，其次是C和E， A和B对多酚氧化酶的抑制率是负值，表明它们对多酚氧化酶不但没有抑制 作用，反而具有激活作用。通过测定稳定性发现，经过一段时间的放置后各 个流份对多酚氧化酶的作用都是比较稳定的。通过浓缩物的颜色对比发现， 经过葡聚糖凝胶柱层析后，得到的流份颜色变浅为黄色(见图4)。

将过Sephadex LH-20层析柱得到的D流份平均分成两部分，选取第一 部分作为阴离子静态吸附的样品，得到的8个流份对多酚氧化酶的抑制率见 见表1的第三步。由表1可见，通过降低pH值洗脱得到的8个流份中，pH＝2 解吸液解吸下来的流份2，具有最好的抑制多酚氧化酶活性，抑制率高达 97.10％，同时该流份具有较好的稳定性。

如图5所示，以Lineweaver-Burk双倒数作图，判断抑制剂的抑制类型， 均得到一组平行的直线，pH＝2解吸液解吸的流份既影响米氏常数(K_m)，又 影响最大反应速度(V_m)，K_m、V_m值均随着pH＝2解吸液的浓度的增大而减 小，其抑制机理表现为反竞争性抑制类型，说明抑制剂只能与酶-底物络和 物(ES)结合，而不与游离酶结合，对酶活力的效应属于反竞争性抑制类型。 以不同浓度测定的K_m值对抑制剂浓度作图(图6)为一条直线，从直线的斜率 可以求得抑制常数(K_IS)。pH＝2解吸液解吸的流份对多酚氧化酶的抑制常数 为K_IS＝0.356mg/ml。

以乙腈和水(乙腈:水＝10:40,v/v)作试剂空白,在UV1800紫外分光光度 计上测定pH＝2解吸液的紫外吸收光谱，表明它在230nm处有较强吸收,故 选择230nm作为高效液相色谱测定波长。由图7可知，将pH＝2洗脱液得 到的洗脱流份用C₁₈柱分析型高效液相色谱进行进一步分析，该条件下得到 的峰型较好，保留时间为1.294min。

通过正相硅胶柱层析，葡聚糖凝胶柱层析，阴离子静态吸附，得到活性 最好流份pH＝2解吸液。它对多酚氧化酶的半数抑制为IC₅₀＝29.252μg/ml， 对多酚氧化酶的抑制类型为反竞争性抑制。通过MALDI-TOF/MS分析，该 活性物质的分子量分别为694和862u左右(图8)。

通过本发明中提到的方法，能将美拉德产物中的高活性、稳定性好、色 泽浅、无风味的高效流份进行有效的分离和纯化，得到的高活性流份的IC₅₀(按摩尔浓度算)要远低于焦亚硫酸盐等含硫制剂。

本方法通过对小于3500u的MRPs进行乙醇萃取，将萃取物通过硅胶柱 层析，收集最先洗脱下来的流份，通过放置不同时间(0h，24h，48h)后 对PPO的抑制率数据可以看出，其活性最好，且稳定性最好，同时其颜色 在所有流份中是最浅的。硅胶柱层析洗脱流份的极性是由小到大。说明，通 过此步骤得到了乙醇萃取物中的极性最小的部分。接着，通过凝胶过滤，将 步骤2中得到的最好流份通过分子筛效应进行进一步的分离，得到了5个流 份，其中第一个和第二个流份不具有活性，且第一个流份的颜色很深，后三 个流份，具有活性，其中，第三个流份和第四个流份的活性都较高，且颜色 很浅，但第四个流份的稳定性更好。第五个流份具有一定的活性，但同时颜 色很深。通过步骤3进一步得到了活性高、稳定性好、颜色浅的高活性流份。 分子筛洗脱下来的流份，分子量呈先大后小的趋势，可见，最好部分(第四 个流份)的分子量偏小。步骤4中，采用的是阴离子交换树脂，从原理上讲， 是依据活性流份中的化合物带电荷量不同进行进一步分离和纯化的。考虑到 用盐离子洗脱会引入新的外源离子，因此，采用不同pH值的洗脱液进行洗 脱。pH洗脱液越低，说明吸附在树脂中的化合物和树脂的吸附作用越强， 其带的电荷越多。结果显示，pH2时洗脱得到的流份的活性最强，同时具有 很好的稳定性和浅的色泽。依次，本美拉德流份可用于抑制果蔬、海产品等 褐变，并且可以用于化妆品添加剂。

本方法中，关键的参数是几种柱层析的先后顺序(先后从极性、分子量 大小、带电荷量三个不同的角度进行分离和纯化)及该固定顺序下的参数范 围。采用这几种柱子的优点是：充分挖掘MRPs中的流份间可能存在的不同 性质，并且考虑到分离后的活性跟踪可操作性。其次，首次报道了具有较强 活性和稳定性且纯度较高的MRPs流份。如果对该专利中的方法进行任何替 换，都不能达到上述效果。