梅花鹿鹿脾提取物在抗氧化药物中的应用

摘要

本发明涉及梅花鹿鹿脾提取物在抗氧化药物中的应用，通过动物实验表明，本发明工艺制备的梅花鹿鹿脾提取物可降低乙醇损伤模型小鼠血清中过氧化物、蛋白质羰基，升高还原性谷胱甘肽含量，增强血清中SOD活力，具有抗氧化的作用，可用于制备抗氧化作用的药物和保健食品。

说明书

技术领域：

本发明涉及梅花鹿鹿脾提取物在抗氧化药物中的应用，利用梅花鹿鹿脾提取物制备药物或保健品，属于生物制药技术领域。

技术背景：

氧化是肌肤衰老的最大威胁，饮食不健康，日晒、压力、环境污染等都能让肌肤自由基泛滥，从而产生面色黯淡、缺水等氧化现象。研究证明，人体的抗氧化系统是一个可与免疫系统相比拟的、具有完善和复杂功能的系统，机体抗氧化的能力越强，就越健康，生命也越长。

梅花鹿全身各部分都具有药膳食疗的作用，追溯到远古时期，《神农本草经》、《本草纲目》、《本经逢源》等古籍就收录了鹿茸、鹿角、鹿皮、鹿胎等鹿产品，并对其制法、功能、主治做了详细的记载说明。鹿产品不仅是中医药的重要组成，也是人们高度认可的营养食品。伴随着鹿产品的需求量不断增大，吉林省家养梅花鹿资源迅速发展，同时产生了大量的副产品，如鹿心、鹿肝、鹿脾等，这些副产品研究人数不多。

梅花鹿鹿脾含有丰富的脂类、维生素、蛋白质及人体所必需氨基酸。鹿脾提取物其中含有有很多人体可吸收的营养物质，如多肽、核苷酸、维生素、矿物质等生物活性物质。由于对鹿脾的开发与研究甚少，目前没有鹿脾提取物具有抗氧化的相关报道。

发明内容：

本发明公开了梅花鹿鹿脾提取物在抗氧化药物中的应用，用于制备抗氧化药物或保健食品。

本发明所述的鹿脾提取物是通过以下方法制备的：

1）称取梅花鹿脾表面结缔组织，切成0.5cm 厚的薄片；

2）加入3~7重量的生理盐水，胶体磨研磨2~5min；

3）将鹿脾混悬液升温至40~50℃，调PH值至5.0~6.0，加入0.2~2%重量的木瓜蛋白酶在水浴锅中保温1~2h；

4）继续加入0.5%~1%重量的5'-磷酸二酯酶保温2~3h；

5）将混悬液用4000g离心10min取上清，用10KD超滤膜进行超滤得超滤液，喷雾干燥即得具有抗氧化作用的鹿脾提取物干粉。

如上所述的方法，梅花鹿鹿脾提取过程中选用40~50℃的水浴温度。

如上所述的方法，其中，PH值以2mol/L的盐酸、1mol/L NaOH溶液调节。

如上所述的方法，包括两个酶解阶段。第一阶段是加入0.2~2%重量的木瓜蛋白酶进行酶解，主要作用是将大分子蛋白质酶解为小分子多肽，第二阶段是加入0.5%~1%重量的5'-磷酸二酯酶进行酶解，主要作用是将核酸分解为小分子核酸、核苷酸等。

如上述的方法，鹿脾提取物干粉中多肽含量为30~50%，核苷酸含量为1.2~2.1%，维生素含量为0.05%~0.3%。

鹿脾提取物可用于制备抗氧化作用的药物和保健食品，在剂型方面可采用各种剂型，如口服液、片剂、颗粒剂、散剂、或丸剂、胶囊等或缓释剂型。

本发明的积极效果在于：

通过动物实验表明，本发明工艺制备的梅花鹿鹿脾提取物可降低乙醇损伤模型小鼠血清中过氧化物、蛋白质羰基，升高还原性谷胱甘肽含量，增强血清中SOD活力，具有抗氧化的作用，可用于制备抗氧化作用的药物和保健食品。

具体实施方式

通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1：

. 称取梅花鹿脾250g，去除表面结缔组织，切成0.5cm 厚的薄片；

. 加入800ml生理盐水，胶体磨研磨5min；

. 将鹿脾混悬液升温至40℃，调PH值至5.0，加入2.0g木瓜蛋白酶在水浴锅中保温1.5h；

. 继续加入1.5g 5'-磷酸二酯酶保温2~3h；

. 将混悬液用4000g离心10min取上清，用10KD超滤膜进行超滤得超滤液，喷雾干燥即得具有抗氧化作用的鹿脾提取物干粉。鹿脾提取物干粉中多肽含量为30%，核苷酸含量为1.2%，维生素含量为0.05%。

