新型合成-调控sRNA及其制备方法

摘要

本发明涉及一种降低原核生物中基因表达的新型的定制合成sRNA，其制备方法及其应用，尤其涉及一种合成sRNA，其包括源自MicC、SgrS和MicF中任何一种的sRNA的Hfq结合位点和与靶基因mRNA成碱基对的区域，还涉及该合成sRNA的制备方法及其应用。本发明的合成sRNA的优点在于，可通过调控合成sRNA与靶基因mRNA的结合能力来控制靶基因的抑制程度。利用调控靶基因表达的合成sRNA，能够无需传统的基因缺失方法而有效构建重组微生物并能够降低靶基因的表达，因而合成sRNA对重组微生物的生产很有用。此外，合成sRNA可快速应用至各种菌株，因而非常适合测定菌株的代谢能力以及选择最适菌株。此外，通过利用合成sRNA操控代谢通量得到的并高效生产酪氨酸或尸胺的重组微生物在医药和工业领域非常有用。换句话说，利用本发明的sRNA可使选择表达将被抑制以用于高效生产代谢产物的靶基因变得容易。因此，合成sRNA可用于构建有效生产各种代谢产物的重组菌株以及用于建立生产各种代谢产物的有效方法，因而非常有用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种降低原核生物中基因表达的新型的定制sRNA，其制备 方法及其应用，尤其涉及一种合成的sRNA及其制备方法与应用，所述合成 的sRNA包括源自MicC、SgrS和MicF中的任何一种的sRNA的Hfq结合 位点以及与靶基因mRNA碱基配对的区域。

背景技术

近年来，全球对于环境问题和有限资源损耗的关注日益增加。作为解决 此类问题的可选方法，基于环境友好型和可再生的有机体生产体系的构建日 益引起人们的兴趣。可通过调控有机体的代谢途径，优化所需代谢产物的代 谢通量来构建这些体系，并且在该调控代谢途径的过程中需要多种分子生物 学技术。

调控代谢途径的方法包括增加生物合成过程所需的酶的表达以提高代谢 通量的方法，以及阻止用于细胞生长和生产其它代谢产物的代谢通量以及缺 失基因以生产所需代谢产物的方法。目前广泛应用的基因缺失方法是这样一 种方法，其中利用重组酶将待删除的基因置换为任何与其同源的序列，从而 导致基因功能丧失(Datsenko et al,PNAS,97(12):6640-6645,2000)。然而，这 种基因缺失方法存在以下问题。

首先，基因缺失所需时间相对较长。考虑到用同源序列置换染色体基因 所需的时间以及从染色体中移除抗生素抗性基因(用于筛选其中正常移除了 基因缺失的细胞)所需的时间，通常需要一周或更长的时间来移除一个基 因。与近年来快速发展的分子生物学技术相比，这种长的基因缺失时间与关 注于通过调控代谢途径来高效生产代谢产物的代谢工程的发展相冲突。

其次，基因缺失导致基因功能的完全丧失。这表明基因的表达水平不能 被调控至所需水平。为了在细胞内代谢途径中有效生产所需代谢产物，尝试 基因缺失来阻断进入代谢途径的代谢通量。然而，如果受阻的代谢通量产生 细胞生长所必需的物质，则基因缺失的细胞的生长将会被显著抑制或不会发 生。为了使所需代谢物的生产效率最大化，生产所需代谢产物的细胞应该很 容易生长，同时所需代谢物的代谢通量也应被最优化。因此，需要一种能够 通过调控基因表达水平来生产所需物质同时维持细胞生长的方法，而不是简 单地为了调节代谢通量而删除基因。

第三，通过传统的基因缺失方法从染色体删除的基因难以修复。此外， 如果尝试删除其它菌株中的相同基因，则所有的过程都需要重新尝试，因此 需要大量的时间和精力。

因此，为了克服传统基因缺失方法的局限性，应该可以无需改变菌株的 染色体序列而降低目的基因的表达水平。此外，应该可以调控基因的表达水 平并很容易地将对相同基因的表达调控应用于其它菌株。进一步，需要以快 速便捷的方式构建并应用基因调控体系。

因此，本发明人尝试利用满足上述要求的方法来构建短的定制合成的 sRNA。

目前已知总共有101种大肠杆菌sRNA(Pichon et al.,Nucleic Acids  Research,DOI:10.1093/nar/gkr1141,2011)，其机制目前正在研究中。目前已 报道，大量sRNA即使具有不同的序列也会形成特定的二级结构，Hfq蛋白 识别并结合到这些sRNA。Hfq的功能是增加sRNA的半衰期，这样即使仅 有少量sRNA也能有效地起作用，并且Hfq协助sRNA结合到靶mRNA， 以使靶mRNA能迅速起作用，并使RNase结合到靶mRNA，以促进靶 mRNA的降解，从而更有效地降低基因的表达。

一直在不断研究大肠杆菌sRNA的基本功能，但是关于利用上述机制来 构建合成sRNA的报道很少或没有。根据最近有关构建大肠杆菌sRNA的报 道，已经通过随机诱变和筛选构建了有效的sRNA(Sharma et al,ACS  Synthetic Biology,DOI:10.1021/sb200001q,2011)。

因此，为了克服传统基因缺失方法的局限性，本发明人已经做了大量努 力来构建一种新型的、短的定制合成sRNA，结果构建了一种合成sRNA， 其包括源自MicC、SgrS和/或MicF的Hfq结合位点以及与诸如DsRed2 mRNA、AraC mRNA、KanR mRNA或LuxR mRNA的靶mRNA同源的区 域，并发现对靶mRNA表达的测试结果显示，可不依赖传统的随机方法而 构建有效的sRNA。此外，本发明人构建了一种抑制tyrR(酪氨酸调控因 子)、csrA(碳储存调控因子)、pgi(葡萄糖-6-磷酸异构酶)、ppc(磷酸 烯醇丙酮酸羧化酶)等的表达的合成sRNA，并发现这些合成sRNA显示的 效果类似于实际的基因缺失的效果，这些合成sRNA可用于调控所需代谢产 物的生产，从而完成了本发明。

背景技术部分中描述的信息仅仅是为了加强对本发明背景的理解，可能 并不含有形成了本发明所属技术领域的普通技术人员已知的现有技术的信 息。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种新型的、短的定制合成sRNA，其制备方 法及其应用，所述合成sRNA克服了传统的基因缺失方法的局限性，并且可 用于高效调控各种靶基因的mRNA表达。

为了实现上述目的，本发明提供一种用于抑制原核生物中基因表达的 sRNA(小分子调控RNA)，所述sRNA包括：源自MicC、SgrS和MicF中的 任何一个的sRNA的Hfq结合位点以及与靶基因mRNA成碱基配对的区域。

本发明还提供一种编码sRNA的分离的核酸。

本发明还提供一种包括编码sRNA的分离的核酸的表达载体。

本发明还提供一种导入了sRNA的重组微生物。

本发明还提供一种用所述表达载体转化的重组微生物。

本发明还提供一种制备sRNA的方法，所述方法包括将编码与靶基因 mRNA成碱基配对的区域的核酸连接到编码源自MicC、SgrS和MicF中的任 何一种的sRNA的Hfq结合位点的核酸。

本发明还提供一种抑制靶基因表达的方法，所述方法包括以下步骤：在 原核生物中导入或表达sRNA；以及抑制靶基因的mRNA的表达。

本发明还提供一种用于抑制原核生物中基因表达的组合物，所述组合物 包括sRNA。

本发明还提供一种用于筛选需要被缺失的基因以生产有用物质的方法， 所述方法包括以下步骤：

(a)对存在于用于生产有用物质的菌株并参与有用物质的生物合成途径 的基因中的至少一种基因，利用靶向所述基因的sRNA，抑制基因表达；以 及

(b)如果有用物质的产量通过抑制基因的表达而增加，则选择表达被抑 制的基因作为需要删除的基因，以生产有用物质。

本发明还提供一种改良用于生产有用物质的菌株的方法，所述方法包括 以下步骤：

(a)对存在于用于生产有用物质的菌株并参与有用物质的生物合成途径 的基因中的至少一种基因，利用靶向所述基因的sRNA，抑制基因表达；

(b)如果有用物质的产量通过抑制基因的表达而增加，则选择表达被抑 制的基因作为需要删除的基因，以生产有用物质；以及

(c)构建缺失了选定基因或选定基因的组合的重组菌株。

本发明还提供一种具有增强的生产酪氨酸能力的重组微生物，所述重组 微生物是通过使具有酪氨酸生物合成途径的宿主细胞中的tyrR和csrA基因的 功能失活而获得的。

本发明还提供一种能够生产苯酚/酚类的重组微生物，所述重组微生物 是通过在上述重组微生物中导入或扩增tpl基因而获得的。

本发明还提供一种生产具有增强的生产酪氨酸的能力的重组微生物的方 法，所述方法包括使具有酪氨酸生物合成途径的宿主细胞中的tyrR和csrA基 因的功能失活。

本发明还提供一种具有增强的生产尸胺能力的重组微生物，所述重组微 生物是通过使具有尸胺生物合成途径的宿主细胞中的选自以下基因中的至少 一种基因的功能失活而获得的：murE(UDP-N-乙酰胞壁酰丙氨酰-D-谷氨 酰-2,6-二氨基庚二酸连接酶)、metB(胱硫醚γ-合酶)、thrL(thr操纵子 前导肽)、ackA(丙酸激酶/乙酸激酶活性)、pdhR(丙酮酸脱氢酶复合物 调控因子)、ilvG_1(乙酰乳酸合酶II、大亚基、N-ter片段(假基 因))、carB(氨甲酰磷酸合成酶)、serC(磷酸羟基苏氨酸转氨酶/3-磷 酸丝氨酸转氨酶)、ilvN(乙酰羟基丁酸乙酯合成酶/乙酰乳酸合成酶)、 Crp(CRP转录双向调控因子)、ilvD(二羟酸脱水酶)、ilvY(IlvY DNA- 结合转录双向调控因子)、glpK(甘油激酶)、glpF(甘油MIP通道)、 pta(磷酸乙酰转移酶)、tktA(转酮醇酶I)、hflD(溶原化调控因子)、 deoA(胸苷磷酸化酶/尿嘧啶磷酸化酶)、gadE(GadE控制参与谷氨酸依赖 体系的基因转录)、rbsK(核糖激酶)、ilvL(ilvGEDA操纵子前导肽)、 ilvC(乙酰羟酸还原异构酶)、accA(乙酰辅酶A羧基转移酶，α-亚基)、 ilvM(乙酰羟基丁酸酯合酶/乙酰乳酸合酶)、argB(乙酰谷氨酸激酶)、 thrA(天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶)、carA(氨甲酰磷酸合酶)、fbp (果糖-1,6-二磷酸酶)、rbsD(核糖吡喃酶)、panD(天冬氨酸脱氢 酶)、aspA(天冬氨酸脱氨酶)、rcsB(RcsB-BglJ DNA结合转录激活因 子)、ivbL(ilvB操纵子前导肽)、lexA(LexA抑制参与细胞DNA损伤应 答的几种基因的转录)、rbsA(核糖ABC转运蛋白)、murF(D-丙氨酰- D-丙氨酸加合酶)和thrC(苏氨酸合酶)。

本发明还提供一种生产具有增强的生产尸胺能力的重组微生物的方法， 所述方法包括使具有尸胺生物合成途径的宿主细胞中的选自以下基因中的至 少一种基因的功能失活：murE(UDP-N-乙酰胞壁酰丙氨酰-D-谷氨酰-2,6-二 氨基庚二酸连接酶)、metB(胱硫醚γ-合酶)、thrL(thr操纵子前导肽)、 ackA(丙酸激酶/乙酸激酶活性)、pdhR(丙酮酸脱氢酶复合物调控因 子)、ilvG_1(乙酰乳酸合酶II、大亚基、N-ter片段(假基因))、carB (氨甲酰磷酸合成酶)、serC(磷酸羟基苏氨酸转氨酶/3-磷酸丝氨酸转氨 酶)、ilvN(乙酰羟基丁酸乙酯合成酶/乙酰乳酸合成酶)、Crp(CRP转录 双调控因子)、ilvD(二羟酸脱水酶)、ilvY(IlvY DNA-结合转录双调控 因子)、glpK(甘油激酶)、glpF(甘油MIP通道)、pta(磷酸乙酰转移 酶)、tktA(转酮醇酶I)、hflD(溶原化调控因子)、deoA(胸苷磷酸化 酶/尿嘧啶磷酸化酶)、gadE(GadE控制参与谷氨酸依赖体系的基因转 录)、rbsK(核糖激酶)、ilvL(ilvGEDA操纵子前导肽)、ilvC(乙酰羟 酸还原异构酶)、accA(乙酰辅酶A羧基转移酶，α-亚基)、ilvM(乙酰羟 基丁酸酯合酶/乙酰乳酸合酶)、argB(乙酰谷氨酸激酶)、thrA(天冬氨 酸激酶/高丝氨酸脱氢酶)、carA(氨甲酰磷酸合酶)、fbp(果糖-1,6-二磷 酸酶)、rbsD(核糖吡喃酶)、panD(天冬氨酸脱氢酶)、aspA(天冬氨 酸脱氨酶)、rcsB(RcsB-BglJ DNA结合转录激活因子)、ivbL(ilvB操纵 子前导肽)、lexA(LexA抑制参与细胞DNA损伤应答的几种基因的转 录)、rbsA(核糖ABC转运蛋白)、murF(D-丙氨酰-D-丙氨酸加合酶)和 thrC(苏氨酸合酶)。

从下面的详细描述和所附的权利要求中，本发明的其他特征和实施方 式将是显而易见的。

附图说明

图1示出了筛选针对合成sRNA的有效功能的基本结构的过程。

图2示出了SgrS、MicF和MicF的序列、报告子DsRed2mRNA的序列 及其与RBS结合的互补序列。

图3是示出在MicC、MicF或SgrS与DsRed2RBS互补结合之后，对 DsRed2的表达抑制图表。

图4示出了与DsRed2结合的多种互补序列。

图5是示出在MicC的Hfq结合位点与结合到DsRed2的多种互补序列 结合之后，对DsRed2的抑制程度的图表。

图6示出了AraC、LuxR和KanR mRNA序列以及与连接到合成sRNA 以与其结合的RBS互补的序列。

图7是示出AraC、LuxR或KanR与抑制AraC、LuxR或KanR的合成 sRNA之间的交叉反应性的图表。

图8示出了利用mfold软件计算AraC、LuxR或KanR与构建成与 AraC、LuxR或KanR结合的合成sRNA之间的结合能的结果。

图9示出了在微生物中的酪氨酸生物合成途径。在图9中，绿色方框表 示过表达的基因，红色方框表示通过合成sRNA沉默的基因，以及Θ表示 除去反馈抑制。

图10是构建用于酪氨酸生产的质粒的示意图。

图11是示出通过扩增用于酪氨酸生产的与酪氨酸生物合成途径相关的 基因的表达，用合成sRNA抑制tyrR、ppc、csrA和pgi的表达，然后比较 在各种大肠杆菌菌株中酪氨酸的产量而获得的结果图表(pgi还包括表达被 调控的额外的合成sRNA(抗-pgi-D1、抗-pgi-D2))。

图12示出了S17-1和TOP10菌株根据抗-pgi、抗-pgi-D1和抗-pgi-D2 合成sRNA的生长曲线。

图13示出了抗-pgi、抗-pgi-D1和抗-pgi-D2结合序列。

图14是示出通过抗-tyrR、抗-csrA、抗-ppc、抗-pgi、抗-pgi-D1和抗- pgi-D2对S17-1和TOP10中靶基因的表达抑制的图表。

图15是示出S17-1(pTyr-a(抗-csrA)、pTyr-b(抗-tyrR))重组微生 物的发酵结果的图表。

图16是示出在各种大肠杆菌菌株中产生的苯酚的浓度的图表。

图17示出了在大肠杆菌中的尸胺生物合成途径。红色方框表示通过合 成sRNA沉默的靶基因。

图18是示出待转化以增加尸胺产量的质粒的示意图。

图19是示出在导入了合成sRNA之后尸胺的产量变化的图表(对照在 XQ56菌株中包含p15CadA质粒但不包含合成sRNA。对照中尸胺的浓度为 1.3g/L)。

图20是pWA载体的示意图。

图21是pR15CA载体的示意图。

图22示出了合成sRNA的作用原理。

图23示出了通过制备具有不同结合能的抑制DsRed2和LacZ基因表达 的合成sRNA，并检测使用合成sRNA是否将基因的表达调控至不同水平而 获得的实验结果。

图24示出了检测合成sRNA的导入是否抑制了微生物中的蛋白质表达 和细胞生长的实验结果。

图25示出了利用具有不同结合能的抗-csrA的酪氨酸产量的检测结果。

图26示出了在导入了抑制参与细胞主要代谢途径的基因的合成sRNA 之后，酪氨酸产量的测量结果。

图27示出了大肠杆菌中的尸胺生物合成途径以及被合成sRNA抑制时 所生产的尸胺的浓度。

图28示出了具有不同结合能的抗-murE合成sRNA对尸胺产量的影响 的测量结果。

图29示出了检测不同抗-murE合成sRNA是否影响MurE蛋白质的实际 产量的实验结果。

图30示出了含抗-murE的终菌株的发酵结果。

用于实施本发明的最佳实施方式

除非另有规定，否则本文使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发 明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。通常，本文使用的 术语是本领域众所周知并普遍使用的。

以下是在本发明的具体描述中使用的主要术语的定义。

如在此使用的，术语“sRNA(小分子RNA)”是指短的RNA，通常 长度为200个或更少个核苷酸，不翻译成蛋白质且通过互补结合有效抑制特 定mRNA的翻译。

如在此使用的，术语“核糖体结合位点(RBS)”是指核糖体与mRNA结 合以转录mRNA的位点。

如在此使用的，术语“基因”意在具有最广泛的含义，基因可编码结构 蛋白或调控蛋白。在这里，调控蛋白包括转录因子、热休克蛋白或参与 DNA/RNA复制、转录和/或翻译的蛋白。此外，表达将被抑制的靶基因可 呈现为染色体外元件。

一方面，本发明涉及一种新型的、短的合成调控sRNA。就是说，本发 明涉及一种用于抑制原核生物中的基因表达的sRNA(小分子调控 RNA)，所述sRNA包括：源自MicC、SgrS和MicF中的任何一种的 sRNA的Hfq结合位点；以及与靶基因mRNA成碱基配对的区域。

