循环miR-505在高血压早期诊断及靶器官早期损伤预警作用中的应用

摘要

本发明涉及循环miR-505的表达水平在高血压早期诊断及靶器官早期损伤预警作用中的应用。本发明优点在于：本发明研究结果表明：循环miR-505的表达随着血压的升高而升高，为高血压的早期诊断提供全新的诊断依据；miR-505抑制内皮细胞的增殖、迁移及内皮细胞的管状形成；检测循环miR-505的表达水平不仅有助于高血压的早期诊断、早期发现，更重要是对高血压靶器官早期损害的预警作用，为高血压的早期诊断及早期预测靶器官的损害提供全新的手段，可有的指导临床用药，延缓靶器官的损害，改善患者的生活质量。

说明书

技术领域

本发明涉及微小核苷酸的新用途，具体地说，是循环miR-505的表达水平在高血压早期诊断及靶器官早期损伤预警作用中的应用。

背景技术

高血压（hypertension）是指在静息状态下，收缩压和/或舒张压增高（≥140mmHg/90mmHg），常伴有脂质代谢紊乱及心、脑、肾和视网膜等靶器官功能或器质性变化。收缩压在120~139mmHg之间和/或舒张压在80~89mmHg之间为高血压前期或正常高值。

高血压是最常见的心血管病，是全球范围内的重大公共卫生问题。流行病学调查显示，我国18岁及以上居民高血压患病率为18.8%，估计全国患病人数超过1.6亿。并且血压的升高是多种疾病的导火索，增加了冠心病、心力衰竭及肾脏疾患等发病率。然而，部分高血压患者并无明显的临床症状，高血压被称为人类健康的“隐形杀手”。因此，对高血压病的早期发现、早期诊断，可有效防治高血压的发生发展，更重要的是对高血压靶器官损害的早期预警，可有效的指导临床用药，延缓靶器官的损害，改善患者的生活质量。

微小核苷酸（microRNA，miRs）是具有高度保守性的非编码单链RNA，长度约为18~25个核苷酸。据预测，miRs通过与靶基因的结合调控着人类基因组中30~50%的基因，参与生命过程中一系列重要的进程，包括早期胚胎发育、细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、组织发育、调亡等生理、病理过程，并且通过调控一组基因参与调节机体多种疾病的发生发展，如肿瘤、心血管疾病、衰老等。研究表明，在疾病发生的早期，miRs即产生了可逆性的变化，通过对miRs的检测，可早期预测疾病的发生发展，从而指导临床诊疗。

血管内皮细胞是血管表面的一层单层细胞，直接接触血液成分和组织，起着调节血管的舒缩、防止血小板粘附和血栓形成、调节血管平滑肌细胞的生长和增殖、防止炎症细胞的浸润及有害物质的透入等作用。内皮功能紊乱不仅是高血压发病最早期的病理性损害，还是预测诸如猝死、急性心肌梗死、不稳定型心绞痛、卒中等心脑血管事件发生的“晴雨表”。因此，早期预测内皮细胞的功能，可有效的指导临床用药，防治内皮功能紊乱，有效的防治高血压的发生发展及靶器官的损害。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种miR-505在制备早期诊断高血压试剂中的应用。

本发明的第二个目的是，提供一种miR-505在制备早期诊断高血压的医疗器械中的应用。

本发明的第三个目的是，提供一种miR-505在制备预测靶器官早期损伤试剂中的应用。

本发明的第四个目的是，提供一种miR-505在制备预测靶器官早期损伤的医疗器械中的应用。

本发明的第五个目的是，提供一种miR-505作为药物靶点在筛选降血压和靶器官保护的药物中的应用。

本发明的第六个目的是，提供一种miR-505拮抗剂或抑制剂在制备降血压和靶器官保护的药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：miR-505在制备早期诊断高血压试剂中的应用，所述的早期诊断高血压试剂通过检测循环中miR-505的表达水平对高血压进行早期诊断。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：miR-505在制备早期诊断高血压的医疗器械中的应用，所述的早期诊断高血压的医疗器械通过检测循环中miR-505的表达水平对高血压进行早期诊断。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：miR-505在制备预测靶器官早期损伤试剂中的应用，所述的预测靶器官早期损伤试剂通过检测循环中miR-505的表达水平对靶器官的损害进行早期预测。