实施例2：

. 称取梅花鹿脾250g，去除表面结缔组织，切成0.5cm 厚的薄片；

. 加入860ml生理盐水，胶体磨研磨5min；

. 将鹿脾混悬液升温至45℃，调PH值至5.5，加入2.2g木瓜蛋白酶在水浴锅中保温1h；

. 继续加入1.5g 5'-磷酸二酯酶保温3h；

. 将混悬液用4000g离心10min取上清，用10KD超滤膜进行超滤得超滤液，喷雾干燥即得具有抗氧化作用的鹿脾提取物干粉。鹿脾提取物干粉中多肽含量为35%，核苷酸含量为1.5%，维生素含量为0.1%。

实施例3：

. 称取梅花鹿脾250g，去除表面结缔组织，切成0.5cm 厚的薄片；

. 加入1300ml生理盐水，胶体磨研磨2.5min；

. 将鹿脾混悬液升温至50℃，调PH值至5.5，加入4.5g木瓜蛋白酶在水浴锅中保温1.5h；

. 继续加入2.5g 5'-磷酸二酯酶保温2h；

. 将混悬液用4000g离心10min取上清，用10KD超滤膜进行超滤得超滤液，喷雾干燥即得具有抗氧化作用的鹿脾提取物干粉。鹿脾提取物干粉中多肽含量为40%，核苷酸含量为2.0%，维生素含量为0.15%。

实施例4：

. 称取梅花鹿脾250g，去除表面结缔组织，切成0.5cm 厚的薄片；

. 加入900ml生理盐水，胶体磨研磨2.5min；

. 将鹿脾混悬液升温至50℃，调PH值至6.0，加入3.0g木瓜蛋白酶在水浴锅中保温1.5h；

. 继续加入2.0g 5'-磷酸二酯酶保温2h；

. 将混悬液用4000g离心10min取上清，用10KD超滤膜进行超滤得超滤液，喷雾干燥即得具有抗氧化作用的鹿脾提取物干粉。鹿脾提取物干粉中多肽含量为50%，核苷酸含量为2.1%，维生素含量为0.3%。

实施例5：

. 称取梅花鹿脾250g，去除表面结缔组织，切成0.5cm 厚的薄片；

. 加入1000ml生理盐水，胶体磨研磨2.5min；

. 将鹿脾混悬液升温至45℃，调PH值至5.6，加入2.8g木瓜蛋白酶在水浴锅中保温1h；

. 继续加入2.5g 5'-磷酸二酯酶保温3h；

. 将混悬液用4000g离心10min取上清，用10KD超滤膜进行超滤得超滤液，喷雾干燥即得具有抗氧化作用的鹿脾提取物干粉。鹿脾提取物干粉中多肽含量为50%，核苷酸含量为2.0%，维生素含量为0.25%。

实施例6

取鹿脾提取物干粉1kg，加入等重量的1kg糊精作为赋形剂，混合均匀，得混合粉末；加入95%乙醇制得软材，16～20目筛制粒，湿颗粒70 ~ 80℃干燥30分钟，16～20目筛整粒，压片即得鹿脾提取物片剂。

实施例7

取鹿脾提取物干粉1kg，加入1.5kg的淀粉作为赋形剂，混合均匀，加润70%乙醇制软材，制粒，70~80℃干燥30分钟，整粒，灌装胶囊。

实施例8

取鹿脾提取物干粉1kg，加入1kg糖粉和0.5kg淀粉，混合均匀，加入65%乙醇制软材，16目筛制粒，湿颗粒70~80℃干燥30分钟，16～30目筛选粒，混合均匀，灌装胶囊。

以下试验表明本发明的鹿脾提取物具有抗氧化的作用：

1.1实验方法

1.1.1乙醇氧化损伤模型

选25－30g健康成年小鼠，随机分为4个组，1个模型对照组和实施例1、实施例2、实施例3鹿脾提取物剂量组，均按人体代谢的10倍(0.22 g/kg BW)给药，模型对照组给予同体积生理盐水，每天1次，连续灌胃30天，末次灌胃后，模型组对照组和3个实施例组禁食16小时（过夜），然后1次性灌胃给予50%乙醇12ml/kg，6小时后取材；另取一组空白对照组不作处理，不禁食取材。测血清中氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。

脂质过氧化检测

将10nmol/mL四乙氧基丙烷，用双蒸水稀释成0、0.5、1.0、2、5、10nmol/mL分别取0.1mL加入酸水解液 2mL，TBA工作液0.5mL，混匀，避光、沸水浴60min，流水冷却至室温，3mL正丁醇振荡抽提1min，3000r/min离心5min，取上清液（正丁醇层）测荧光强度（入射狭缝1.5nm，出射狭缝5nm， 激发波长536nm，发射波长550nm）。取血清0.1ml用相同方法进行测定，以四乙氧基丙烷浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，计算血清中过氧化脂质含量。