在本发明中，选择保证合成sRNA的稳定功能的结构，然后选择更有效 抑制靶mRNA表达的结合位点。此外，检测是否可以制备用于抑制除 DsRed2mRNA之外的其它靶mRNA的合成sRNA。进一步，进行交叉反应 试验，以检测所构建的sRNA能否抑制除靶mRNA之外的其它mRNA的表 达。因此，开发了一种根据本发明的新型的合成sRNA结构及其制备方法。

首先，考虑到合成sRNA的稳定功能并有效抑制靶基因的表达，建立与 Hfq结合的结构序列，从存在于大肠杆菌中的101个sRNA中选择一组符合 要求的sRNA结构候选物，进行连续筛选操作，从而最终选择三种sRNA (图1)。

选定的三种sRNA为MicC、SgrS和MicF。MicC与帮助离子或亲水性 物质通过大肠杆菌细胞膜的OmpC的mRNA结合。SgrS与存在于细胞膜中 且用来转移葡萄糖的PtsG蛋白的mRNA结合，并且MicF与膜蛋白OmpF 的mRNA结合并抑制膜蛋白OmpF的mRNA的表达，氨基酸、离子、糖等 穿过膜蛋白OmpF，且膜蛋白OmpF具有600Da或更小的分子量(Wadler et  al,PNAS,104(51):20254-20459,2007；Chen et al,J.Bacteriology,186(20):6689, 2004)。

在本发明的一个实施例中，除去所述三种sRNA与靶mRNA结合的位 点，并将sRNA构建成与DsRed2mRNA的RBS结合，以便测定sRNA抑 制表达的能力(图2)。在图2中，将各候选sRNA的靶mRNA结合序列用 下划线画出并用红色表示，并将其置换为由抗-DsRed2表示的序列。如在此 使用的，术语“DsRed2的RBS”是指被核糖体生理上覆盖的实际结合位 点，该位点结合到mRNA，使得其他蛋白质无法识别该位点。RBS被定义 为在3’端方向上从Shine-Dalgarno序列起点开始的36bp的区域。这可利用 先前的研究报道的结果预测出(Na et al.,BMC Systems Biology,4(1):71, 2010)。当利用SgrS的Hfq结合位点时，所构建的合成sRNA对DsRed2的 表达抑制86％，当利用MicF的Hfq结合位点时，所构建的合成sRNA对 DsRed2的表达抑制85％，当利用MicC的Hfq结合位点时，所构建的合成 sRNA对DsRed2的表达抑制90％(图3)。因此，在本发明中，优选利用 MicC的Hfq结合位点。

在本发明的另一个实施例中，通过实验检测位于靶基因的mRNA序列 的RBS周围的各个序列是否适合作为结合位点。具体地，从与靶mRNA的 RBS结合的合成sRNA，构建与RBS、RBS的一部分或与除RBS之外的区 域结合的合成sRNA，这些结合位点具有19至37个核苷酸的不同长度(图 4)。结果表明，与RBS的至少一部分结合的合成sRNA显示出至少90％的 抑制效果，而未与RBS结合的合成sRNA也具有47-90％的抑制效果(图 5)。换句话说，与RBS的至少一部分结合的sRNA显示出优异的表达抑制 效果。因此，在本发明中，与靶基因mRNA成碱基配对的区域可与靶基因 mRNA的所有RBS或部分RBS成碱基配对。如在此使用的，表述“与一部 分成碱基配对”是指以-30kcal/mol或更高的结合能与靶基因mRNA(约20 个核苷酸或更多)的RBS成碱基配对，也指与靶基因mRNA的一部分RBS 或位于RBS周围的区域成碱基配对，如图4所示。在这里，与RBS成碱基 配对的区域包括一个或多个核苷酸，优选为9个或更多个核苷酸。在本发明 中，当合成sRNA与除RBS之外的其他区域结合时，其效果会相对较低， 但该合成sRNA也可用于调控表达水平。同时，即使与靶基因mRNA成碱 基配对的区域具有19-37个核苷酸的不同长度时，根据本发明的sRNA也显 示出表达抑制效果。因此，与靶基因mRNA成碱基配对的区域可具有能够 与靶基因成碱基配对的最小尺寸。例如，所述区域可具有20-50个核苷酸的 长度，优选为19-37个核苷酸。

在本发明的另一个实施例中，发现当通过从与靶基因的mRNA成碱基 配对的区域缺失一个或两个核苷酸而形成不与靶基因的mRNA结合的位点 时，可调控对表达的抑制程度。因此，在本发明中，可通过在与靶基因的 mRNA成碱基配对的区域中缺失或置换一个或多个核苷酸而形成不与靶基 因的mRNA结合的位点。此外，还可通过在与靶基因的mRNA成碱基配对 的区域中插入或缺失一个或多个核苷酸而形成不与靶基因的mRNA结合的 位点。在这里，为了与靶基因的mRNA成碱基配对，应缺失、置换或插入 1-10个核苷酸，优选为1-5个核苷酸，以使结合能在-30kcal/mol与-13 kcal/mol之间。

在本发明的另一个实施例中，进行实验以检测合成sRNA是否不仅简单 地抑制靶mRNA的表达，而且还将表达调控至不同水平以将蛋白质的产量 调控至不同水平，从而更精确地调控细胞代谢途径。具体地，构建抑制 DsRed2基因表达的合成sRNA以及抑制lacZ基因表达的合成sRNA。此 外，合成sRNA被构建为以从0至-60kcal/mol范围内的结合能结合到各 mRNA，并测定各合成sRNA对靶mRNA表达的抑制程度(图23)。结果 可以看出，在约-10kcal/mol至-40kcal/mol的范围内，靶mRNA的表达线性 下降，在-40kcal/mol或更低处，表达未出现额外下降。这表明，当根据本 发明的合成sRNA被构建为以-10kcal/mol至-40kcal/mol范围内的结合能结 合到靶mRNA时，它可抑制靶mRNA的表达至期望水平。因此，在本发明 中，与靶基因mRNA成碱基配对的区域优选被构建为使得与靶基因mRNA 的结合能在-10kcal/mol至-40kcal/mol范围内。更优选地，与靶基因mRNA 成碱基配对的区域优选被构建为使得与靶基因mRNA的结合能在-20 kcal/mol至-40kcal/mol范围内。

同时，当合成sRNA被额外导入质粒以调控靶基因的表达并在细胞中 生成时，sRNA会通过利用细胞的能量源来干扰细胞的生长。因此，在本发 明的另一个实施例中，检测额外导入的合成sRNA是否对细胞生长和细胞内 蛋白表达有任何影响(图24)。将0个、1个、2个、3个和4个合成sRNA 导入具有ColE1复制起点的质粒，测定在质粒中DsRed2基因表达水平的变 化。结果可以看出，导入多达三个合成sRNA也不会影响DsRed2的表达 (图24b)。此外，测定导入0个、1个、2个、3个和4个合成sRNA是否 对细胞的生长速率有任何影响。在这种情况下，测定细胞的对数生长期的光 密度(600nm)，并将其拟合到以下细胞生长曲线方程，以计算单位时间的细 胞生长常数(k)：y＝y₀exp(k·t)，其中y₀是初始O.D.600值，t是时间。 结果可以看出，导入多达三个合成sRNA时，k值略有下降，但下降不显 著。这表明，导入多达三个合成sRNA不会显著影响细胞的生长(图 24c)。

在本发明的另一个实施例中，进行实验以检测能否基于上述构建合成 sRNA的方法来构建抑制其它靶mRNA的其它合成sRNA，以及其它合成 sRNA的抑制效果是否足够。例如，构建用于除DsRed2之外，抑制AraC、 KanR和LuxR mRNA的合成sRNA(图6)。将所构建的三个sRNA和三种 基因进行组合，检测各组合的表达抑制作用。对于该检测，将DsRed2蛋白 融合到各基因以发出红色荧光。实验结果表明，sRNA对靶mRNA的表达 抑制率是均匀的(80-86％)，且其它mRNA的表达与未使用合成sRNA的情 况没有差别。

对三个合成sRNA与各靶mRNA的之间的结合能进行评估。结果，与 想要的靶标的结合能在-53.7至-59.5kcal/mol的范围内，而与其它mRNA的 结合能在-12.2至-13.5kcal/mol的范围内。该分析结果表明，当与靶mRNA 的结合能在约-50kcal/mol或更低且与其它mRNA的结合能在-13kcal/mol或 更高时，sRNA能足以仅抑制期望靶标，而无交叉反应。换句话说，根据本 发明的方法构建的合成sRNA的特征在于，充分抑制靶mRNA的表达，而 不抑制其它mRNA的表达。

应该理解的是，能够从先前的研究报道的结果足以预测出转录的 mRNA的RBS，并且可从MicC(必要时，SgrS或MicF)构建合成sRNA 以结合到任何mRNA。

此外，对本领域普通技术人员显而易见的是，根据本发明的用于制备 sRNA合成的方法可以相同方式应用至除DsRed2、AraC、kanR和LuxR之 外的其它基因，这些基因包括在本发明的实施例内，因而本发明的范围并不 限于这些基因。此外，从上述研究结果表明的，可以以相同方式预测原核生 物中的RBS位点，且sRNA在原核生物中的进化是保守的，可以看出用于 制备合成sRNA的方法除大肠杆菌之外也可应用至其它原核生物，包括根瘤 菌(Rhizobium)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、红球菌 (Rhodococcus)、念珠菌属(Candida)、欧文氏菌(Erwinia)、肠杆菌 (Enterobacter)、巴氏杆菌(Pasteurella)、曼氏杆菌(Mannheimia)、放 线杆菌(Actinobacillus)、伴放线菌(Aggregatibacter)、黄杆菌 (Xanthomonas)、弧菌(Vibrio)、假单胞菌(Pseudomonas)、固氮菌 (Azotobacter)、不动杆菌(Acinetobacter)、劳尔氏菌(Ralstonia)、农 杆菌(Agrobacterium)、根瘤菌(Rhizobium)、红杆菌(Rhodobacter)、 单胞发酵菌(Zymomonas)、芽孢杆菌(Bacillus)、葡萄球菌 (Staphylococcus)、乳球菌(Lactococcus)、链球菌(Streptococcus)、乳 杆菌(Lactobacillus)、梭菌(Clostridium)、棒状杆菌 (Corynebacterium)、链霉菌(Streptomyces)、双歧杆菌 (Bifidobacterium)和圆杆菌(Cyclobacterium)。

在本发明中，源自MicC、SgrS和MicF中的任何一种的sRNA的Hfq 结合位点可依次位于与靶基因mRNA成碱基配对的区域，或可通过接头 (如核酸片段)连接到所述区域。如在此使用的，“成碱基配对”指在核酸 序列之间成碱基配对。与靶基因mRNA成碱基配对的区域可具有与靶基因 mRNA为约70-80％或更多，优选为约80-90％或更多，且甚至更优选为95- 99％或更多的序列互补性。

此外，本发明的sRNA可按照一般方法来合成，但不限于此。换句话 说，可经化学合成或酶促合成sRNA。

根据本发明的sRNA可包括化学修饰。化学修饰可以是在sRNA中的至 少一种核苷酸的核糖的2’位置的羟基被氢原子、氟原子、-O-烃基、-O-酰基 和氨基中的任何一种取代。此外，为提高递送sRNA的能力，化学修饰还可 以是羟基被-Br、-Cl、-R、-R′OR、-SH、-SR、-N3和–CN(R＝烃基、酰基或 亚烃基)中的任何一种取代。此外，化学修饰可以是至少一种核苷酸的磷酸 骨架被硫代磷酸酯形式、二硫代磷酸酯形式、磷酸烷基酯形式、氨基磷酸酯 形式和磷酸硼键形式中的任何一种取代。此外，化学修饰可以是包括在 siRNA中的至少一种核苷酸被LNA(锁核酸)、UNA(解锁核酸)、吗啉 和PNA(肽核酸)中的任何一种取代。

在另一方面，本发明涉及一种编码sRNA的分离的核酸，以及一种包括 所述编码sRNA的分离的核酸的表达载体。

在本发明中，“核酸”可以是RNA、DNA、稳定的RNA或稳定的 DNA。如在此使用的，术语“编码”是指编码sRNA以及与sRNA互补的 核酸序列。

如在此使用的，术语“载体”是指这样的DNA结构，其包含有效地连 接到能够影响DNA在合适的宿主中表达的合适的控制序列的DNA序列。 载体可以是质粒、噬菌体颗粒或仅仅是潜在的基因组插入物。一旦整合到合 适的宿主中，载体就会复制并独立于宿主基因组起作用，或在某些情况下， 整合到基因组本身。在本说明书中，“质粒”和“载体”有时可以交替使 用，因为质粒是最常用的载体形式。为了本发明的目的，优选使用质粒载 体。可用于这一目的的典型的质粒载体包括：(a)复制起点，通过这一复制 起点复制有效地发生，使得每个宿主细胞中生成数百个质粒载体；(b)抗生 素抗性基因，通过这一基因可筛选转化有质粒载体的宿主细胞；以及(c)可 插入外源DNA片段的限制性酶切位点。即使载体中不存在合适的限制性酶 切位点，也可利用传统的合成的寡核苷酸适体或接头，使载体与外源DNA 片段易于连接。连接之后，载体应转化到合适的宿主细胞中。可通过氯化钙 法或电穿孔容易地实现转化(Neumann,et al.,EMBO J.,1:841,1982)。作为根 据本发明的用于表达sRNA的载体，可使用本领域已知的表达载体。

当一个核苷酸序列与另一个核苷酸序列被布置成功能关系时，该核苷酸 序列被有效地连接。核苷酸序列可以是被连接成当它与控制序列结合时能够 表达基因(例如，转录激活蛋白)的基因和对照序列。例如，前序列或分泌 前导物的DNA在表达为参与多肽分泌的前蛋白时被有效地连接至DNA编 码多肽；启动子或增强子在影响序列的转录时有效地连接至编码序列；RBS 在影响序列的转录时有效地连接至编码序列，或者在布置成促进翻译时有效 地连接至编码序列。通常，术语“有效地连接”是指DNA连接的序列是连 续的，以及在分泌前导物的情形中是连续的且存在于读码框中。然而，增强 子不一定是连续的。这些序列之间的连接是通过在方便的限制性酶切位点处 进行连接来执行的。然而，当不存在该位点时，根据传统的方法使用合成寡 核苷酸适体或接头。

在又一方面，本发明涉及一种包括编码sRNA的分离的核酸的表达载体 转化的重组微生物。如在此使用的，术语“转化”是指DNA可作为染色体 之外的因子被复制或通过将DNA导入宿主内完成整个染色体而被复制。

当然，应理解的是，所有载体并不是发挥相同作用来表达本发明的 DNA序列。类似地，所有宿主并不是相对于相同的表达体系发挥相同作 用。然而，在不背离本发明的范围或承担过度的实验负担的情况下，本领域 的普通技术人员可从各种载体、表达控制序列和宿主中适当地选择。例如， 载体的选择必须考虑到宿主，因为载体必须在宿主中复制。特别地，还应考 虑载体的拷贝数、调控拷贝数的能力以及由相应载体编码的其它蛋白的表达 (例如，抗生素标记的表达)。

在又一方面，本发明涉及无需缺失基因来改变代谢途径的通量而有效地 抑制细胞内表达，从而增加了所需代谢产物的产量。在本发明的一个实施例 中，发现可通过利用合成sRNA抑制细胞内靶基因的表达来人工调控代谢途 径的通量，由此可在大肠杆菌中高效率地生产酪氨酸和酚类/苯酚。在本发 明的另一实施例中，发现利用相同的原理可在大肠杆菌中高效率地生产尸 胺。因此，本发明涉及一种抑制靶基因表达的方法，所述方法包括以下步 骤：在原核生物中导入或表达sRNA；以及抑制靶基因的mRNA表达。

优选地，可通过按照诱导物(如阿拉伯糖)结合而工作的启动子来诱导 sRNA的表达，或可通过温度敏感型转录因子(如cI)来抑制sRNA的表 达。具体地，为了正确表达合成sRNA，可利用外源诱导物和温度敏感型转 录因子对sRNA的表达进行双重调控。具体地，可通过噬菌体λ启动子PR 来表达合成sRNA，并且其表达无疑可通过从pBAD启动子表达温度敏感型 蛋白cI(ts2)而利用温度和阿拉伯糖浓度来控制。

根据本发明的sRNA可用于筛选需要缺失的基因以生产有用物质。用于 筛选需要缺失的基因以生产有用物质的方法包括以下步骤：(a)对存在于用 于生产有用物质的菌株中并参与有用物质的生物合成途径的基因中的至少一 种基因，利用靶向所述基因的sRNA，抑制基因表达；以及(b)如果有用物质 的产量通过抑制基因的表达而增加，则选择表达被抑制的基因作为需要缺失 的基因，以生产有用物质。如在此使用的，术语“缺失”旨在包括使目的基 因的一部分突变、置换或缺失，或向基因中导入一个或多个核苷酸，或导入 抑制目的酶的表达或活性的化学物质、基因或酶，从而抑制酶的活性。此 外，选定的待缺失的基因也可用于改良生产有用物质的菌株。在进一步的方 面，本发明涉及一种改良生产有用物质的菌株的方法，所述方法包括以下步 骤：

(a)对存在于用于生产有用物质的菌株中并参与有用物质的生物合成途 径的基因中的至少一种基因，利用靶向所述基因的sRNA，抑制基因表达；

(b)如果有用物质的产量通过抑制基因的表达而增加，则选择表达被抑 制的基因作为需要缺失的基因，以生产有用物质；以及

(c)构建缺失了选定基因或选定基因的组合的重组菌株。

在本发明的一个实施例中，发现当利用根据本发明的sRNA抑制tyrR和 csrA在具有酪氨酸生物合成途径的宿主细胞中的表达时，细胞中酪氨酸的产 量增加。在又一方面，本发明涉及一种具有增强的生产酪氨酸能力的重组微 生物，所述重组微生物是通过使具有酪氨酸生物合成途径的宿主细胞中的 tyrR和csrA基因的功能失活得到的。

如在此使用的，术语“功能失活”旨在包括使目的基因的一部分突变、 置换或缺失，或向基因中导入一个或多个核苷酸，或导入抑制目的酶表达或 活性的化学物质、基因或酶，从而抑制酶的活性。因此，使特定基因的功能 失活的方法不限于任何特定的方法，只需目的特定基因的活性和由基因编码 的酶的活性被常规方法抑制，所述方法包括通过反义RNA抑制表达、同源 重组、各种重组酶(λ重组酶等)表达的同源重组、以及利用逆转录酶和 RNA插入特测序列。