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：miR-505在制备预测靶器官早期损伤的医疗器械中的应用，所述的预测靶器官早期损伤的医疗器械通过检测循环中miR-505的表达水平对靶器官的损害进行早期预测。

所述的靶器官为心、脑、肾、外周血管。

为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：miR-505作为药物靶点在筛选降血压和靶器官保护的药物中的应用。

为实现上述第六个目的，本发明采取的技术方案是：miR-505拮抗剂或抑制剂在制备降血压和靶器官保护的药物中的应用。

本发明优点在于：

1、本发明收集血压正常者、高血压前期患者、高血压患者血浆，对循环中miR-505的表达水平进行研究，研究结果表明：循环miR-505的表达随着血压的升高而升高，为高血压的早期诊断提供全新的诊断依据；

2、本发明采用不同内皮细胞研究miR-505对内皮细胞功能的影响作用，研究结果表明：miR-505抑制内皮细胞的增殖、迁移及内皮细胞的管状形成；

3、检测循环miR-505的表达水平不仅有助于高血压的早期诊断、早期发现，更重要是对高血压靶器官早期损害的预警作用，为高血压的早期诊断及早期预测靶器官的损害提供全新的手段，可有的指导临床用药，延缓靶器官的损害，改善患者的生活质量。

附图说明

图1. 循环miR-505的表达水平（与Healthy Control相比，*p<0.05）。SYBG染料法RT-PCR检测血压正常者、高血压前期患者、高血压患者循环miR-505的表达情况：图1结果显示，高血压前期患者、高血压患者循环miR-505的表达均显著上调（p<0.05）。

图2. 循环miR-505的表达水平（与Healthy Control相比，*p<0.05）。探针法RT-PCR检测血压正常者、高血压患者循环miR-505表达情况：图2结果显示，高血压患者循环miR-505的表达显著上调（p<0.05）。

图3. miR-505对不同内皮细胞增殖作用的影响（与正常组相比，*p <0.05）。miR-505抑制内皮细胞的增殖：采用含有10%胎牛血清的DMEM培养基分别培养视网膜内皮细胞 （HRECs）、人脑微血管内皮细胞（HBMECs）、人脐静脉内皮细胞（HUVECs），以3000个/孔接种于96孔板中，分别转染20nM miR-505 mimic和inhibitor（RNAiMax 转染试剂）48h后，进行MTT实验。图3结果显示，miR-505 mimic显著抑制视网膜内皮细胞的增殖（p<0.05）。

图4. miR-505对不同内皮细胞迁移作用的影响（放大倍数：100×，与Control组相比，*p<0.05）。miR-505抑制内皮细胞的迁移：用含有10%胎牛血清的DMEM培养基分别HRECs、HBMECs、HUVECs，以3000个/孔接种于96孔板中，分别转染20nM miR-505 mimic和inhibitor（RNAiMax 转染试剂) 48h后，分别进行细胞迁移实验。图4A、B结果显示，miR-505 mimic 显著抑制HRECs、HBMECs、HUVECs的迁移（p<0.05）。

图5. miR-505对不同内皮细胞tube formation的影响作用（放大倍数：40×，与Control组相比，*p<0.05）。miR-505抑制内皮细胞管状形成：用含有10%胎牛血清的DMEM培养基分别HRECs、HUVECs、HBMECs，以3000个/孔接种于96孔板中，分别转染20nM miR-505 mimic (RNAiMax 转染试剂）48h后，分别进行小管形成实验。图5A、B结果显示，miR-505 mimic显著抑制HRECs、HUVECs、HBMECs的管状形成（p<0.05）。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