蛋白质羰基测定

取血清0.1ml，加入0.4ml 10 mmol/L  2，4-二硝基苯肼，对照组加入0.4ml 2 mol/L HCL，涡旋混匀1min，37℃准确避光反应30min；再加入0.5ml 200 g/L 三氯乙酸，涡旋混匀1分钟，在4℃下，12000r/min离心10min，弃上清，留沉淀；加入1.0ml 无水乙醇乙酸乙酯混合应用液，涡旋混匀1分钟，在4℃以下，以12000r/min离心10min，弃上清，留沉淀，该步骤重复4次；最后加入1.25ml 6mol/L盐酸胍，混匀后，37℃准确水浴15min，涡旋混匀，将全部沉淀溶解，以12000r/min离心15min，取上清液在370nm处比色，6 mol/L 盐酸胍试剂调零，测定OD值，计算血清中蛋白质羰基的含量。

还原性谷胱甘肽含量测定

     取1mmol/L GSH标准溶液0、10、20、50、100、200μL,分别加入生理盐水至0.5mL，即得到0、20、40、100、200、400μmol/L的GSH标准液系列，各管加入DTNB4.5mL，混匀，室温放置10 分钟后，空白管调零，420nm处测定吸光度。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，做标准曲线。测定0.1ml反应后吸光度，通过标准曲线计算血清中还原性谷胱甘肽的含量。

抗氧化酶活力测定

红细胞抽提液制备：10μl全血冲入0.5mL生理盐水，2000r/min离心3min，弃上清，加冰冷的双蒸水0.2mL混匀，加入95％乙醇0.1mL，振荡30s，加入三氯甲烷0.1mL，置快速混合器抽提1min，4000r/min离心3min，分层，上层为SOD抽提液，中层为血红蛋白沉淀物，下层为三氯甲烷，记录上清液体积待测。用SOD试剂盒测定上清液中超氧化物歧化酶SOD的活力。

实验结果

由表1可看出，乙醇损伤模型小鼠血清中过氧化物变高，乙醇损伤模型小鼠通过实施例1、2、3鹿脾提取物给药后，过氧化物含量明显降低，恢复并且接近正常生理盐水空白组。表明本发明鹿脾鹿脾提取物可降低乙醇损伤模型小鼠血清中的过氧化物。

表1 乙醇损伤模型小鼠血清中过氧化物含量

组别过氧化物（nmol/ml）生理盐水组15.41±2.03模型20.86±2.55实施例115.85±1.96^**实施例216.08±2.67^**实施例315.92±2.12^**

与模型组比较：*p<0.05 **p<0.01 

由表2可看出，乙醇损伤模型小鼠血清中的蛋白质羰基相比于空白组高，乙醇损伤模型小鼠通过实施例1、2、3鹿脾提取给药后，蛋白质羰基含量降低，恢复并接近正常生理盐水空白组。表明本发明鹿脾提取物可降低乙醇损伤模型小鼠血清中的蛋白质羰基含量。

表2 乙醇损伤模型小鼠血清中蛋白质羰基含量

组别蛋白质羰基（nmol/mL）生理盐水组4.12±0.34模型6.53±0.59实施例14.28±0.21^**实施例24.37±0.25^**实施例34.52±0.33^**

与模型组比较：*p<0.05 **p<0.01 

由表3可看出，乙醇损伤模型小鼠血清中的还原性谷胱甘肽的含量降低，乙醇损伤模型小鼠通过实施例1、2、3鹿脾提取物给药后，还原性谷胱甘肽含量明显升高，甚至高于正常生理盐水空白组。表明本发明鹿脾提取物可增加乙醇损伤模型中小鼠血清中的还原性谷胱甘肽含量。

表3 乙醇损伤模型小鼠血清中还原性谷胱甘肽含量

组别还原性谷胱甘肽（umol/ml）生理盐水组280.7±3.2模型212.1±2.7实施例1296.3±3.5^**实施例2289.5±4.9^**实施例3293.2±2.9^**

与模型组比较：*p<0.05 **p<0.01 

由表4可看出，乙醇损伤模型小鼠血清中的SOD活力低，乙醇损伤模型小鼠通过实施例1、2、3鹿脾提取物给药后，血清中SOD活力升高，恢复并接近正常生理盐水空白组。表明本发明鹿脾提取物可增强乙醇损伤模型小鼠血清中的SOD活力。

表4 乙醇损伤模型小鼠血清中SOD活力测定结果

组别SOD活力（U/mL）生理盐水组180.2±10.7模型150.7±8.6实施例1181.8±9.6^**实施例2179.3±8.3^**实施例3176.2±8.5^**

与模型组比较：*p<0.05 **p<0.01 

综上所述，梅花鹿鹿脾提取物可降低乙醇损伤模型小鼠血清中过氧化物、蛋白质羰基，升高还原性谷胱甘肽含量，增强血清中SOD活力，具有抗氧化的作用。