此外，在本发明的一个实施例中，构建重组质粒，所述重组质粒过表达 参与酪氨酸生物合成途径的以下基因(图10)：ppsA，编码 phenolpthiocerol合成I型聚酮合成酶A；tktA，编码转酮醇酶；aroG和 aroF，编码3-脱氧-7-磷酸庚酮合成酶；aroK，编码莽草酸激酶I；tyrA，编 码分支酸变位酶；以及tyrC，编码源自运动发酵单胞菌的预苯酸脱氢酶。 特别地，本发明提供一种通过对反馈抗性基因aroG和tyrA中的一个或多个 氨基酸残基进行定点诱变而构建的重组质粒，以增加酪氨酸代谢途径的激活 (aroG A146N and tyrA A354V/M53I,LutkeEversloh et al,Applied Microbiology  and Biotechnology,75:103,1999)。

将上述构建的重组质粒转化到14种不同的大肠杆菌菌株中，包括K-12 菌株(C600、DH5α、ER2925、JM110、MG1655、S17-1、T1R(One shot(R) ccdB SurvivalTM2T1R,Invitrogen)、TG1、TOP10、W3110、XL1-Blue)、 B菌株(BL21(DE3)、W菌株以及K-12菌株和B菌株杂交菌株(HB101)，然 后测定在各转化的菌株中的酪氨酸产量(图11)。

虽然本发明阐明了属于埃希氏菌属的14种微生物菌株，但是本发明的 范围不限于这14种微生物菌株，因为显而易见的是，本发明的合成sRNA 和重组质粒在以下菌株中同样起作用：大肠杆菌、芽孢杆菌、根瘤菌、双歧 杆菌、红球菌、念珠菌属、欧文氏菌、肠杆菌、巴氏杆菌、曼氏杆菌、放线 杆菌、伴放线菌、黄杆菌、弧菌、假单胞菌、固氮菌、不动杆菌、劳尔氏 菌、农杆菌、根瘤菌、红杆菌、单胞发酵菌、芽孢杆菌、葡萄球菌、乳球 菌、链球菌、乳杆菌、梭菌、棒状杆菌、链霉菌、双歧杆菌和圆杆菌。

可以看出，即使酪氨酸生物合成途径被相同的生物合成途径激活，各菌 株也会显示出不同的生产酪氨酸的能力。这表明，即使属于大肠杆菌物种的 菌株也具有不同的细胞内活性。因此，这表明，对于代谢工程，应检测所有 不同菌株中所需化合物的产量，以达到所需化合物的最大产量。相应地，可 以看出，难以按照传统的耗时的缺失方法通过修饰染色体序列来进行检测。 这样看来，以类似于基因缺失方法而无需修饰染色体序列的方式来降低靶基 因的表达的技术(即，根据本发明的合成sRNA技术)非常有用。

在本发明中，将靶向tyrR mRNA的抗-tyrR合成sRNA克隆到上述构建 的重组质粒中，以相同的方式检测合成sRNA在14种不同菌株中的作用。 将剩余的三个调控其他代谢通量的合成sRNA各克隆到相同的重组质粒中， 结合检测其作用(图11)。结果可以看出，当tyrR被抑制时，酪氨酸在大 多数菌株中的产量增加。然而，当额外导入抑制ppc或pgi表达的合成 sRNA时，酪氨酸的产量降低而不是增加。特别地，可以看出，当pgi的表 达被抑制时，大肠杆菌菌株的生长速率下降，因此，菌株中酪氨酸的总产量 下降。

在本发明中，对基因pgi的表达的抑制程度更加多样化，以在宿主细胞 的生长与酪氨酸的代谢通量之间取得平衡，从而增加酪氨酸的总产量。为 此，合成调控基因pgi的一部分结合序列被缺失，以降低结合能力。具体 地，如图13所示，将结合序列的一个或两个核苷酸缺失，然后观察细胞生 长和酪氨酸产量的变化。结果从图11可以看出，随着基因的抑制程度降 低，酪氨酸的产量增加，同时宿主细胞的生长速率也增加。对此，图12示 出了生产酪氨酸能力最高的S17-1菌株以及生产酪氨酸能力最低的TOP10 菌株。

通过本发明中进行的上述过程，发现基因tyrR和csrA的表达被抑制的 大肠杆菌菌株S17-1显示出最高的生产酪氨酸能力(2g/L)。

利用本发明构建的重组S17-1菌株进行发酵，结果表明，酪氨酸的产量 可高达21.9g/L(图15)。

为了验证所需化合物酪氨酸的产量即使对于相同的代谢工程也会随细胞 的代谢能力而变化，以及为了证明所构建的合成sRNA有效表达它的靶 RNA，对靶RNA在S17-1和TOP10菌株中表达的抑制程度进行测定(图 14)。结果表明，靶RNA在两种菌株中的表达被有效抑制约80-90％。这表 明，合成sRNA不管对何种菌株都显示出类似的抑制活性。

在本发明中，发现合成sRNA可用于调控代谢通量，由于它的优点在于 它不需要修饰染色体序列，同时可有效确定由抑制各种大肠杆菌菌株中靶基 因的表达引起的酪氨酸的产量。

在本发明中，将酪氨酸酚裂解酶(TPL)额外克隆到所构建的质粒中，以 使酪氨酸变为苯酚并生产苯酚。此外，将构建的质粒导入上述试验的14种 不同的大肠杆菌菌株中，然后测定大肠杆菌菌株中苯酚的产量。结果表明， 在W3110菌株中苯酚的产量为357.6mg/L，在显示出最高的生产酪氨酸能 力的S17-1菌株中苯酚的产量为68.8mg/L。这是首次在大肠杆菌中成功生 产苯酚。在更进一步的方面中，本发明涉及一种能够生产苯酚的重组微生 物，所述重组微生物是通过在上述重组微生物中导入或扩增tpl基因而获得 的。

在本发明的另一个实施例中，检测合成sRNA是否可以调控代谢通量以 增加尸胺的产量。为此，将据报道通过赖氨酸生物合成途径生产尸胺的 W3110重组菌株(XQ56)作为基本菌株(图17)(Qian et al,Biotechnology and  Bioengineering,108(1):93-103,2011)。基本菌株已经包括p15CadA重组质 粒，将合成sRNA克隆到分离的质粒pWAS中并转化到菌株中(图18)。

为了增加生产尸胺所需的代谢产物的量，选定以下八个将被抑制的候选 基因：gltA(柠檬酸合成酶)、thrA(天冬氨酸激酶I)、thrB(高丝氨酸激 酶)、thrC(苏氨酸合酶)、thrL(thr操纵子前导肽)、metB(胱硫醚γ-合 酶)、murE(UDP-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-谷氨酰-L-赖氨酸连接酶)和 murF(UDP-N-乙酰胞壁酰丙氨酰-D-谷氨酰-2,6-二氨基庚二酸-D-丙氨酰-D- 丙氨酸连接酶)。

在包含所构建的合成sRNA的重组质粒转化之后，测定尸胺的产量。基 本菌株中尸胺的产量为1.4±0.05g/L，将它作为100％时，八个候选基因中 的murE、metB和thrL各自表达被抑制的菌株显示出尸胺产量增加为：对 于murE，增加55％(2.15g/L)，对于metB，增加24％(1.73g/L)，以及对于 thrL，增加34％(1.87g/L)(图19)。

在本发明的另一个实施例中，对130种候选基因进行相同的实验，结果 如图27所示，发现表5中列出的总共37种基因表达的抑制导致尸胺产量的 增加。基本菌株中尸胺的产量为1.4±0.05g/L，将它作为100％时，murE和 ack基因的表达被抑制的菌株显示出尸胺产量增加为：对于murE，增加 55％(2.15g/L)，对于ack，增加40％(1.96g/L)(图27)。

因此，在另一进一步的方面中，本发明涉及一种具有增强的生产尸胺的能力 的重组微生物以及用于生产所述重组微生物的方法，所述重组微生物是通过 使具有尸胺生物合成途径的宿主细胞中的选自以下基因中的至少一种基因的 功能失活而获得的：murE(UDP-N-乙酰胞壁酰丙氨酰-D-谷氨酰-2,6-二氨基 庚二酸连接酶)、metB(胱硫醚γ-合酶)、thrL(thr操纵子前导肽)、 ackA(丙酸激酶/乙酸激酶活性)、pdhR(丙酮酸脱氢酶复合物调控因 子)、ilvG_1(乙酰乳酸合酶II、大亚基、N-ter片段(假基因))、carB (氨甲酰磷酸合成酶)、serC(磷酸羟基苏氨酸转氨酶/3-磷酸丝氨酸转氨 酶)、ilvN(乙酰羟基丁酸乙酯合成酶/乙酰乳酸合成酶)、Crp(CRP转录 双调控因子)、ilvD(二羟酸脱水酶)、ilvY(IlvY DNA-结合转录双调控 因子)、glpK(甘油激酶)、glpF(甘油MIP通道)、pta(磷酸乙酰转移 酶)、tktA(转酮醇酶I)、hflD(溶原化调控因子)、deoA(胸苷磷酸化 酶/尿嘧啶磷酸化酶)、gadE(GadE控制参与谷氨酸依赖体系的基因转 录)、rbsK(核糖激酶)、ilvL(ilvGEDA操纵子前导肽)、ilvC(乙酰羟 酸还原异构酶)、accA(乙酰辅酶A羧基转移酶，α-亚基)、ilvM(乙酰 羟基丁酸酯合酶/乙酰乳酸合酶)、argB(乙酰谷氨酸激酶)、thrA(天冬 氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶)、carA(氨甲酰磷酸合酶)、fbp(果糖-1,6-二 磷酸酶)、rbsD(核糖吡喃酶)、panD(天冬氨酸脱氢酶)、aspA(天冬 氨酸脱氨酶)、rcsB(RcsB-BglJ DNA结合转录激活因子)、ivbL(ilvB操 纵子前导肽)、lexA(LexA抑制参与细胞DNA损伤应答的几种基因的转 录)、rbsA(核糖ABC转运蛋白)、murF(D-丙氨酰-D-丙氨酸加合酶) 和thrC(苏氨酸合酶)。优选地，所述重组微生物是通过使选自以下基因 中的至少一种基因的功能失活而获得的：murE、metB、thrL和ackA。具有 尸胺生物合成途径的宿主细胞的实例包括大肠杆菌、根瘤菌、双歧杆菌、红 球菌、念珠菌属、欧文氏菌、肠杆菌、巴氏杆菌、曼氏杆菌、放线杆菌、伴 放线菌、黄杆菌、弧菌、假单胞菌、固氮菌、不动杆菌、劳尔氏菌、农杆 菌、根瘤菌、红杆菌、单胞发酵菌、芽孢杆菌、葡萄球菌、乳球菌、链球 菌、乳杆菌、梭菌、棒状杆菌、链霉菌、双歧杆菌和圆杆菌。

以下，将参照实施例更详细地描述本发明。对于本领域的普通技术人员 将显而易见的是，这些实施例仅是解释性的目的，而不被理解为限制本发明 的范围。

实施例1：合成sRNA的性能检测

1-1：合成sRNA的构建以及用于调控表达的pWAS质粒的构建

构建图18中所示的基本质粒，其中合成sRNA的表达被抑制，但如果 需要的话能有效地表达。在图18的pWAS质粒中，可通过定点诱变将靶基 因mRNA结合区域插入启动子(P_R)和MicC Hfq结合区域中来构建合成 sRNA。

该实施例以及以下实施例中使用的限制性酶均购自New England Labs (USA)，PCR聚合酶购自Invitrogen(USA)。其它试剂分别注明。

首先，利用pKD46质粒(GenBank AY048746.1(Datsenko et al,PNAS, 97(12):6640-6645,2000))作为模板以及SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的引物 进行PCR，并利用SacI/EcoRI将araC-PBAD启动子克隆到pWA质粒(图 20，SEQ ID NO:1)中。此外，利用来自噬菌体λ染色体(Bioneer，韩 国；GenBank NC_001416.1)的SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的引物进行 PCR，通过PacI/EcoRIand裂解，然后连接得到cI基因。此外，在进行PCR 之后，将T1/TE序列作为转录终止序列额外克隆到质粒中。在这里，T1/TE 序列是利用SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的引物无需模板进行PCR得到 的，它被EcoRI/XbaI裂解然后连接到导入有araC-pBAD-cI的载体，使得cI 的末端可以终止。将以上的构建载体作为模板，利用SEQ ID NO:8和SEQ  ID NO:9的引物通过PCR扩增T1/TE，之后用XhoI/KpnI裂解并连接到以上 的构建载体，使得sRNA的转录可独立终止。利用构建载体作为模板以及 SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11的引物进行定点诱变，由此将野生型cI基 因修饰为温度敏感型突变基因cI(ts2)。

所用引物序列

[SEQ ID NO:2]5'-AAGCTGGAGC TCAATACTAG TCGATTTATT ATGACAACTT GACGGCTACA TC-3'

[SEQ ID NO:3]5'-GAATTCAATT AATTAATTAA AATTCCCAAA AAAACGGGTA TGGAGAA-3'

[SEQ ID NO:4]5'-GGGAATTTTA ATTAAAAGGA GACCCGGGAT ATGAGCACAA AAAAGAAACC ATTAACA-3'

[SEQ ID NO:5]5'-AATTATGAAT TCTTAGCCAA ACGTCTCTTC AGG-3'

[SEQ ID NO:6]5'-AATAT GAATTCCCAG GCATCAAATA AAACGAAAGG CTCAGTCGAA AGACTGGGCC TTTCGTTTTA TCTGTTGTTT GTCGGTGAAC GCTCTCTACT AGAGTC-3'

[SEQ ID NO:7]5'-AATAT TCTAGATATA AACGCAGAAA GGCCCACCCG AAGGTGAGCC AGTGTGACTC TAGTAGAGAG CGTTCACCGA CAAACAACAG ATAAAACGAA AG-3'

[SEQ ID NO:8]5'-TTTTTTCTCG AGCCAGGCAT CAAATAAAAC GAA-3'

[SEQ ID NO:9]5'-GAATTGGGTA CCTATAAACG CAGAAAGGCC CACC-3'

[SEQ ID NO:10]5'-gAAGTTAT CGCTAGTCAG TGGCC-3'

[SEQ ID NO:11]5'-CCCCACAACG GAACAACTCT-3'

接下来，按以下方式通过PCR构建作为基于合成sRNA的结构的序列 和PR启动子。对于MicC结构，利用大肠杆菌W3110染色体(GenBank  AP009048)为模板以及SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的引物进行PCR，利 用TOPO克隆试剂盒(Invitrogen)将PCR产物克隆、测序，然后利用 PstI/XhoI连接到以上的构建载体。对于SgrS结构，利用上述相同的模板以 及SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的引物进行PCR，利用TOPO克隆试剂 盒将PCR产物克隆、测序，然后利用PstI/XhoI克隆到以上的构建载体中。 对于MicF结构，利用SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17的引物无需模板进行 PCR，利用TOPO克隆试剂盒将PCR产物克隆、测序，然后利用PstI/XhoI 克隆到载体中。以这种方式，可构建具有不同的基本结构的三个载体。图2 中示出了各sRNA结构。利用SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19的引物进行 用于使克隆与该质粒一致的PCR或测序。

所用引物序列

[SEQ ID NO:12]5'-CTGCAGGAAT TCTAACACCG TGCGTGTTGA CTATTTTACC TCTGGCGGTG ATAATGGTTG CTTTCTGTTG GGCCATTGCA TTGC-3'

[SEQ ID NO:13]5'-CTCGAGAAAA AAAGCCCGGA CGACTGTTC-3’

[SEQ ID NO:14]5'-CTGCAGGAAT TCTAACACCG TGCGTGTTGA CTATTTTACC TCTGGCGGTG ATAATGGTTG CGATGAAGCA AGGGGGTGC-3'

[SEQ ID NO:15]5'-CTCGAGAAAA AAAACCAGCA GGTATAATCT GCTG-3'

[SEQ ID NO:16]

5'-CTGCAGGAAT TCTAACACCG TGCGTGTTGA CTATTTTACC TCTGGCGGTG ATAATGGTTG CTCATTTCTG AATG-3'

[SEQ ID NO:17]5'-TCGAGAAAAA AAACCGAATG CGAGGCATCC GGTTGAAATA GGGGTAAACA GACATTCAGA AATGAGCAAC CATTATCAC-3'

[SEQ ID NO:18]5'-AGTGGGAACC TAGACACTAA-3'

[SEQ ID NO:19]5'-CTAGGTAAAC CCAGGAGG-3'

于是，构建图20所示的pWAS质粒。PR启动子是噬菌体λ启动子， cI(ts2)是作用为抑制PR启动子的噬菌体λ基因，且cI(ts2)是通常在25℃起 作用而在37℃失去功能的温度敏感型突变蛋白(Jana et al,Protein Engineering, 13(3):225-233,1999)。当在25℃条件下含1％阿拉伯糖的LB培养基(1％胰 蛋白胨、1％NaCl、0.5％酵母提取物)中培养质粒时，cI(ts2)充分表达且它 的功能保持完整，因此它抑制PR启动子，从而不表达合成sRNA。然而， 当在37℃、不含阿拉伯糖的条件下培养质粒时，cI(ts2)不能充分表达且由于 它在该温度下的不稳定性而丧失功能，因此它不能抑制PR启动子，从而表 达合成sRNA。

1-2：用于测试合成sRNA的性能的报告质粒的构建

构建用于检测合成sRNA的功能的报告质粒。用于克隆报告质粒的基本 质粒为pR15CA。基本质粒的结构在图21中示出，且其序列为SEQ ID NO: 20。

T1/TE是报告基因的转录终止序列，通过利用(实施例1-2中构建的) pWAS质粒作为模板以及SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的引物进行PCR 扩增T1/TE，用XhoI/KpnI裂解PCR产物，然后克隆到pR15CA质粒中。 通过利用pBluescript SK+(Stratagene)作为模板以及SEQ ID NO:23和SEQ  ID NO:24的引物扩增表达DsRed2基因的lac启动子，并利用EcoRI/XhoI将 PCR产物克隆到质粒中。最后，利用pDsRed2-N1(Clontech)作为模板以及 SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的引物扩增DsRed2基因，并利用 PacI/XhoI将PCR产物克隆到pR15CA载体中，由此构建报告质粒。