在本实施方案中，我们分别采用SYBG染料法、探针法RT-PCR的研究手段，探讨并明确循环miR-505的表达与血压呈正相关性。并且，在本实施方案中，我们采用视网膜内皮细胞 （HRECs）、人脑微血管内皮细胞（HBMECs）、人脐静脉内皮细胞（HUVECs）研究并明确miR-505的过表达显著抑制内皮细胞的增殖、迁移及管状形成，这一研究首次揭示循环miR-505的表达水平不仅反应血压水平，并且可以预知内皮细胞的功能，为高血压早期靶器官损害起到预警作用。

一、方法

1. 临床研究样本收集

用于本发明的临床样本全部来自本院，并且所有研究对象都认真阅读并签署知情同意书，符合伦理学标准。研究对象均为男性，年龄在30-60 岁之间。在未使用降压药物的情况下，非同日三次测量，收缩压≤120mmHg 和舒张压≤90mmHg 为正常血压；收缩压≥ 140mmHg 和/ 或舒张压≥90mmHg 为高血压；收缩压120~139mmHg 和/ 或舒张压在80~89mmHg 为高血压前期。所有研究对象既往无其他心血管疾病，严重的肝肾功能损害，糖尿病，肝炎、结核等传染性疾病。所有研究对象均于早8：00-9:00，空腹，使用K2-EDTA 抗凝管静脉采集2ml 血液。3000 转/ 分，离心10 分钟，取上层血浆用于本研究。

2. 临床样本循环microRNA的提取

根据miRNeasy Mini Kit (QIAGEN) 并且根据生产厂商提供的标准操作流程进行血浆样品microRNA抽提，备用。

3. RT-PCR检测临床样本循环miR-505的表达

根据miScript Reverse Transcription Kit (cat218061, QIAGEN)及其操作规范进行反转录20ul反应体系，分别采用SYBR Green PCR Master Mix (cat218073, QIAGEN) 、探针（Life technology），根据厂家规范流程操作，使用 Roche LightCycler 480 II进行RT-PCR检测：95℃,15min；94℃，15s,40个循环；55℃，30s ；70℃ , 30 s。

4. miR-505显著抑制内皮细胞的增殖：含有10%胎牛血清的DMEM培养基分别培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）视网膜内皮细胞 （HRECs）、人脑微血管内皮细胞（HBMECs），以3000个/孔接种于96孔板中，分别转染20nM miR-505 mimic和inhibitor（RNAiMax 转染试剂），于37℃，5%CO₂培养箱培养48h后，行MTT实验，490nm波长下检测其吸光值。如图3结果显示，与转染Negative control相比，转染miR-505 mimic后，对HUVECs、HBMECs的增殖未见明显的抑制作用，但显著抑制HRECs的增殖（P<0.05），转染miR-505 Inhibitor后，细胞增殖与转染Negative control相比，细胞增殖均未见明显差异。

5. miR-505显著抑制内皮细胞的迁移：含有10%胎牛血清的DMEM培养基分别培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）视网膜内皮细胞 （HRECs）、人脑微血管内皮细胞（HBMECs），以3000个/孔接种于96孔板中，分别转染20nM miR-505 mimic和inhibitor（RNAiMax 转染试剂）48h后，采用含1%FBS的DMEM制备含有2×10⁵细胞/mL的细胞悬液，加入Transwell小室中，下室为20%胎牛血清的DMEM培养基，5% CO₂培养箱中培养24h后，4%的多聚甲醇固定，并进行0.1%结晶紫染色，观察细胞迁移情况。如图4A、B结果显示，转染miR-505 inhibitor后，对内皮细胞迁移未见明显差异，但在转染miR-505 mimic后，显著抑制HUVECs、HRECs、HBMECs的迁移（p<0.05）。

6. miR-505显著抑制内皮细胞的管状形成：采用10%胎牛血清的DMEM培养基分别HRECs、HUVECs、HBMECs，以3000个/孔接种于96孔板中，分别转染20nM miR-505 mimic(RNAiMax 转染试剂）48h后，制备Matrigel聚合凝胶，转染2×10⁴/ml内皮细胞，37℃ 5% CO₂培养箱培养24h后，使用Image-Pro Plus 6.0 软件分析内皮细胞的管状形成。如图5A、B所示，转染miR-505 mimic 后显著抑制内皮细胞的管状形成（p<0.05）。

