sRNA_EsR240调控迟缓爱德华菌胞内生存及其毒力

摘要

目的:探讨非编码小RNA(sRNA_EsR240)调控迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda,Et)胞内生存和毒力的作用.方法:根据转录组测序,结合生物信息学方法分析ET13菌sRNA.采用RT-PCR检测在不同应激(低酸、营养缺乏、氧化和高盐)条件下sRNA的转录水平,筛选高表达的sRNA;Northern blotting和RACE试验检测EsR240的长度及转录起始和终止位点.采用BLAST软件对EsR240的保守性进行分析;IntaRNA软件预测EsR240靶基因;qRT-PCR检测这些靶基因的表达水平.采用自杀质粒同源重组的方法构建ET13菌的EsR240缺失株和互补株.比较野生株ET13、EsR240缺失株和互补株在胞外不同应激条件下的存活率,及其在巨噬细胞胞内存活能力和对小鼠毒力的差异.结果:根据ET13菌RNA测序的结果,与蛋白库注释基因相比对;比对不上的候选sRNA与sRNA库比对;用软件发现13个具有启动子和ρ-非依赖型终止子新的sRNA,RT-PCR显示其中8个sRNA在各种应激条件下的转录水平不一,EsR128、EsR139和EsR240转录水平均较高.Northern blotting验证了EsR240在Et生长期和稳定期均转录,大小是596 bp.RACE试验确定了EsR240的转录起始和终止位点.BLAST软件分析显示,EsR240在Et中普遍存在,符合sRNA的特征.IntaRNA软件预测EsR240靶基因及qRT-PCR结果显示,EsR240调控大部分预测靶基因的表达,这些靶基因注释可能为三磷酸腺苷结合盒(ATP binding cassette,ABC)-F转运体、FtsH蛋白酶的调控子YccA、Na+/H+反向转运体和糖苷水解酶等;在不同条件下,EsR240调控靶基因数目不同.EsR240的缺失明显影响Et在胞外不同应激条件下存活率和胞内生存能力,而且影响Et对小鼠的毒力.结论:EsR240通过调控靶基因影响Et的胞内生存,是一个正调控Et对小鼠毒力的sRNA.