所用引物序列

[SEQ ID NO:21]5'-ATAATTCTCG AGCCAGGCAT CAAATAAAAC GAAAGGCT-3'

[SEQ ID NO:22]5'-AATTAGGTAC CTATAAACGC AGAAAGGCCC ACC-3'

[SEQ ID NO:23]5'-AATTA GAATTCGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTG-3'

[SEQ ID NO:24]5'-AATTACTCGA GAATTATTTA ATTAATAAAG TTAATTTTTT TTTTTTGTGT GAAATTGTTA TCCGCTC-3'

[SEQ ID NO:25]5'-AATTATTAAT TAAAAGGAGG ACAAATATAT GGCGAGC-3'

[SEQ ID NO:26]5'-AATTACTCGA GTTACGCCAC CAGGGCATAG TTTTCATCAT TTGCCGCCAG GAACAGGTGG TGGCGGCCCT CGGT-3'

1-3：用于选择基于合成sRNA的结构的sRNA的构建及其性能检测

为了将靶向DsRed2mRNA的核糖体结合位点(RBS)的序列分别插入到 实施例1-1中构建的包含基于sRNA的结构(MicC、SgrS和MicF)的三个 pWAS质粒的每个中，利用以下引物进行PCR。DsRed2的RBS及其结合的 序列在图2中示出。

首先，利用实施例1-1的质粒(pWAS中包含基于MicC的结构)以及 SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28的引物通过PCR进行定点诱变，以在基于 MicC的结构前面插入靶向DsRed2的互补结合序列，由此构建具有靶向 DsRed2的MicC结构的合成sRNA。将定点诱变的PCR产物在DNA凝胶上 纯化，用DpnI处理1小时，然后用T4多核苷酸激酶和T4DNA连接酶处理 4小时，接着转化到DH5-α。按照与上述相同的过程，利用包含基于 pWAS-SgrS的结构的载体作为模板以及SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的 引物进行定点诱变，由此构建具有基于SgrS的结构的合成sRNA。此外， 利用包含基于pWAS-MicF的结构的载体作为模板以及SEQ ID NO:31和 SEQ ID NO:32的引物进行定点诱变，由此构建具有基于MicF的结构的合成 sRNA。将上述构建的三个不同的合成sRNA各转化到报告质粒转化的大肠 杆菌DH5-α(Invitrogen,USA)中，然后在37℃条件下含35μg/ml氯霉素和50 μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中培养大肠杆菌细胞至静止期，然后在 FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson)中进行荧光测定。

所用引物序列

[SEQ ID NO:27]5'- GCGAGCAGTGAGAACGTCATAAGTCAACTTTCAGAATTGCGGTCATCC CA-3'

[SEQ ID NO:28]5'- CATATATTTGTCCTCCTTAAATCACCCGCCAGCAGATTATACCTG-3'

[SEQ ID NO:295'- GCGAGCAGTGAGAACGTCATGCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAA A-3'

[SEQ ID NO:30]5'- CATATATTTGTCCTCCTTTCATTTCTGAATGTCTGTTTACCCCTA-3'

[SEQ ID NO:31]5'- GCGAGCAGTGAGAACGTCATGCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAA A-3'

[SEQ ID NO:32]5'- CATATATTTGTCCTCCTTTCATTTCTGAATGTCTGTTTACCCC-3'

结果如图3所示，通过将靶向DsRed2mRNA的RBS的序列插入SgrS 的Hfq结合位点而得到的合成sRNA对DsRed2的表达抑制85％，通过将靶 向DsRed2mRNA的RBS的序列插入MicC的Hfq结合位点而得到的合成 sRNA对DsRed2的表达抑制90％。换句话说，结果表明选定的三个结构均 有助于有效抑制表达，特别地，包括MicC的Hfq结合位点的sRNA结构的 效果更好。

实施例2：对合成sRNA的功能有效的mRNA位置的筛选

为了确定对合成sRNA的稳定功能有效的mRNA的结合位置，利用 pWAS质粒作为模板构建合成rRNA，以便结合到DsRed2的各个位点。

按照与实施例1-3中所述相同的方式，利用以下引物通过PCR扩增被 导入各合成sRNA的区域以及与DsRed2mRNA成碱基配对的区域，所述区 域被导入包括MicC的Hfq结合位点的pWAS质粒中。

在图4中，序列A是利用SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28的引物得到 的；序列B1是利用SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34的引物得到的；序列 B2是利用SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36的引物得到的；序列C1是利用 SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38的引物得到的；序列C2是利用SEQ ID  NO:39和SEQ ID NO:40的引物得到的；D1是利用SEQ ID NO:41和SEQ  ID NO:42的引物得到的；D2是利用SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44的引物 得到的；E1是利用SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46的引物得到的；E2是利 用SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48的引物得到的；F1是利用SEQ ID NO:49 和SEQ ID NO:50的引物得到的；F2是利用SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52 的引物得到的；G1是利用SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54的引物得到的； 以及G2是利用SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56的引物得到的。

所用引物序列

[SEQ ID NO:33]5'-GACAAATATATGGCGAGCAGTGAGAA-3'

[SEQ ID NO:34]5'-TTTCTGTTGGGCCATTGCATTGC-3'

[SEQ ID NO:35]5'-CACCGAGCAACCATTATCACCGCCAGA-3'

[SEQ ID NO:36]5'-ATGACGTTCTCACTGCTCGCCA-3'

[SEQ ID NO:37]5'-GCGAGCAGTGAGAACGTCAT-3'

[SEQ ID NO:38]5'-TTTCTGTTGGGCCATTGCATTGC-3'

[SEQ ID NO:39]5'- CACCGAGTTCATGCGCTTGCAACCATTATCACCGCCAGA-3'

[SEQ ID NO:40]5'-ATGACGTTCTCACTGCTCGCCA-3'

[SEQ ID NO:41]5'- TGTTCACCGGGCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAA-3'

[SEQ ID NO:42]5'- GCTCCTCGCTTTCTGTTGGGCCATTGCATTGCCAC-3'

[SEQ ID NO:43]5'- CATCCTGGTGCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAA-3'

[SEQ ID NO:44]5'-GGCACCACCCCGGTGAACAGCTCCTCGCTTTCT- 3'

[SEQ ID NO:45]5'- GGGTGGTGCCGCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAA-3'

[SEQ ID NO:46]5'- CGGTGAACATTTCTGTTGGGCCATTGCATTGCCAC-3'

[SEQ ID NO:47]5'- CGAGCTGGAGCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAA-3'

[SEQ ID NO:48]5'- ACCAGGATGGGCACCACCCCGGTGAACATTTCT-3'

[SEQ ID NO:49]5'- CATCCTGGTCGCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAA-3'

[SEQ ID NO:50]5'- GGCACCACCTTTCTGTTGGGCCATTGCATTGCCAC-3'

[SEQ ID NO:51]5'- GGCGACGTAGCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAA-3'

[SEQ ID NO:52]5'-GTCCAGCTCGACCAGGATGGGCACCACCTTT-3'

[SEQ ID NO:53]5'- ACTACAAGAAGCGCAACCATTATCACCGCCAGA-3'

[SEQ ID NO:54]5'- CGGGGATGTCGGTTTCTGTTGGGCCATTGCATTGC-3'

[SEQ ID NO:55]5'- CAAGAAGCTGTCGCAACCATTATCACCGCCAGA-3'

[SEQ ID NO:56]5'- TAGTCGGGGATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTGC-3'

将构建的合成sRNA各转化到实施例1-2中构建的转化有报告质粒的 DH5-α菌株中，并测定各菌株中DsRed2荧光的减少。

结果如图5所示，当sRNA结合到DsRed2mRNA的RBS的一部分或 全部时，DsRed2mRNA的表达被抑制90-99％。当sRNA结合到除RBS之 外的区域时，对DsRed2mRNA表达的抑制是不规律的(47-90％)。这样的结 果表明，当sRNA包括可互补地结合到靶基因的mRNA的RBS的区域时， 对靶基因的mRNA表达的抑制更有效。

实施例3：针对其它靶mRNA的sRNA的构建以及交叉反应性测定

为了检测根据本发明的sRNA是否能够抑制除DsRed2之外的其它基因 的mRNA的表达，通过定点诱变将与LuxR、AraC和KanR基因的各 mRNA的RBS互补的序列插入MicC结构，以便结合到RBS。在图6中， 将与各靶基因的RBS互补的序列用下划线画出并用红色表示。

合成sRNA抗-LuxR是通过利用(包含基于MicC的结构的)pWAS质 粒作为模板以及SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58的引物通过定点诱变而构 建的，抗-AraC是利用SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60的引物构建的，抗- KanR是利用SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62的引物构建的。为了检测各基 因的表达水平，构建各基因与DsRed2的融合蛋白。为此，利用实施例1-2 的包含DsRed编码序列的报告质粒作为模板以及SEQ ID NO:64和SEQ ID  NO:26的引物进行PCR扩增，将PCR产物用PacI/XhoI限制性酶裂解，然 后将其导入实施例1-2的报告质粒中。

利用费氏弧菌ES114染色体(GenBank CP000020.2,CP000021.2)作为模 板以及SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66的引物通过PCR扩增LuxR基因， 用PacI/ClaI处理PCR产物，然后克隆到实施例1-2中构建的新的报告质粒 中，由此构建LuxR-DsRed2融合蛋白。利用SEQ ID NO:67和SEQ ID  NO:68的引物对以及SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70的引物对分别扩增 AraC和KanR基因，然后按照上述相同的方式进行克隆。

所用引物序列

[SEQ ID NO:57]5'- TTAATTAAAATCTACTCTAGAGGTGCAGGGGCAGGCGCTGGTGCGGGT GCCATGGCGAGCAGTGAGAACGTCAT-3'

[SEQ ID NO:58]5'- AATACTCCGCGGTATAAACGCAGAAAGGCCCACC-3'

[SEQ ID NO:59]5'- TCATTTTGATTGCTCCTTTTTCTGTTGGGCCATTGCATTGC-3'

[SEQ ID NO:60]5'- CTGAAGCGCAAAATGATCGCAACCATTATCACCGCCAGA-3'

[SEQ ID NO:61]5'- CCATCCGTTTTTCTCCTTTTTCTGTTGGGCCATTGCATTGC-3'

[SEQ ID NO:62]5'- GAACAAGATGGATTGCGCAACCATTATCACCGCCAGA-3'

[SEQ ID NO:63]5'- AATCATGTAAACGACTCCTTTTTCTGTTGGGCCATTGCATTGC-3'

[SEQ ID NO:64]5'- AATTATTAATTAAAATCTACATCGATGGTGCAGGGGCAGGCGCTGGTG CGGGTGCCATGGCGAGCAGTGAGAACGTCAT-3'

[SEQ ID NO:65]5'- AATTATTAATTAAGGAGCAATCAAAATGAACATCAAGAACATCAACG CG-3'

[SEQ ID NO:66]5'- AATTAATCGATATTTTTAAGGTATGGACAATTAATGGCGC-3'

[SEQ ID NO:67]5'- AATTATTAATTAAAAGGAGAAAAACGGATGGCTG-3'

[SEQ ID NO:68]5'- AATTAATCGATTGACAACTTGACGGCTACATCATTCA-3'

[SEQ ID NO:69]5'- AATTATTAATTAAGGAGTCGTTTACATGATTGAACAAGATGGATTGCA CG-3'

[SEQ ID NO:70]5'- AATTAATCGATGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATA-3'

接下来，如图7A所示，将构建的包含三个合成sRNA和三种靶基因的 质粒各自分别转化到DH5-α菌株，然后在图7B中示出了菌株中DsRed2的 相对荧光以及测量结果。

结果可以看出，通过本发明的方法构建的合成sRNA对靶基因显示出 80-86％的表达抑制效果。此外，非靶基因的表达水平与不包含sRNA的情 况类似。

这样的结果表明，根据本发明的制备方法的合成sRNA可仅仅有效抑制 靶基因的mRNA的表达。此外，如图8所示，当与靶mRNA的结合能为-53 kcal/mol或更低且与其它mRNA的结合能为-13kcal/mol或更高时，将不会 发生交叉反应。

实施例4：利用合成sRNA的产生酪氨酸的重组微生物的生产

为了构建用于产生芳香化合物酪氨酸的重组微生物，通过以下步骤进行 试验以选择生产酪氨酸能力最高的菌株以及菌株中抑制的基因的组合：(1) 构建过表达参与芳香化合物(特别是酪氨酸)的生物合成途径的酶的质粒， 以增强朝向化合物的代谢通量；(2)构建对编码去向与酪氨酸生物合成途径 相反的途径的酶和蛋白质的基因表达进行抑制的合成sRNA，以将细胞内代 谢通量导向酪氨酸生物合成途径；以及(3)将质粒转化到14个不同的大肠杆 菌菌株中，然后将合成sRNA的各种组合额外转化到菌株中。

4-1：用于增强芳香化合物的生物合成途径的活性的基本质粒的构建

首先，构建过表达增强芳香化合物的生物合成途径的活性所需的酶的质 粒。

该实施例中使用的靶基因是：ppsA，编码phenolpthiocerol合成I型聚 酮合成酶；tktA，编码转酮醇酶；aroG和aroF，编码3-脱氧-7-磷酸庚酮合 成酶；aroK，编码莽草酸激酶I；tyrA，编码分支酸变位酶；以及tyrC，编 码源自运动发酵单胞菌的预苯酸脱氢酶(图9)。

首先，如图10所示，构建不包含合成sRNA的pTyr-b质粒。具体地， 利用pTac15k质粒(Hiszczynska-Sawicka et al.,Plasmid38:174,1997)作为基本 质粒，利用大肠杆菌W3110染色体(GenBank AP009048)作为模板以及SEQ  ID NO:71和SEQ ID NO:72的引物通过PCR扩增aroF基因，然后利用 EcoRI/SacI将其克隆到pTac15k质粒中。接下来，利用大肠杆菌W3110染 色体作为模板以及SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74的引物通过PCR扩增 tktA基因，然后利用XbaI/SphI将其克隆到质粒中。接下来，利用大肠杆菌 W3110染色体作为模板以及SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:76的引物通过 PCR扩增ppsA基因，然后利用SacI/SpeI裂解，之后将被裂解基因连接到用 SacI/XbaI裂解的质粒载体。以这种方式，构建不包含合成sRNA的pTyr-b 质粒。

所用引物序列

[SEQ ID NO:71]5'- AATTATGAATTCATGCAAAAAGACGCGCTGAATAAC-3’

[SEQ ID NO:72]5'-TAATTGAGCTCTTAAGCCACGCGAGCCGTCA-3’

[SEQ ID NO:73]5'- ATCATATCTAGAAGGAGGTTATTCATGTCCTCACGTAAAGA-3’

[SEQ ID NO:74]5'-TTCGTTGCATGCTTACAGCAGTTCTTTTG-3’

[SEQ ID NO:75]5'- AATTAAGAGCTCTTAATTAACGGTTAAATATGCAAAGATAAATGCG-3’

[SEQ ID NO:76]5'- AATTAAACTAGATTATTTCTTCAGTTCAGCCAGG-3’

接下来，通过构建pTyr-a质粒克隆参与酪氨酸生物合成的剩余基因 (图10)。这些基因将被在MIT Registry(http://partsregistry.org)注册的 BBa_J23113启动子表达。具体地，利用SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78的 引物无需模板通过PCR构建目的启动子。利用TOPO克隆试剂盒克隆所构 建的启动子，并进行测序以确认误差，之后用SacI/NotI裂解并将其连接到 实施例1的pWA质粒。利用实施例1的pWAS质粒作为模板以及SEQ ID  NO:79和SEQ ID NO:80的引物通过PCR扩增转录终止序列T1/TE，然后连 接到启动子的下游。以这种方式，构建pWA-J23113-T1/TE质粒，然后将剩 余基因克隆到该质粒。然后，通过PCR扩增从启动子到T1/TE范围的区 域，并将其克隆到pWA质粒中，由此构建图10所示的pTyr-a质粒。

所用引物序列

[SEQ ID NO:77]5'- GAGCTCCTGATGGCTAGCTCAGTCCTAGGGATTATGCTAGCCATATCG AAAGGATAGTCTTGATAACCATAAGTTTAATTAAGCGGCCGC-3'

[SEQ ID NO:78]5'- GCGGCCGCTTAATTAAACTTATGGTTATCAAGACTATCCTTTCGATATG GCTAGCATAATCCCTAGGACTGAGCTAGCCATCAGGAGCTC-3'

[SEQ ID NO:79]5'- ATAATTGAATTCCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGC-3'

[SEQ ID NO:80]5'- CGAATTGGGTACCTATAAACGCAGAAAGGCCCACCCG-3'

具体地，利用大肠杆菌W3110染色体作为模板以及SEQ ID NO:81和 SEQ ID NO:82的引物通过PCR扩增tyrA基因，然后用PacI/EcoRI将它裂 解并克隆到pWA-J23113-T1/TE质粒中，由此构建包括启动子-编码序列-转 录终止序列的基因。tyrA对酪氨酸的反馈抑制敏感，因此，为了消除反馈 抑制，通过A354V/M53I定点诱变除去tyrA的两个氨基酸残基。在这里， 利用SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:84的引物尝试A354V突变，并利用SEQ  ID NO:85和SEQ ID NO:86的引物将得到的质粒进行M53I突变，由此消除 反馈抑制(Lutke-Eversloh et al,Applied Microbiology and Biotechnology, 75:103,1999)。

[SEQ ID NO:81]5'- AATCATTTAATTAAACGGCTCGCGTGGCTTAAG-3'

[SEQ ID NO:82]5'- AATTAAGAATTCTTACTGGCGATTGTCATTCGCC-3'

[SEQ ID NO:83]5'-TTTGGCCTCGCGTCGTGCA-3'

[SEQ ID NO:84]5'-ATAGATGCCTCGCGCTCCG-3'

[SEQ ID NO:85]5'-TGCAGCGTTTTCAGAGTGAAAGCC-3'

[SEQ ID NO:86]5'-CGTAATCGCCGAACCAGTGCTC-3'

按照与上述相同的方式，克隆aroG、aroK和tyrC。具体地，利用大肠 杆菌W3110染色体作为模板以及SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:88的引物通 过PCR扩增aroG，利用SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90的引物通过PCR 扩增aroK，利用运动发酵单胞菌染色体(ZM6菌株，ATCC29191)作为模板 以及SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:92的引物通过PCR扩增tyrC。用 PacI/EcoRI裂解PCR产物然后将其克隆到pWA-J23113-T1/TE中。在这些基 因中，aroG也对反馈抑制敏感，因而进行A146N氨基酸突变。利用SEQ  ID NO:93和SEQ ID NO:94的引物通过定点诱变进行这种突变，类似于tyrA 的情形(Lutke-Eversloh et al,Applied Microbiology and Biotechnology,75:103, 1999)。