4. 统计分析

计量资料以均数±标准差表示，符合正态分布和方差齐性采用单因素方差分析的单向分类的方差分析（one-way-classification ANOVA），两两比较使用t检验，如不符合正态性和方差齐性则用M、min、max表示，组间比较用Kruslal-Wallis H 检验。

二、结果

1. SYBG染料法RT-PCR检测样本临床基本信息

如表1所示，血压正常者、高血压前期患者、高血压患者平均年龄、BMI、谷丙转氨酶、肌酐、尿素、尿酸、空腹血糖、甘油三脂、胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白均未见明显差异，高血压前期患者、高血压患者收缩压、舒张压均显著高于血压正常者（p<0.05）。

表1. SYBG染料法RT-PCR检测样本临床基本信息

注：与正常组相比，* p <0.05。

2. 高血压前期患者、高血压患者循环miR-505表达显著上调（p<0.05）

如图1所示，高血压前期患者、高血压循环miR-505的表达均显著上调，具有统计学意义（p<0.05）。

3. 探针法RT-PCR检测样本临床基本信息

如表2所示，血压正常者、高血压前期患者平均年龄、BMI、谷丙转氨酶、尿素、肌酐、尿酸、空腹血糖、甘油三酯、胆固醇均无明显差异，高血压前期患者收缩压、舒张压均显著高于血压正常者。

表2. 探针法RT-PCR检测样本临床基本信息

注：与正常人相比，* p <0.05。

4. 高血压患者循环miR-505表达显著上调（p<0.05）

如图2所示，与血压正常者相比，高血压患者循环miR-505的表达显著上调，具有统计学意义（p <0.05）。

5. miR-505抑制视网膜内皮细胞的增殖（p<0.05）

含有10%胎牛血清的DMEM培养基分别培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs，图3A）视网膜内皮细胞 （HRECs，图3B）、人脑微血管内皮细胞（HBMECs，图3C），以3000个/孔接种于96孔板中，分别转染20nM miR-505 mimic和inhibitor（RNAiMax 转染试剂）48h后，MTT实验结果显示，与转染Negative control相比，转染miR-505 mimic后，对HUVECs、HBMECs的增殖未见明显的抑制作用，但显著抑制HRECs的增殖（P<0.05），转染miR-505 Inhibitor后，细胞增殖与转染Negative control相比，细胞增殖均未见明显差异。

6. miR-505显著抑制内皮细胞的迁移（p<0.05）

含有10%胎牛血清的DMEM培养基分别培养HUVECs、HRECs、HBMECs，以3000个/孔接种于96孔板中，分别转染20nM miR-505 mimic和inhibitor48h后，细胞迁移实验结果显示（图4A、B），转染miR-505 inhibitor后，对内皮细胞迁移未见明显差异，但在转染miR-505 mimic后，显著抑制HUVECs、HRECs、HBMECs的迁移（p <0.05）。

7. miR-505显著抑制内皮细胞管状形成

分别培养内皮细胞（HRECs、HBMECs及HUVECs）进行小管形成实验。实验结果显示（图5A、B），转染miR-505mimic 后，均显著抑制HRECs、HBMECs及HUVECs的管状形成。

本发明收集血压正常者、高血压前期、高血压血浆，研究探索循环miR-505的表达情况。研究结果揭示，循环miR-505的表达上调与血压的水平呈正相关性。且本发明在细胞学实验中揭示，miR-505的过表达显著抑制内皮细胞的增殖、迁移以及内皮细胞的管状形成。这一研究首次揭示循环miR-505的表达水平不仅反应血压水平，并且可以预知内皮细胞的功能，为临床早期防治高血压提供全新的诊疗思路，为高血压早期靶器官损伤提供全新的预警手段。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。