[SEQ ID NO:87]5'- TTAATTAAAGGAGAAAAAATGAATTATCAGAACGACGATTTAC-3'

[SEQ ID NO:88]5'-GAATTCTTACCCGCGACGCGCTTTT-3'

[SEQ ID NO:89]5'- AATTAATTAATTAAGACTCTCGCAATATCTTATG-3'

[SEQ ID NO:90]5'-AATTAAGAATTCTTAGTTGCTTTCCAGCATGTG- 3'

[SEQ ID NO:91]5'- TTAATTAAGGAGAAAAAAATGACCGTCTTTAAGCATATTGCCA-3'

[SEQ ID NO:92]5'- GAATTCTTAAGGGTGAATATCGTGGTCTGTTTTT-3'

[SEQ ID NO:93]5'-AATATGATCACCCCACAATATCTCG-3'

[SEQ ID NO:94]5'-GAGAAACTCACCTGCCGCT-3'

使上述构建的pWA-J23113-tyrA(A354V/M53I)(或aroG(A146N)、 aroK、tyrC)-T1/TE进行PCR以扩增从启动子到T1/TE范围的总区域，用 SpeI/SacI裂解PCR产物并将其克隆到用XbaI/SacI裂解的pWA中。XbaI和 SpeI的特征在于它们可以彼此互补地结合，但只要裂解区域的一个序列结 合不同，它们就会马上消失。因为SEQ ID NO:96的引物包括XbaI和 SacI，利用SpeI/SacI可无限克隆PCR扩增的基因，且利用XbaI/SacI可无限 克隆载体。

[SEQ ID NO:95]5'-AATTAAACTA GTCTGATGGC TAGCTCAGT-3'

[SEQ ID NO:96]5'-ATTAATGAGC TCATAATTTC TAGATATAAA CGCAGAAAGG CC-3'

以这种方式，将tyrA(A354/M53I)、aroG(A146N)、tyrC和aroK顺序克 隆到pWA中。

4-2：使用质粒的14个不同的大肠杆菌菌株的酪氨酸生产力的检测

将上述构建的两个质粒转化到以下14种不包含合成sRNA的不同的大 肠杆菌菌株中：K-12菌株(C600(ATCC23738)、DH5α(Invitrogen)、 ER2925(New England Labs)、JM110(Agilent Technologies)、 MG1655(Invitrogen)、S17-1(ATCC 47055)、T1R(One shot(R)ccdB  SurvivalTM2T1R,Invitrogen)、TG1(ZymoResearch)、TOP10(Invitrogen)、 W3110(ATCC39936)、XL1-Blue(Agilent Technologies))、B菌株 (BL21(DE3,Promega)、W菌株(ATCC9637)以及K-12菌株和B菌株的杂交 菌株(HB101,Promega)。

在含50/ml氨苄青霉素和50/ml卡那霉素的LB培养基中培养所得的重 组微生物至静止期，然后将其以1/100的体积比转移到含50ml培养基的摇 瓶中。然后，在37℃条件下培养微生物细胞达48小时，测定在培养期间酪 氨酸的最大浓度。摇瓶中使用的培养基如下表1、2所示。

表1

[表1]

化合物 浓度 (NH₄)₂HPO₄2g/L KH₂PO₄6.75g/L 柠檬酸 0.85g/L 酵母提取物 3g/L 琥珀酸 0.1g/L 葡萄糖 20g/L 微量元素溶液 5ml/L(表2)

表2

[表2]

化合物 浓度 FeSO₄·7H₂O 10g/L ZnSO₄·7H₂O 2.2g/L MnSO₄·7H₂O 0.58g/L CuSO₄·5H₂O 1g/L (NH₄)₆Mo7O₂₄·4H₂O 0.1g/L Na₂B₄O₇·10H₂O 0.02 35％HCl 10ml

每隔6小时从摇瓶中取样，通过向其中加入HCl将pH调整到1，然后 在室温下培养30分钟。接下来，将样品离心5分钟，通过HPLC(Agilent  Technologies)测定上清液中酪氨酸的浓度。使用的色谱柱为Zorbax SB-Aq 色谱柱(3x250mm；Agilent Technologies)。

图11的第一个柱中标示的“无sRNA”是指大肠杆菌菌株中酪氨酸的 产物仅有上述构建的两种质粒。14种不同的大肠杆菌菌株产生不同浓度(0- 1.0g/L)的酪氨酸。这表明，不同的大肠杆菌菌株具有不同的代谢能力，为 了使代谢产物的产量最大化，除了找到其通量在代谢网络中可被调控的合适 的基因外，选择合适的菌株也很重要。在该实验中，S17-1菌株显示出酪氨 酸的最高产量。

4-3：用于识别有助于增加酪氨酸产量的基因的合成sRNA的构建以及终pTyr-a/pTyr-b质粒的构建

在上述实施例中，结果表明基本的酪氨酸生物合成途径足以生产酪氨 酸。在本实施例中，进行实验以识别待沉默的基因，以进一步通过合成 sRNA提高生产力。具体地，为了使tyrR基因(抑制参与酪氨酸生物合成途 径的酶的表达)沉默，且为了将更多通量导向酪氨酸生物合成途径，使 csrA和pgi沉默，并使编码用于转化磷酸烯醇式丙酮酸并增加磷酸烯醇式丙 酮酸的量的酶的ppc沉默，以增加磷酸烯醇式丙酮酸的量。

利用以上构建的pWAS质粒作为模板以及SEQ ID NO:97和SEQ ID  NO:98的引物通过定点诱变来构建抗-tyrR。按照相同的方式，利用SEQ ID  NO:99和SEQ ID NO:100的引物来构建抗-ppc，利用SEQ ID NO:101和 SEQ ID NO:102的引物来构建抗-csrA，以及利用SEQ ID NO:103和SEQ ID  NO:104的引物来构建抗-pgi。

所用引物序列

[SEQ ID NO:97]5'-AGTCTTTTGTGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:98]5'-TCCAGACGCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATT-3'

[SEQ ID NO:99]5'-TATTCCGCATTG GCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:100]5'-TTGTTCGTTCATTTTCTGTTGGGCCATTGC-3'

[SEQ ID NO:101]5'-ACTCGTCGAGTT GCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:102]5'-CAGAATCAGCATTTTCTGTTGGGCCATTGC-3'

[SEQ ID NO:103]5'-AATCCAACGCAGGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:104]5'-GATGTTTTTCATTTTCTGTTGGGCCATTGC-3'

将pBAD、cI(ts)体系导入pWAS以增加合成sRNA的表达调控作用， 将pBAD、cI(ts)体系导入不含合成sRNA的pTyr-a。具体地，利用pWAS 作为模板以及SEQ ID NO:105和SEQ ID NO:96的引物进行PCR，用 SpeI/SacI裂解PCR产物并将其与用XbaI/SacI裂解的构建载体连接。

接下来，按照与上述相同的方式，利用SEQ ID NO:104和SEQ ID  NO:94的引物扩增抗-csrA、抗-pgi或抗-ppc，用SpeI/SacI裂解PCR产物 (sRNA)并将其与用XbaI/SacI裂解的构建载体连接。以这种方式，构建具有 不同sRNA的三种pTyr-a质粒(图10)。然而，图10中示出的tpl基因用 于生产苯酚，因而在这一阶段不克隆。将在与苯酚的生产相关的实施例中详 细描述tpl基因。

将抗-tyrR克隆到pTyr-b。具体地，利用SEQ ID NO:106和SEQ ID  NO:107的引物通过PCR扩增抗-tyrR，然后用SpeI/NheI裂解。此外，用 NheI裂解所构建的不含sRNA的pTyr-b载体，然后与抗-tyrR连接，由此构 建含sRNA的pTyr-b载体。

所用引物序列

[SEQ ID NO:105]5'-TAATTTACTA GTATGGCTGA AGCGCAAAAT GATCC-3'

[SEQ ID NO:106]5'-AATTAAACTA GTTAACACCG TGCGTGTTGA-3'

[SEQ ID NO:107]5'-AATTAAGCTA GCTATAAACG CAGAAAGGCC CA-3'

4-4：利用合成sRNA在14个不同的重组大肠杆菌菌株中生产酪氨酸的实验

将总共四个组合转化到14种不同的大肠杆菌菌株中，所述组合包括所 构建的含抗-tyrR的pTyr-b和不含sRNA的pTyr-b的组合，以及所构建的含 抗-tyrR的pTyr-b和含各sRNA的pTyr-b的组合。按照与上述摇瓶培养方法 相同的方式培养菌株，测定开始培养后48小时内的最高酪氨酸浓度。

结果如图11所示，最佳组合是在S17-1菌株中tyrR和csrA基因沉默的 情形。该组合显示摇瓶中酪氨酸的浓度为2.0g/L。

在这些组合中，抗-tyrR+抗-ppc的组合以及抗-tyrR-抗-pgi的组合显示酪 氨酸产量下降。特别地，如图12所示，导入抗-pgi的宿主细胞的生长被抑 制，因而酪氨酸的总产量下降。

4-5：通过利用合成sRNA调控表达来恢复细胞生长以及增加酪氨酸产量

如实施例4-4所述，当pgi表达被抑制时，细胞生长被抑制，导致酪氨 酸的总产量下降。这表明，当细胞生长有所恢复时，即使进入酪氨酸生物合 成途径的代谢通量损失，酪氨酸的总产量也会增加。基于该启发，对pgi基 因的表达进行调控。这种调控是通过从pgi结合序列和抗-pgi序列缺失一部 分(一个或两个)核苷酸以降低结合能来进行的。具体地，利用抗-pgi克隆 的pWAS作为模板，利用SEQ ID NO:108和SEQ ID NO:104的引物通过定 点诱变构建包括缺失一个核苷酸的抗-pgi-D1，利用SEQ ID NO:109和SEQ  ID NO:104的引物通过定点诱变构建包括缺失两个核苷酸的抗-pgi-D2(图 13)。

所用引物序列

[SEQ ID NO:108]5'-ATCCAACGCAGGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:109]5'-TCCAACGCAGGCAACCATTATCACCGCC-3'

按照与实施例4-3所述相同的方式将各构建的基因克隆到pTyr-a质粒 中，并将各质粒克隆到14种不同的大肠杆菌菌株中。然后，检测各菌株中 酪氨酸的产量。

结果如图11所示，当合成sRNA的结合序列的一个或多个核苷酸被缺 失以降低结合能时，所有重组大肠杆菌菌株中的酪氨酸产量增加。特别地， 如图11所示，在将生产酪氨酸能力最低的TOP10菌株与生产酪氨酸能力最 高的S17-1菌株的生长速率进行比较时，可以看出，随着sRNA的结合能下 降，宿主微生物的生长速率逐渐恢复。

通过该实施例可以看出，根据本发明的合成sRNA可用于抑制靶基因的 表达，且可以调控它抑制靶基因表达的能力，表明sRNA基因可用于调控各 种靶基因的表达。

4-6：合成sRNA在各菌株之间对靶基因表达的抑制比较

从上述实施例的结果可以看出，各菌株之间酪氨酸的产量不同，表明选 择最合适的菌株很重要。此外可以看出，传统的基因缺失方法是耗时的，而 根据本发明的合成sRNA可以很容易地构建且可以快速应用至各种菌株，表 明合成sRNA非常适合测定菌株的代谢能力并选择最合适的菌株。然而， sRNA在已知的原核生物中的进化是高度保守的，这样区分合成sRNA在各 菌株之间对靶基因的抑制效果的可能性很低。为了验证这个事实，进行以下 实验。

在该实施例中，按照与实施例3中所述的相同的方式构建基因。在实施 例3中，DsRed2与luxR、araC和kanR基因的每一个融合，但在该实施例 中，DsRed2与pgi、csrA、tyrR和ppc基因的每一个融合，通过荧光测定各 基因的表达程度。在这里，对酪氨酸生产力最高的S17-1菌株和酪氨酸生产 力最低的TOP10菌株的基因表达进行比较。如果S17-1菌株与TOP10菌株 之间的基因表达没有差异，则其它菌株之间的基因表达将不会有差异。

对于pgi的克隆，利用S17-1染色体作为模板以及SEQ ID NO:110和 SEQ ID NO:111的引物通过PCR扩增pgi，用PacI/XhoI裂解PCR产物然后 将其克隆到实施例3的DsRed2报告质粒中。按照相同的方式，利用SEQ  ID NO:112和SEQ ID NO:113的引物通过PCR扩增tyrR，利用SEQ ID  NO:114和SEQ ID NO:115的引物通过PCR扩增csrA，利用SEQ ID NO:116 和SEQ ID NO:117的引物通过PCR扩增ppc，并克隆PCR产物。在将要测 定S17-1菌株中对目的基因表达的抑制时，在S17-1染色体中进行克隆，而 在将要测定TOP10菌株中对目的基因表达的抑制时，在TOP10染色体中进 行克隆。

所用引物序列

[SEQ ID NO:110]5'- AATTATTAATTAAACAATTCTCAAAATCAGAAG AGTATTGCTA-3'

[SEQ ID NO:111]5'-AATTACTCGAGCAGCATCTGATCGTCGAAGG- 3'

[SEQ ID NO:112]5'-AATTATTAATTAATAATTGTTCTTTTTTCAGGT GAAGGTTCCC-3'

[SEQ ID NO:113]5'-AATTACTCGAGACCGCGTAAATCAATGCCTC TTA-3'

[SEQ ID NO:114]5'-AATTATTAATTAACTCTTTTAATCTTTCAA GGAGCAAAGA-3'

[SEQ ID NO:115]5'-AATTACTCGAGACGCTGGTAGATCTCTTCAC G-3'

[SEQ ID NO:116]5'- AATTATTAATTAAATAAGATGGGGTGTCTGGGGTAAT-3'

[SEQ ID NO:117]5'-AATTACTCGAGATCATTGCCAGCGCGTGAAG- 3'

结果如图14所示，抗-tyrR在S17-1和TOP10中显示抑制率分别为 85.6±9.4％和80.0±9.1％，抗-csrA显示抑制率为84.9±9.8％和87.8±6.7％。剩 余的sRNA显示出与这些sRNA所显示的相类似的抑制率。这表明，合成 sRNA在各菌株之间显示出相似的抑制率且在各菌株中展现出相同的效果。

4-7：pTyr-a(抗-csrA)/pTyr-b(抗-tyrR)质粒转化的S17-1菌株的发酵

用pTyr-a(抗-csrA)质粒和pTyr-b(抗-tyrR)质粒各自转化最终选定的S17- 1菌株，并将重组微生物进行分批发酵。

具体地，在37℃，含1％阿拉伯糖、25μg/ml氨苄青霉素和25μg/ml卡 那霉素的LB培养基中培养200ml的重组微生物，并且培养是在2L发酵罐 (Bioflo3000，New Brunswick Scientific Co.，爱迪生市，新泽西州)中进 行的。在这里，初始OD为0.5。进料溶液包括600g/L葡萄糖、7.5 g/L(NH₄)₂SO₄、2g/L KH₂PO₄和5g/L酵母提取物，并且每当发酵罐中培养 基的pH从6.8变化0.01时，加入25％(v/v)NH₄OH来调整pH。此外，通过 提供1vvm(空气体积/工作容积/min)使溶解氧的浓度保持在40％的恒定水 平，搅拌速度自动控制为每分钟达1000转。

培养总共进行110小时。图15示出了细胞OD以及酪氨酸的产量。从 图15可以看出，生成酪氨酸的浓度达21.9g/L。

4-8：各大肠杆菌菌株中苯酚的生产

进行使产生的酪氨酸转化为苯酚的实验。具体地，为了表达将酪氨酸转 化为苯酚的tpl基因，利用SEQ ID NO:118和SEQ ID NO:119的引物无需模 板合成placIQ启动子，用SacI/PacI裂解合成的启动子，然后将其克隆到 pWA-J23113-T1/TE中以置换启动子。此外，利用SEQ ID NO:120和SEQ  ID NO:121的引物从多杀性巴氏杆菌染色体(GenBank,002663.1)通过PCR扩 增tpl基因，然后利用PacI/EcoRI将其克隆到pWA-placIQ-T1/TE中。利用 SEQ ID NO:122和SEQ ID NO:96的引物通过PCR扩增上述构建的基因，用 SpeI/SacI裂解，然后连接到用XbaI/SacI裂解的pTyr-a(抗-csrA)质粒，由 此构建pTyr-a(抗-csrA)-TPL质粒。

[SEQ ID NO:118]5'- GAGCTCTTGGTGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCAAGC ACATATCGAAAGGATAGTCTTGATAACCATAAGTTTAATTAA-3'

[SEQ ID NO:119]5'- TTAATTAAACTTATGGTTATCAAGACTATCCTTTCGATATGTGCTTGGC GCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCACCAGAGCTC-3'

[SEQ ID NO:120]5'- TTAATTAAAGGAGAAAGATTATGAGAAACTATCCTGCAGAACCTTATA -3'

[SEQ ID NO:121]5'- GAATTCTTAATGGTGATGATGGTGATGCGCTTACGCTTTCGGTTCAAA ACGCG-3'

[SEQ ID NO:122]5'-CATTAACTAGTTGGTGCAAAACCTTTCGCG-3'

将构建的质粒与pTyr-b(抗-tyrR)质粒一起转化到实施例4-2中试验的14 种不同的大肠杆菌菌株中，然后按照与上述酪氨酸培养方法相同的方式对各 重组菌株进行摇瓶培养，测定培养48小时期间苯酚的最高产量。

结果从图16可以看出，W3110菌株显示出最高的苯酚产量(357.6㎎ /L)，而以上实施例中显示出最高的酪氨酸生产力的S17-1菌株显示苯酚产 量为68.8mg/L。

实施例5：利用合成sRNA的产生尸胺的重组微生物的生产

在该实施例中，提高赖氨酸生物合成途径的代谢通量，然后选择待沉默 的基因，以进一步增加利用赖氨酸脱羧酶(CadA)使赖氨酸转化为尸胺的重组 微生物中的尸胺的产量。

图16示出了自葡萄糖的尸胺生物合成途径。这些生物合成途径包括产 生其他代谢产物的消耗途径。为了增加尸胺的产量，优选阻断消耗代谢产物 的网络。

在该实施例中，选择8种能够抑制这些网络的候选基因，构建能够抑制 这些基因表达的合成sRNA。选择的候选基因如下：gltA(柠檬酸合成 酶)、thrA(天冬氨酸激酶I)、thrB(高丝氨酸激酶)、thrC(苏氨酸合 酶)、thrL(thr操纵子前导肽)、metB(胱硫醚γ-合酶)、murE(UDP-N- 乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-谷氨酰-L-赖氨酸连接酶)和murF(UDP-N-乙酰胞 壁酰丙氨酰-D-谷氨酰-2,6-二氨基庚二酸-D-丙氨酰-D-丙氨酸连接酶。

具体地，利用(实施例1中构建的)pWAS作为模板以及SEQ ID  NO:123和SEQ ID NO:124的引物通过定点诱变构建抗-glt(合成sRNA)。 按照相同的方式，利用SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:126的引物构建抗- metB；利用SEQ ID NO:127和SEQ ID NO:128的引物构建抗-murE；利用 SEQ ID NO:129和SEQ ID NO:130的引物构建抗-murF；利用SEQ ID  NO:131和SEQ ID NO:132的引物构建抗-thrA；利用SEQ ID NO:133和SEQ  ID NO:134的引物构建抗-thrB；利用SEQ ID NO:135和SEQ ID NO:136的 引物构建抗-thrC；以及利用SEQ ID NO:137和SEQ ID NO:138的引物构建 抗-thrL。

所用引物序列

[SEQ ID NO:123]5'-AAAGCAAAACTCGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:124]5'- TGTATCAGCCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

[SEQ ID NO:125]5'-ACAGGCCACCATGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:126]5'- TTACGCGTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

[SEQ ID NO:127]5'-AATTTGCGCGACGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:128]5'- ACGATCTGCCACTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

[SEQ ID NO:129]5'-AACCCTTAGCCAGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:130]5'- ACGCTAATCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

[SEQ ID NO:131]5'-AAGTTCGGCGGTGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:132]5'- CAACACTCGCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

[SEQ ID NO:133]5'-TATGCCCCGGCTGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:134]5'- AACTTTAACCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

[SEQ ID NO:135]5'-AATCTGAAAGATGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:136]5'- GTAGAGTTTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

[SEQ ID NO:137]5'-AGCACCACCATTGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:138]5'- AATGCGTTTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

将利用引物序列通过定点诱变构建的基因按以下方式转化到DH5a细胞 (Invitrogen)中。利用含LB琼脂、1％阿拉伯糖和100μg/ml氨苄青霉素的平 板培养基在25℃培养2天，并使得到的菌落在含1％琼脂糖和100μg/ml氨 苄青霉素的液体LB培养基中培养。然后，从细胞中纯化质粒并测序，并在 随后的实验中使用正确的质粒。在存在1％阿拉伯糖和25℃时，这种培养有 效抑制合成sRNA的表达，因而是必要的过程。此外，如果由合成sRNA靶 向的染色体基因对宿主细胞的生长具有显著影响，则当不抑制合成sRNA的 表达时，细胞的生长将会不充分。合成sRNA的这种影响会在随后的实验中 带来困难，因此应避免。然而，如果合成sRNA对细胞生长没有影响，则可 在不含阿拉伯糖或在37℃条件下进行培养。当进行生产所需代谢产物的培 养时，应充分表达合成sRNA，因此在这种情况下，在不含阿拉伯糖和37℃ 条件下进行培养。

将上述构建的合成sRNA各自转化到高效生产尸胺的重组微生物XQ56 (含p15CadA质粒)中。该实施例中使用的XQ56菌株是通过Qian的方法 构建的(Qian,Biotechnology and Bioengineering,108(1):93-103,2011)。简要 地，为了生产尸胺，从大肠杆菌中删除作为尸胺降解酶的speE、speG、 puuA和ygiG基因，且为了增加尸胺前体代谢产物的产量，将iclR也删除。 此外，为了消除作为尸胺的直接前体的赖氨酸的反馈抑制，对染色体进行修 饰，使得dapA、dapB和lysA基因的启动子不受赖氨酸抑制而持续表达。 最后，为了充分生产尸胺，使由赖氨酸生产尸胺的cadA基因以质粒 (p15CadA)的形式过表达。以这种方式，构建本发明中使用的XQ56菌株。

转化之后，将得到的菌落转移到液体LB培养基(1％阿拉伯糖、25 μg/ml氨苄青霉素和25μg/ml卡那霉素)中并在25℃培养至静止期。然后， 将细胞以1/100的体积比转移到含50 ml培养基(参见下表3)的摇瓶中， 然后在37℃培养24小时。然后，对培养基的上清液进行采样，通过HPLC 分析测定样品中尸胺的浓度。具体地，使样品与邻苯二甲醛反应，然后通过 反向HPLC进行分析(Qian,Biotechnology and Bioengineering,108(1):93-103, 2011)。

表3

[表3]

化合物 浓度 (NH₄)₂HPO₄2g/L KH₂PO₄6.75g/L 柠檬酸 0.85g/L MgSO₄·7H₂O 0.7g/L (NH₄)₂SO₄3g/L 葡萄糖 20g/L 微量元素溶液 5ml/L(表4)

表4

[表4]

化合物 浓度 FeSO₄·7H₂O 10g/L ZnSO₄·7H₂O 2.25g/L MnSO₄·7H₂O 0.5g/L CuSO₄·5H₂O 1g/L (NH₄)₆Mo7O₂₄·4H₂O 0.106g/L Na₂B₄O₇·10H₂O 0.23g/L CaCl₂1.35g/L 35％HCl 10ml

结果从图19可以看出，基本菌株(XQ56，含p15CadA质粒)中尸胺 的产量为1.4±0.05g/L，将它作为100％时，八个候选基因中的murE、metB 和thrL各表达被抑制的菌株显示出尸胺产量增加为：对于murE，增加 55％(2.15g/L)，对于metB，增加24％(1.73g/L)，以及对于thrL，增加 34％(1.87g/L)。

这样的实验结果表明根据本发明的合成sRNA可用于调控不同靶基因的 mRNA表达。

实施例6：对合成sRNA的抑制效率的调控以及随导入的合成sRNA的数量变化的细胞生长变化的测量

6-1：对实施例3的合成sRNA的抑制效率的调控

为了证明可通过调控合成sRNA与靶mRNA之间的结合能来控制合成 sRNA的抑制效率，利用包括MicC结构的质粒和用于在pWAS质粒中表达 合成sRNA的PR启动子为模板构建具有不同结合能的合成抗-DsRed2sRNA 以及合成抗-LacZ sRNA。

在抗-DsRed2sRNA的情形中，如下文所述随机产生结合位点序列，以 产生宽能量范围，在抗-LacZ sRNA的情形中，利用UNAFold程序如下文所 述设计对应于能量范围的各结合序列。当使用DsRed2时，利用SEQ ID  NO:169和SEQ ID NO:170的引物通过上述定点诱变产生各种抗-DsRed2 sRNA，而当使用LacZ时，利用正向/反向引物(如SEQ ID NOS:171/172, 173/174,...195/196的引物)通过上述定点诱变产生各种抗-LacZ sRNA。

用于抗-dsRed2变体的引物

[SEQ ID NO:169]5'-NNNNNNNNNNNNNNNN GCAACCATTATCACCGCCA-3'

[SEQ ID NO:170]5'-NNNNNNNNNNNNNNNN TTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

(N为任何核苷酸)。

用于抗-LacZ变体的引物

[SEQ ID NO:171]5'- ATGATGCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAA-3'

[SEQ ID NO:172]5'-GGTCAT TTTCTGTTGGGCCATTGCATTGCCAC- 3'

[SEQ ID NO:173]5'- ATGATTGCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAA-3'

[SEQ ID NO:174]5'-GGTCAT TTTCTGTTGGGCCATTGCATTGCCAC- 3'

[SEQ ID NO:175]5'- TGATTAGCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAA-3'

[SEQ ID NO:176]5'-TGGTCAT TTTCTGTTGGGCCATTGCATTGCCAC-3'

[SEQ ID NO:177]5'- TGATTACGCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAA-3'

[SEQ ID NO:178]5'-TGGTCAT TTTCTGTTGGGCCATTGCATTGCCAC-3'

[SEQ ID NO:179]5'- GATTACGGCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAA-3'

[SEQ ID NO:180]5'-ATGGTCAT TTTCTGTTGGGCCATTGCATTGCCAC-3'

[SEQ ID NO:181]5'- GATTACGGGCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAA-3'

[SEQ ID NO:182]5'-ATGGTCAT TTTCTGTTGGGCCATTGCATTGCCAC-3'

[SEQ ID NO:183]5'- ATTACGGAGCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAA-3'

[SEQ ID NO:184]5‘-CATGGTCAT TTTCTGTTGGGCCATTGCATTGCCAC-3'

[SEQ ID NO:185]5'- TTACGGATTGCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAA-3'

[SEQ ID NO:186]5'-TCATGGTCAT TTTCTGTTGGGCCATTGCATTGCCAC-3'

[SEQ ID NO:187]5'- TTACGGATTCGCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAA-3'

[SEQ ID NO:188]5'-TCATGGTCAT TTTCTGTTGGGCCATTGCATTGCCAC-3'

[SEQ ID NO:189]5'- TACGGATTCAGCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAA-3'

[SEQ ID NO:190]5'-ATCATGGTCAT TTTCTGTTGGGCCATTGCATTGCCAC-3'

[SEQ ID NO:191]5'- TACGGATTCACGCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAA-3'

[SEQ ID NO:192]5'-ATCATGGTCAT TTTCTGTTGGGCCATTGCATTGCCAC-3'

[SEQ ID NO:193]5'- ACGGATTCACTGGCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAA-3'

[SEQ ID NO:194]5'-AATCATGGTCAT TTTCTGTTGGGCCATTGCATTGCCAC-3'

[SEQ ID NO:195]5'- GGATTCACTGGCCGGCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAA-3'

[SEQ ID NO:196]5'-GTAATCATGGTCAT TTTCTGTTGGGCCATTGCATTGCCAC-3'

具体地，测定以0至-60kcal/mol范围内的结合能，结合到各mRNA的 各个sRNA以及各合成sRNA对靶mRNA表达的抑制程度。

在DsRed2的情形中，在LB培养基中培养细胞至对数生长期，然后将 1ml培养基以5,000rpm离心，以除去培养基成分而只剩下细胞。向剩余的 细胞中加入1ml的PBS缓冲液，以使细胞容易混合，然后在波长563nm处 激发细胞中的DsRed2蛋白，并在582nm处通过FACS测定其发出的荧 光。通过减去从无DsRed2的条件下培养的细胞发出的荧光强度来校正发出 的荧光强度。将测得的强度中的最高值作为1，基于该值使其它荧光强度归 一化。

在LacZ的情形中，按照与DsRed2的情形使用的相同培养基培养细胞 至相同的阶段，然后向20μl培养物中加入800μl的破膜液(60mM  Na₂HPO₄、40mM NaH₂PO₃、10mM KCl、1mM MgSO₄、3.56μl/mlβ-巯基 乙醇)。并向其中加入200μl的底物溶液(60mM Na₂HPO₄、40mM  NaH₂PO₄、2mg/ml邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG))。接下来，使细胞在 37℃静置足够长的时间，以发生显色反应，然后向其中加入500μl的停止 液(1M Na₂CO₃)以停止反应，并测量420nm处的吸光度。将从各个sRNA测 得的LacZ显色值中的最高值作为1，基于该值使其它值归一化，以确定相 对值。

于是，从显示这两个实验的结果的图23可以看出，当结合能在约-10 kcal/mol至-40kcal/mol的范围内时，靶基因的表达被线性抑制。这表明，当 根据本发明的合成sRNA被构建为以-10kcal/mol至-40kcal/mol范围内的结 合能结合到靶mRNA时，它可抑制靶mRNA的表达至期望水平。

6-2：随导入的实施例3的合成sRNA的数量变化的细胞生长变化的测定

当合成sRNA被额外导入质粒以调控靶基因的表达并在细胞中生成时， 它可通过利用细胞的能量源而干扰细胞的生长。因此，检测额外导入的合成 sRNA对细胞生长以及细胞内蛋白质表达的影响(图24a)。具体地，将0 到4个合成sRNA导入具有ColE1复制起点的质粒中，然后测定DsRed2基 因在质粒中表达水平的变化。将合成sRNA导入具有ColE1复制起点的质粒 的EcoRI和KpnI位点中，由此构建包括一个sRNA的质粒(Rmo)。利用构 建的质粒作为模板，用SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198的引物进行 PCR，用SacI和BglII裂解PCR产物并将其导入Rmo质粒中，由此构建包 括两个sRNA的质粒(Rmo2)。利用Rmo作为模板，用SEQ ID NO:199和 SEQ ID NO:200的引物进行PCR，用SpeI/BamHI裂解PCR产物，然后将 其导入Rmo2质粒中，由此构建包括三个sRNA的质粒(Rmo3)。利用Rmo 作为模板，用SEQ ID NO:201和SEQ ID NO:202的引物进行PCR，用 SphI和SalI裂解PCR产物，然后将其导入Rmo3质粒中，由此构建包括四 个sRNA的质粒(Rmo4)。通过测量下文所述的荧光强度确定包括0-4个 sRNA的质粒中的DsRed2的表达水平。

[SEQ ID NO:197]5'-AATTAA AGATCT TAACACCGTGCGTGTTGA-3'

[SEQ ID NO:198]5'-GAGCTC TATAAACGCAGAAAGGCCCA-3'

[SEQ ID NO:199]5'-ACTAGT TAACACCGTGCGTGTTGA-3'

[SEQ ID NO:200]5'-GGATCC TATAAACGCAGAAAGGCCCA-3'

[SEQ ID NO:201]5'-GCATGC TAACACCGTGCGTGTTGA-3'

[SEQ ID NO:202]5'-GTCGAC TATAAACGCAGAAAGGCCCA-3'

结果可以看出，即使导入多达三个合成sRNA时，也不会影响DsRed2 的表达(图24b)。此外，测定导入0-4个合成sRNA是否对细胞的生长速 率有任何影响。在这种情况下，测定细胞的对数生长期的光密度(600nm)， 并将其拟合到以下细胞生长曲线方程，以计算单位时间的细胞生长常数 (k)：y＝y₀exp(k·t)，其中y₀是初始O.D.600值，t是时间。结果可以看出， 导入多达三个合成sRNA时，k值略有下降，但下降不显著。这表明，向细 胞中导入多达三个合成sRNA不会显著影响细胞的生长(图24c)。

6-3：对实施例4-5的合成sRNA的抑制效率的调控

像实施例4-5的pgi的情况一样，修饰抗-csrA sRNA的结合序列以改变 结合能，以使csrA基因的表达水平多样化。具体地，利用pWAS-抗-csrA 质粒作为模板以及以下引物对进行PCR，由此置换结合序列。

[SEQ ID NO:203]5'-TTCCTCGTCG GCAACCATTA TCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:204]5'-GAATCAGCATTTTCTGTTGGGCCATTGC-3'

[SEQ ID NO:205]5'-GACTCGTCGA GGCAACCATT ATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:206]5'-AGAATCAGCATTTTCTGTTGGGCCATTGC-3'

[SEQ ID NO:207]5'-TAACTCGTCG GCAACCATTA TCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:208]5'-GAATCAGCATTTTCTGTTGGGCCATTGC-3'

[SEQ ID NO:209]5'-TCGTCGAGTT GGTGGGCAAC CATTATCACC GCC-3'

[SEQ ID NO:210]5'-TCAGA ATCAGCATTTTCTGTTGGGCCATTGC-3'

[SEQ ID NO:211]5'-CCGTCGAGTT GGTGGGCAAC CATTATCACC GCC-3'

[SEQ ID NO:212]5'-TCAGA ATCAGCATTTTCTGTTGGGCCATTGC-3'

[SEQ ID NO:213]5'-AGTCGAGTTG GTGAGGCAAC CATTATCACC GCC-3'

[SEQ ID NO:214]5'-CGTCA GAATCAGCATTTTCTGTTGGGCCATTGC-3'

[SEQ ID NO:215]5'-GTCGAGTTGG TGAGGGCAAC CATTATCACC GCC-3'

[SEQ ID NO:216]5'-AGTCA GAATCAGCATTTTCTGTTGGGCCATTGC-3'

[SEQ ID NO:217]5'-TCGAGTTGGT GAGGGCAACC ATTATCACCG CC-3'

[SEQ ID NO:218]5'-CGGTCA GAATCAGCATTTTCTGTTGGGCCATTGC-3'

利用pWAS作为模板以及SEQ ID NO:105和SEQ ID NO:96的引物通 过PCR扩增上述构建的各抗-csrA，用SpeI/SacI裂解PCR产物并将其连接 到用XbaI/SacI裂解的pTyr-a载体。以这种方式，构建结合能范围在-30 kcal/mol至-50kcal/mol的各抗-csrA sRNA。将按这种方式构建的合成sRNA 导入显示最高产量的S17-1大肠杆菌菌株中，按照与实施例4-4中所述的相 同方式测定酪氨酸的产量。

结果从图25可以看出，最高产量显示能量值为-39.2kcal/mol。该结合 能量值与以上构建的抗-csrA sRNA的情况中的结合能量值一致。

这表明，合成sRNA可用于抑制靶基因的表达且其抑制效率可被调控。

实施例7：用于增加酪氨酸产量的附加基因的识别

在该实施例中，为了识别除被抑制时对酪氨酸产量有积极影响的 tyrR/csrA基因之外的其它基因，构建84种sRNA，这些sRNA可控制参与 糖酵解和TCA网络的基因以及调控其表达的转录调节因子。下面列出这些 基因。

accA(乙酰辅酶A羧基转移酶，α-亚基)

accB(生物素化的生物素-羧基载体蛋白)

accC(乙酰辅酶A羧化酶)

accD(乙酰辅酶A羧基转移酶，β-亚基)

aceE(丙酮酸脱氢酶复合体的E1p成分的亚基)

aceF(丙酮酸脱氢酶)

ackA(丙酸激酶/乙酸激酶活性)

adiY(AdiY是调控精氨酸的正DNA结合转录调控因子)(脱羧酶(adi) 体系)

argB(乙酰谷氨酸激酶)

argC(N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶)

argG(精氨基琥珀酸合酶)

argH(精氨基琥珀酸裂解酶)

asnC(激活asnA表达的转录调控因子，参与天冬氨酰合成的基因)

aspA(天冬氨酸裂氨酶)

crp(CRP转录双向调控因子)

csiD(预测蛋白。CsiD是由碳饥饿诱导的基因产物)

csiR(DNA结合转录抑制因子)

cytR(用于转运以及利用核糖核苷和脱氧核糖核苷所需的转录因子)

dcuA(DcuA转运体是已知在厌氧条件下负责摄入C4－二羧化物(诸 如延胡索酸)的三个转运体之一)

deoB(戊磷酸变位酶)

deoC(脱氧核苷－磷酸醛缩酶)

deoR(转录抑制因子DeoR，即“脱氧核糖调控因子”，参与与脱氧核 糖核苷酸转运和分解相关的基因的阴性表达)

fabH(KASIII，β-酮乙酰-ACP合酶)

fadD(脂酰辅酶A)

fadR(FadR脂肪酸降解调节子，是对脂肪酸降解调节子[Simons80, Simons80a]和乙酸盐代谢施加负调控的多功能双向调控因子)

fbp(果糖-1,6-二磷酸酶)

fnr(FNR是介导从有氧生长到无氧生长的过渡的主要转录调控因子)

fruR(FruR是通过不同能量代谢途径调节碳流方向但独立于CRP调控 因子的具有多效性作用的双向转录调控因子)

ftsL(细胞分裂的必要蛋白FtsL)

ftsQ(细胞分裂的必要蛋白FtsQ)

ftsW(细胞分裂的必要蛋白FtsW)

ftsZ(细胞分裂的必要蛋白FtsZ)

fur(Fur-Fe+2DNA结合转录双向调控因子)

gabD(NADP+-依赖型琥珀酸半缩醛脱氢酶)

gabP(APC转运体)

gabT(4-氨基丁酸转氨酶)

gadA(谷氨酸脱羧酶A亚基)

gadB(谷氨酸脱氢酶B亚基)

gadC(GABA APC转运体)

glcC(GntR家族转录调控因子，glc操纵转录激活因子)

glpK(甘油激酶)

glpR(sn-甘油-3-磷酸抑制剂)

glpX(果糖1,6-二磷酸酶II)

gltA(柠檬酸合成酶)

hfld(溶源化调控因子)

ihfa(IHF，整合宿主因子，是球形调节蛋白)

ihfb(IHF，整合宿主因子，是球形调节蛋白)

ilvB(乙酰羟丁酸酯合酶/乙酰乳酸合酶)

ilvC(乙酰羟酸还原异构酶)

ilvD(二羟酸脱水酶)

ilvG_1(乙酰乳酸合酶II，大亚基，N端片段(假基因))

ilvG_2(乙酰乳酸合酶II，大亚基，C端片段(假基因))

ilvH(乙酰乳酸合酶/乙酰羟丁酸酯合酶)

ilvL(ilvGEDA操纵子前导肽)

ilvM(乙酰羟丁酸酯合酶/乙酰乳酸合酶)

ilvN(乙酰羟丁酸酯合酶/乙酰乳酸合酶)

ilvX(预测小分子蛋白)

lexA(LexA抑制参与对DNA损伤的细胞应答的几种基因的转录)

lpxC(UDP-3-O-乙酰基-N-乙酰葡糖胺脱乙酰酶)

marA(MarA参与调控与抗生素抗性、氧化应激、有机溶剂和重金属相 关的基因)

metJ(MetJ转录抑制子)

modE(ModE是控制与钼转运、钼酶合成以及与钼相关功能的操纵子 的转录的主要调控因子)

nadB(L-天冬氨酸氧化酶)

narL(硝酸盐/亚硝酸盐响应调控因子)

pck(磷酸烯醇丙酮酸羧激酶)

PdhR(PdhR，调控与丙酮酸脱氢酶复合体有关的基因的“丙酮酸脱氢 酶复合体调控因子”)

phoP(PhoP-磷酸化DNA结合转录双向调控因子。是与适应低Mg2+环 境和控制抗酸性基因相关的双组分调节体系ph0Q/phoP中的一员)

pnuC(PnuC NMN转运体)

ppsA(磷酸烯醇丙酮酸合成酶)

pta(磷酸乙酰转移酶)

purA(腺苷酸琥珀酸合成酶)

purB(腺苷酸琥珀酸裂解酶)

purR(PurR-次黄嘌呤DNA结合转录抑制因子。调控与嘌呤核苷酸生 物合成及其自身合成相关的几种基因的PurR二聚体)

puuE(4-氨基丁酸转氨酶)

rbsA(核糖ABC转运体)

rbsB(核糖ABC转运体)

rbsD(核糖吡喃酶)

rbsK(核糖激酶)

rbsR(转录因子RbsR，负性自动调节并控制与核糖代谢和转运相关的 操纵子的转录的“核糖抑制因子”)

rcsB(RcsB-BglJ DNA结合转录激活因子。“调控荚膜合成B”的 RcsB蛋白，属于多组分RcsF/RcsC/RcsD/RcsA-RcsB磷酸中继体系的反应调 节蛋白且与调控荚膜多糖可拉酸的合成、细胞分裂、周质蛋白、游动性和小 分子RNA有关的响应调控因子)

rutR(RutR直接或间接调控与复杂的嘧啶代谢途径相关的基因)

serA(α-酮戊二酸还原酶/D-3-磷酸甘油脱氢酶)

serC(磷酸羟苏氨酸转氨酶/3-磷酸丝氨酸转氨酶)

soxS(参与超氧化物和一氧化氮移除的双向转录激活因子)

sroD(SroD小分子RNA)

zwf(葡萄糖6-磷酸-1-脱氢酶)

此外，用于构建这些基因的引物序列如下：

抗-accA

[SEQ ID NO:219]5'-TTCCTTGATTTTGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:220]5'- ATTCAGACTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-accB

[SEQ ID NO:221]5'-AAGATTAAAAAAGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:222]5'- ACGAATATCCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-accC

[SEQ ID NO:223]5'-ATTGTTATTGCCGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:224]5'- TTTATCCAGCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-accD

[SEQ ID NO:225]5'-GAACGAATTAAAGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:226]5'- AATCCAGCTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-aceE

[SEQ ID NO:227]5'-TTCCCAAATGACGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:228]5'- ACGTTCTGACATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-aceF

[SEQ ID NO:229]5'-ATCAAAGTACCGGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:230]5'- TTCGATAGCCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-ackA

[SEQ ID NO:231]5'-GCAACGTTAGTCGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:232]5'- TCCCCGGAACATTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-adiY

[SEQ ID NO:233]5'-AGCGACCAACCTGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:234]5'- GCAAATCCTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-argB

[SEQ ID NO:235]5'-ATTATCAAACTGGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:236]5'- TAATGGATTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-argC

[SEQ ID NO:237]5'-CTGATTGTGGGTGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:238]5'- CGTATTCAACATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-argG

[SEQ ID NO:239]5'-CTCAAGCATCTCGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:240]5'- AATCGTCGTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-argH

[SEQ ID NO:241]5'-GGCGGGCGTTTTGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:242]5'- CCAAAGTGCCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-asnC

[SEQ ID NO:243]5'-CTGATCGACAATGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:244]5'- ATAATTTTCCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-aspA

[SEQ ID NO:245]5'-ATTCGTATCGAAGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:246]5'- GTTGTTTGACATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-crp

[SEQ ID NO:247]5'-AAACCGCAAACAGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:248]5'-GCCAAGCACCATTTTCTGTTGG GCCATTGCATTG-3'

抗-csiD

[SEQ ID NO:249]5'-ACCGCCGTACAAGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:250]5'- CAGTGCATTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-csiR

[SEQ ID NO:251]5'-TCTCTGGATGGCGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:252]5'- CGTAATGGTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-cytR

[SEQ ID NO:253]5'-AAGCAGGAAACTGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:254]5'- CTTCGCTTTCACTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-dcuA

[SEQ ID NO:255]5'-GAACTCATCATAGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:256]5'- TACAACTAGCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-deoB

[SEQ ID NO:257]5'-TTTATTATGGTGGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:258]5'-TGCACGTTTCATTTTCTGTTGG GCCATTGCATTG-3'

抗-deoC

[SEQ ID NO:259]5'-AAAGCAAGCAGCGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:260]5'-CAGATCAGTCATTTTCTGTTGG GCCATTGCATTG-3'

抗-deoR

[SEQ ID NO:261]5'-CGCGAAGAGCGTGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:262]5'- ACGTGTTTCCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-fabH

[SEQ ID NO:263]5'- TAATGGAGCTGTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

[SEQ ID NO:264]5'- ACCCTATTGATCGTTGCAACCATTATCACCGCCAGA-3'

抗-fadD

[SEQ ID NO:265]5'-TGGCTTAACCGTGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:266]5'- AACCTTCTTCAATTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-fadR

[SEQ ID NO:267]5'-GCGCAAAGCCCGGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:268]5'- CTTAATGACCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-fbp

[SEQ ID NO:269]5'-GGTGAATTTATTGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:270]5'-TAACGTTTTCATTTTCTGTTGG GCCATTGCATTG-3'

抗-fnr

[SEQ ID NO:271]5'-AAGCGAATTATAGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:272]5'-TTCCGGGATCATTTTCTGTTGG GCCATTGCATTG-3'

抗-fruR

[SEQ ID NO:273]5'-GAAATCGCTCGGGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:274]5'-ATCCAGTTTCACTTTCTGTTGG GCCATTGCATTG-3'

抗-ftsL

[SEQ ID NO:275]5'-GTGACAGAAGCTGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:276]5'- TCTGCTGATCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-ftsQ

[SEQ ID NO:277]5'-GCTCTGAACACGGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:278]5'- AGCCTGCGACATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-ftsW

[SEQ ID NO:279]5'-CTCCCTCGCCTGGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:280]5'- AGATAAACGCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-ftsZ

[SEQ ID NO:281]5'-ATGGAACTTACCGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:282]5'- TGGTTCAAACATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-fur

[SEQ ID NO:283]5'-AATACCGCCCTAGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:284]5'-GTTATCAGTCATTTTCTGTTGG GCCATTGCATTG-3'

抗-gabD

[SEQ ID NO:285]5'-GACAGTAACTTAGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:286]5'- GTTAAGTTTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-gabP

[SEQ ID NO:287]5'-TCGCAACCACATGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:288]5'- TGATTGCCCCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-gabT

[SEQ ID NO:289]5'-AAAGAGTTAATGGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:290]5'- ATTGCTGTTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-gadA

[SEQ ID NO:291]5'-CTGTTAACGGATGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:292]5'- CTTCTGGTCCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-gadB

[SEQ ID NO:293]5'-CAAGTAACGGATGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:294]5'- CTTCTTATCCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-gadC

[SEQ ID NO:295]5'-GTACAGACAGGTGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:296]5'- TGATGTAGCCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-glcC

[SEQ ID NO:297]5'- ACGTTCATCTTTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

[SEQ ID NO:298]5'- CGCCCTATTTGCGAAGCAACCATTATCACCGCCAGA-3'

抗-glpK

[SEQ ID NO:299]5'-AAATATATCGTTGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:300]5'-TTTTTCAGTCATTTTCTGTTGG GCCATTGCATTG-3'

抗-glpR

[SEQ ID NO:301]5'-CAACGTCACAACGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:302]5'-TGTTTGTTTCATTTTCTGTTGG GCCATTGCATTG-3'

抗-glpX

[SEQ ID NO:303]5'-CTTGCCATCGAAGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:304]5'-TTCTCGTCTCATTTTCTGTTGG GCCATTGCATTG-3'

抗-gltA

[SEQ ID NO:305]5'-AAAGCAAAACTCGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:306]5'- TGTATCAGCCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-hfld

[SEQ ID NO:307]5'-TACTATGACATCGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:308]5'- ATTCTTTGCCACTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-ihfa

[SEQ ID NO:309]5'- TTTTGTAAGCGCCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

[SEQ ID NO:310]5'- GCTGAAATGTCAGAAGCAACCATTATCACCGCCAGA-3'

抗-ihfb

[SEQ ID NO:311]5'- TTCTGACTTGGTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

[SEQ ID NO:312]5'- TTGATAGAAAGACTTGCAACCATTATCACCGCCAGA-3'

抗-ilvB

[SEQ ID NO:313]5'-GGCACAACATCGGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:314]5'- CGAACTTGCCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-ilvC

[SEQ ID NO:315]5'-TTCAATACACTGGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:316]5'- GTAGTTAGCCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-ilvD

[SEQ ID NO:317]5'-CGTTCCGCCACCGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:318]5'- GTACTTAGGCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-ilvG_1

[SEQ ID NO:319]5'-CACAGTGGGTGGGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:320]5'-CGCCATTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG- 3'

抗-ilvG_2

[SEQ ID NO:321]5'-AACAACTGTCGGGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:322]5'-TTAACAACAATTTCTGTTGGGCCATTGCATTG- 3'

抗-ilvH

[SEQ ID NO:323]5'-TTATCAGTCTTAGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:324]5'- TATCCGGCGCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-ilvL

[SEQ ID NO:325]5'-CTACGAGTGATTGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:326]5'- AAGGGCTGTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-ilvM

[SEQ ID NO:327]5'-CAGGTCAATGTAGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:328]5'- ATGTTGCATCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-ilvN

[SEQ ID NO:329]5'-ACTCATGACAACGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:330]5'- TGTGTTTTGCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-ilvX

[SEQ ID NO:331]5'-ACAAAATTCTGTGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:332]5'- GCTGTTATTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-lexA

[SEQ ID NO:333]5'-ACGGCCAGGCAAGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:334]5'- TAACGCTTTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-lpxC

[SEQ ID NO:335]5'-AGGACACTTAAAGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:336]5'- TTGTTTGATCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-marA

[SEQ ID NO:337]5'-GCAACGTTAGTCGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:338]5'- TCCCCGGAACATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-metJ

[SEQ ID NO:339]5'-AGCGGCGAATATGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:340]5'- CCATTCAGCCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-modE

[SEQ ID NO:341]5'-ATCCTTCTCACCGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:342]5'- TTCGGCCTGCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-nadB

[SEQ ID NO:343]5'-CCTGAACATTCAGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:344]5'- GAGAGTATTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-nagC

[SEQ ID NO:345]5'- CCGCCTGGTGTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

[SEQ ID NO:346]5'- ACAAGCTCAGATAGGGCAACCATTATCACCGCCAGA-3'

抗-narL

[SEQ ID NO:347]5'-GAACCGGCTACTGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:348]5'- CTGATTACTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-pck

[SEQ ID NO:349]5'-AATGGTTTGACCGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:350]5'- GTTAACGCGCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-PdhR

[SEQ ID NO:351]5'-AAAATCCGCCAAGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:352]5'- GCTGTAGGCCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-phoP

[SEQ ID NO:353]5'-GTTGTTGAAGACGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:354]5'- CAGTACGCGCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-pnuC

[SEQ ID NO:355]5'-AGTGTGCAGAATGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:356]5'- AAAAAAATCCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-ppsA

[SEQ ID NO:357]5'-GGCTCGTCACCGGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:358]5'-ATTGTTGGACATTTTCTGTTGG GCCATTGCATTG-3'

抗-purA

[SEQ ID NO:359]5'-GTCGTCGTACTGGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:360]5'- GTTGTTACCCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-purB

[SEQ ID NO:361]5'-TCACTGACCGCCGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:362]5'- GGATAATTCCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-purR

[SEQ ID NO:363]5'-AAAGATGTAGCGGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:364]5'- TATTGTTGCCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-puuE

[SEQ ID NO:365]5'-GAATTCCATCAGGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:366]5'- ATTGTTGCTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-rbsA

[SEQ ID NO:367]5'-CTTCAGCTTAAAGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:368]5'-TAATGCTTCCATTTTCTGTTGG GCCATTGCATTG-3'

抗-rbsB

[SEQ ID NO:369]5'-AAACTGGCTACCGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:370]5'-TTTCATGTTCATTTTCTGTTGG GCCATTGCATTG-3'

抗-rbsD

[SEQ ID NO:371]5'-ACCGTTCTTAATGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:372]5'-GCCTTTTTTCATTTTCTGTTGG GCCATTGCATTG-3'

抗-rbsK

[SEQ ID NO:373]5'-GGCAGCCTCGTTGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:374]5'-TGCGTTTTGCATTTTCTGTTGG GCCATTGCATTG-3'

抗-rbsR

[SEQ ID NO:375]5'-AAAGATGTTGCCGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:376]5'-CATTGTAGCCAATTTCTGTTGG GCCATTGCATTG-3'

抗-rcsB

[SEQ ID NO:377]5'-AACGTAATTATTGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:378]5'- CATATTGTTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-rutR

[SEQ ID NO:379]5'-GCAGTGAAAACAGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:380]5'- GCCTTGCGTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-serA

[SEQ ID NO:381]5'-TCGCTGGAGAAAGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:382]5'- TACCTTTGCCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-serC

[SEQ ID NO:383]5'-TTCAATTTTAGTGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:384]5'- GATTTGAGCCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-soxS

[SEQ ID NO:385]5'-AAAATTATTCAGGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:386]5'-CTGATGGGACATTTTCTGTTGG GCCATTGCATTG-3'

抗-sroD

[SEQ ID NO:387]5'-GCGCGCGGCAAAGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:388]5'- TTCGTCACGTAATTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-zwf

[SEQ ID NO:389]5'-CAAACAGCCCAGGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:390]5'-CGTTACCGCCATTTTCTGTTGG GCCATTGCATTG-3'

具体地，利用pWAS抗-csrA质粒作为模板以及上述引物通过定点诱变 置换这些基因的结合序列。按照以下方式将通过定点诱变构建的基因转化到 DH5a细胞(Invitrogen)中。利用含LB琼脂、1％阿拉伯糖和100μg/ml氨苄 青霉素的平板培养基在25℃培养2天，并使得到的菌落在含1％琼脂糖和 100μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中培养。然后，从细胞中纯化质粒 并测序，并在随后的实验中使用正确的质粒。这种培养在存在1％阿拉伯糖 和25℃条件下有效抑制合成sRNA的表达，因而是必要的过程。此外，如 果由合成sRNA定向的染色体基因对宿主细胞的生长具有显著影响，则当不 抑制合成sRNA的表达时，细胞的生长将会不充分。合成sRNA的这种影响 会在随后的实验中带来困难，因此应避免。然而，如果合成sRNA对细胞生 长没有影响，则可在不含阿拉伯糖或在37℃条件下进行培养。当进行生产 所需代谢产物的培养时，应充分表达合成sRNA，因此在这种情况下，在不 含阿拉伯糖和37℃条件下进行培养。

利用SEQ ID NO:105和SEQ ID NO:96的引物对上述构建的质粒进行 PCR，用SpeI/SacI裂解PCR产物并将其连接到用XbaI/SacI裂解的pTyr-a 载体，由此额外导入sRNA。

结果从图26可以看出，酪氨酸的产量随靶基因的种类而变化，未发现 比tyrR/csrA基因组合显示出更高生产力的基因。因此可以看出，tyrR/csrA 基因组合是S17-1菌株中酪氨酸产量的最佳靶标。显而易见的是，这种高通 量基因筛选不仅可用于酪氨酸的生产，还可用于各种代谢产物。

实施例8:利用合成sRNA的产生尸胺的重组微生物的生产以及通过逐步调控murE基因表达的尸胺生产优化

8-1：利用合成sRNA的产生尸胺的重组微生物的生产

除实施例5以外，提高赖氨酸生物合成途径的代谢通量，然后选择待沉 默的基因，以进一步增加利用赖氨酸脱羧酶(CadA)使赖氨酸转化为尸胺的重 组微生物中的尸胺的产量。图27示出了自葡萄糖的尸胺生物合成途径，且 这些生物合成途径包括产生其他代谢产物的消耗途径。在该实施例中，为了 增加尸胺产量，选择130种能够抑制这些自然消耗代谢产物的网络的候选基 因，构建能够抑制这些候选基因表达的合成sRNA。130种候选基因包括实 施例7中的84种候选基因并且可由实施例7中使用的引物构建。同时，另 外46种候选基因以及构建这些候选基因所利用的引物如下：

asnA(天冬酰胺合成酶A)

asnB(天冬酰胺合成酶B)

carA(氨甲酰磷酸合成酶)

carB(氨甲酰磷酸合成酶)

ddlB(D-丙氨酸-D-丙氨酸连接酶B)

deoA(胸苷磷酸化酶/尿嘧啶磷酸化酶)

deoD(嘌呤核苷磷酸化酶deoD基因型)

dpiA(参与柠檬酸厌氧分解代谢的双向转录调控因子)

fis(Fis，“倒位刺激因子”，主要作用是组织和保持类核结构的小分 子DNA-结合和弯曲蛋白)

gadE(GadE调控与谷氨酸依赖体系相关的基因的转录)

gadW(GadW调控与谷氨酸依赖体系相关的基因的转录)

gadX(GadX调控与谷氨酸依赖体系相关的基因的转录)

glpF(GlpF甘油MIP通道)

ilvY(IlvY DNA-结合转录双向调控因子)

ivbL(ilvB操纵子前导肽(IvbL))

lhgO(L-2-羟基戊二酸氧化酶)

lpd(硫辛酰胺脱氢酶)

lrp(Lrp是大肠杆菌中至少10％的基因的双向转录调控因子。这些基 因参与氨基酸生物合成和分解代谢、养分运输、菌毛合成以及包括单碳代谢 在内的其它细胞功能)

metB(O-琥珀酰高丝氨酸裂解酶/O-琥珀酰高丝氨酸(巯基)-裂解 酶)

metL(天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶)

mraY(磷酸-N-乙酰胞壁酰-五肽转移酶)

mraZ(功能未知)

murE(UDP-N-乙酰胞壁酰丙氨酸-D-谷氨酸2,6-二氨基庚二酸连接酶)

murF(D-丙氨酸-D-丙氨酸-加成酶)

murG(N-乙酰葡糖氨基转移酶)

nac(Nacregulates，无需共同效应子、在氮限制条件下参与氮代谢的基 因)

nadA(喹啉酸合成酶)

nsrR(NsrR，调控与对抗一氧化氮(NO)的细胞相关的基因的“亚硝酸 盐敏感抑制剂”)

panC(泛酸合成酶)

panD(天冬氨酸1-脱羧酶)

pgl(6-磷酸葡糖酸内酯酶)

pyrB(天冬氨酸氨甲酰转移酶，pyrB亚基)

pyrC(二氢乳清酸酶)

pyrL(天冬氨酸氨甲酰转移酶，PyrI亚基)

rob(Rob是转录双向调控因子。它的N-端区域与MarA和SoxS具有 49％的同一性。这些蛋白激活一组约50个常见基因、marA/soxS/rob调节 子，与抗生素抗性、超氧化物抗性有关，且对有机溶剂和重金属有耐受 性。)

rpe(核酮糖磷酸3-差向异构酶)

talA(转醛醇酶A)

thrA(天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶)

thrB(高丝氨酸激酶)

thrC(苏氨酸合酶)

thrL(thr操纵子前导肽)

tktA(转酮醇酶I)

tktB(转酮醇酶II)

torR(双组分体系，OmpR家族，torCAD操纵子响应调节因子TorR)

用于构建sRNA的引物序列

抗-asnA

[SEQ ID NO:391]5'-TACATTGCCAAAGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:392]5'- AGCGGTTTTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-asnB

[SEQ ID NO:393]5'-TTTGGCGTATTCGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:394]5'- AATTGAACACATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-carA

[SEQ ID NO:395]5‘-GCGCTATTGGTTGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:396]5'- TGACTTAATCAATTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-carB

[SEQ ID NO:397]5'-ACAGATATAAAAGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:398]5'- ACGTTTTGGCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-ddlB

[SEQ ID NO:399]5'-ATCGCGGTCCTGGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:400]5'- TTTATCAGTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-deoA

[SEQ ID NO:401]5'-CAAGAAATTATTGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:402]5'-TGCGAGAAACAATTTCTGTTGG GCCATTGCATTG-3'

抗-deoD

[SEQ ID NO:403]5'-CACATTAATGCAGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:404]5'-TGGGGTAGCCATTTTCTGTTGG GCCATTGCATTG-3'

抗-dpiA

[SEQ ID NO:405]5'- TAATGGAGCTGTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

[SEQ ID NO:406]5'- ACCCTATTGATCGTTGCAACCATTATCACCGCCAGA-3'

抗-fis

[SEQ ID NO:407]5'-CGCGTAAATTCTGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:408]5'- TTGTTCGAACATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-gadE

[SEQ ID NO:409]5'-ATGACGAAAGATGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:410]5'- GAGAAAAATCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-gadW

[SEQ ID NO:411]5'-TGCTCGGTGATCGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:412]5'- GACATGAGTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-gadX

[SEQ ID NO:413]5'-CATGGGAATTGTGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:414]5'- TAGTGATTGCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-glpF

[SEQ ID NO:415]5'-TCAACCTTGAAAGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:416]5'-TGTTTGACTCATTTTCTGTTGG GCCATTGCATTG-3'

抗-ilvY

[SEQ ID NO:417]5'-GATCTGAAAACCGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:418]5'- GCGTAAATCCACTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-ivbL

[SEQ ID NO:419]5'-ATGCTCAACGCAGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:420]5'- GGAAGTAGTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-lhgO

[SEQ ID NO:421]5'-GTGATTATTGGCGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:422]5'- AAAATCATACATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-lpd

[SEQ ID NO:423]5'-ATCAAAACTCAGGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:424]5'- TTCAGTACTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-lrp

[SEQ ID NO:425]5'-AAGAAGCGCCCTGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:426]5'- GCTATCTACCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-metB

[SEQ ID NO:427]5'-ACAGGCCACCATGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:428]5'- TTACGCGTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-metL

[SEQ ID NO:429]5'-GCGCAGGCAGGGGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:430]5'- AATCACACTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-mraY

[SEQ ID NO:431]5'-CTGGCCGAACATGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:432]5'- CCAAACTAACATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-mraZ

[SEQ ID NO:433]5'-GCAACGTTAGTCGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:434]5'- TCCCCGGAACATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-murE

[SEQ ID NO:435]5'-AATTTGCGCGACGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:436]5'- ACGATCTGCCACTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-murF

[SEQ ID NO:437]5'-AACCCTTAGCCAGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:438]5'- ACGCTAATCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-murG

[SEQ ID NO:439]5'-GGAAAGCGATTAGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:440]5'- TTGACCACTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-nac

[SEQ ID NO:441]5'-CGCCTGAAATACGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:442]5'- TCTGAAGTTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-nadA

[SEQ ID NO:443]5'-TTTGATCCAGACGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:444]5'- CATTACGCTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-nsrR

[SEQ ID NO:445]5'- ACTCGTTAACTGCACTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

[SEQ ID NO:446]5'- TTCACTGATTACGGAGCAACCATTATCACCGCCAGA-3'

抗-panC

[SEQ ID NO:447]5'-GAAACCCTGCCGGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:448]5'- GATAATTAACACTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-panD

[SEQ ID NO:449]5'-ATGCTGCAGGGCGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:450]5'- CGTGCGAATCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-pgl

[SEQ ID NO:451]5'-GTTTATATCGCCGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:452]5'-TGTTTGCTTCATTTTCTGTTGG GCCATTGCATTG-3'

抗-pyrB

[SEQ ID NO:453]5'-CTATATCAGAAAGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:454]5'- CGGATTAGCCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-pyrC

[SEQ ID NO:455]5'-TCCCAGGTATTAGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:456]5'- TGGTGCAGTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-pyrI

[SEQ ID NO:457]5'-AATAAATTGCAGGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:458]5'- ATCGTGTGTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-rob

[SEQ ID NO:459]5'-GGCATTATTCGCGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:460]5'-GGCCTGATCCATTTTCTGTTGG GCCATTGCATTG-3'

抗-rpe

[SEQ ID NO:461]5'-TTGATTGCCCCCGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:462]5'-ATACTGTTTCATTTTCTGTTGG GCCATTGCATTG-3'

抗-talA

[SEQ ID NO:463]5'-GACGGCATCAAAGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:464]5'-TAACTCGTTCATTTTCTGTTGG GCCATTGCATTG-3'

抗-talB

[SEQ ID NO:465]5'-TTGACCTCCCTTGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:466]5'-TTTGTCCGTCATTTTCTGTTGG GCCATTGCATTG-3'

抗-thrA

[SEQ ID NO:467]5'-AAGTTCGGCGGTGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:468]5'- CAACACTCGCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-thrC

[SEQ ID NO:469]5'-AATCTGAAAGATGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:470]5'- GTAGAGTTTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-thrL

[SEQ ID NO:471]5'-AGCACCACCATTGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:472]5'- AATGCGTTTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

抗-tktA

[SEQ ID NO:473]5'-AAAGAGCTTGCCGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:474]5'-ACGTGAGGACATTTTCTGTTGG GCCATTGCATTG-3'

抗-tktB

[SEQ ID NO:475]5'-GACCTTGCCAATGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:476]5'-TTTTCGGGACATTTTCTGTTGG GCCATTGCATTG-3'

抗-torR

[SEQ ID NO:477]5'-ATTGTTATTGTTGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:478]5'- GTGATGTGGCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

按照与实施例5中所述的相同方式构建各合成sRNA、将合成sRNA转 化到XQ56(含p15CadA质粒)中并测定尸胺浓度。

结果，当按照与实施例5中所述的相同方式将基本菌株中尸胺的产量作 为100％时，对murE基因的抑制显示出最高尸胺产量(55％,2.15g/L)，而 对ack的抑制显示尸胺产量为1.96g/L(40％)。图27中示出了全部结果，并 在下表5中示出了增加尸胺产量的37个靶基因。

表5：增加尸胺产量的37个靶基因

[表5]

*将文献[Qian,Z.-G.et al.Biotechnol Bioeng108:93-103,2011]中报道的 经过基因工程改造的大肠杆菌菌株中尸胺产量(1.4g/L)作为100％。

**必需基因:细胞存活必不可少的基因。参见http://tubic.tju.edu.cn/deg/上的数据信息。

8-2：通过逐步调控murE基因表达对尸胺生产的优化

如同实施例6中提到的抗-csrA的情形，在该实施例中，使抗-murE的 结合能多样化，以便逐步调控murE基因的表达，检测对murE基因表达的 调控是否对尸胺的终产量有影响。

按照上述实施例中所述的合成sRNA制备方法，利用以下引物对通过定 点诱变构建各抗-murE(合成sRNA)，将构建的抗-murE pWAS质粒(图 18)转化到含p15CadA质粒的XQ56菌株中。

[SEQ ID NO:479]5'-GATCGTGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:480]5'-TGCCACTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

[SEQ ID NO:481]5'-GTCGTAAGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:482]5'-CTGCCACTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

[SEQ ID NO:483]5'-TCGTAATTGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:484]5'-TCTGCCACTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

[SEQ ID NO:485]5'-TAATTTGCGCGGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:486]5'- CGATCTGCCACTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

[SEQ ID NO:487]5'-ATTTGCGCGACCTGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:488]5'- TACGATCTGCCACTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

[SEQ ID NO:489]5'-TTTGCGCGACCTTCGCAACCATTATCACCGCC- 3'

[SEQ ID NO:490]5'- TTACGATCTGCCACTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

[SEQ ID NO:491]5'- TTGCGCGACCTTCTTGCAACCATTATCACCGCC-3'

[SEQ ID NO:492]5'- ATTACGATCTGCCACTTTCTGTTGGGCCATTGCATTG-3'

结果从图28可以看出，结合能在-20kcal/mol至-50kcal/mol的范围 内。如同抗-csrA的情形，构建的基本抗-murE(蓝色方块，图28)显示出 最高尸胺产量，在结合能量值高于或低于基本抗-murE处，尸胺产量下降。

在该实施例中，为了检测murE蛋白的量是否实际上随着具有不同结合 能的抗-murE而变化，培养用p15CadA/pWAS-抗-murE质粒转化的XQ56菌 株，然后进行2D-PAGE分析。在该实施例中，在仅除去抗-murE的情况 下，使用了具有结合能量值为-19.2kcal/mol、-36.5kcal/mol、-40.9kcal/mol 和-48.7kcal/mol的抗-murE。具体地，从各摇瓶培养的样品中收集细胞并将 其悬浮于再悬浮缓冲液(10mM Tris-HCl(pH8.0)、1.5mM MgCl₂、10mM  KCl、0.5mM二硫苏糖醇和0.1％w/v十二烷基硫酸钠(SDS))中。将悬浮液 与裂解缓冲液(7M尿素、2M硫脲、40mM Tris、65mM二硫苏糖醇和 4％w/v3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS))混合，然后 以13000×g离心10分钟，收集上清液。通过Bradford法(Bradford MM, Anal Biochem72,248254,1976)测定上清液中的蛋白质浓度，将150μg蛋白 质与340μl再水合缓冲液(7M尿素、2M硫脲、20mM二硫苏糖醇、2％ w/vCHAPS、0.8％w/v固定pH梯度(IPG)缓冲液(安玛西亚生物技术有限公 司、乌普萨拉、瑞典)和1％v/v混合物蛋白酶抑制剂)混合，然后上样至 固定化干胶条(IPG)(18cm，pH3-10NL；安玛西亚生物技术有限公司) 上。使载有样品的IPG干胶条在等电聚焦仪(Protean IEF Cell)中再水合12小 时，在20℃以250V聚焦3小时，然后保持在6000V直到达65kV h。使胶 条于溶液(含6M尿素、0.375M Tris-HCl(pH8.8)、20％w/v甘油、2％w/v SDS、130mM二硫苏糖醇和0.002％w/v溴酚蓝)中在室温下平衡15分 钟，并于溶液(除了以135mM碘乙酰胺代替DTT之外，具有与上述溶液 相同的成分)中再次在室温下平衡15分钟。然后，将胶条转移到12％w/v  SDS-聚丙烯酰胺凝胶上。用PlusOne银染试剂盒(安玛西亚生物技术有限 公司)检测蛋白质点并用Coomassie亮蓝染色剂定量分析。

为了量化MurE蛋白，相对于持家蛋白EF-Tu的表达水平测定MurE蛋 白的量，并比较测定值。

结果从图29可以看出，随着使用的抗-murE(合成sRNA)的结合能增 加，MurE蛋白的量减少。因此，可以看出通过适当地设计合成sRNA的结 合能，可使靶蛋白的量有效地多样化。

在与文献(Qian et al,Biotechnol.Bioeng.108,93-103(2011))报道的相同条 件下，使具有最后选定的抗-murE的XQ56发酵。结果如图30所示，可获 得总共为12.6g/L的尸胺，且该产量比文献中之前报道的产量(9.6g/L)高约 31％。在发酵试验中，在25℃含10g/L葡萄糖、10g/L阿拉伯糖和3 g/L(NH₄)SO₄的R/2培养基中培养单菌落，然后在具有2L与上述相同的培 养基成分(不包括甘露糖)的6.6L罐中进行分批发酵。利用10M KOH使 pH保持在6.8的恒定pH，并注入含577g/L葡萄糖、7g/L MgSO₄7H₂O和 115g/L(NH4)₂SO₄的溶液。R/2培养基含2g/L(NH₄)₂HPO₄、6.75g/L  KH₂PO₄、0.85g/L柠檬酸、0.7g/L MgSO₄7H₂O和5ml/L微量金属溶液(表 2)。

工业实用性

如上所述，本发明提供一种不同于基因缺失方法、无需修饰靶基因的序 列而有效抑制靶基因表达的合成sRNA，以及一种制备合成sRNA的方法。 根据本发明的合成sRNA的优点在于，可通过调控合成sRNA与靶基因的 mRNA的结合能力来控制靶基因的抑制程度。利用调控靶基因表达的合成 sRNA，能够无需传统的基因缺失方法而有效构建重组微生物并能够降低靶 基因的表达，因而合成sRNA对重组微生物的生产很有用。此外，合成 sRNA可快速应用至各种菌株，因而非常适合测定菌株的代谢能力以及选择 最合适的菌株。此外，通过利用合成sRNA操控代谢通量得到的并高效生产 酪氨酸或尸胺的重组微生物在医药和工业领域非常有用。换句话说，利用根 据本发明的sRNA可使选择表达将被抑制以用于高效生产代谢产物的靶基因 变得容易。因此，合成sRNA可用于构建有效生产各种代谢产物的重组菌株 以及用于建立生产各种代谢产物的有效方法，因而非常有用。

尽管参照具体的特征已经详细地描述了本发明，对于本领域的技术人员 将显而易见的是这种描述仅是为了优选的实施方式而不是限制本发明的范 围。因此，本发明的实质的范围将由所附权利要求和其等效物限定。

序列目录

已附电子文件。