一种提高乳酸菌胆盐耐受性的方法

摘要

本发明公开了一种提高细胞壁中含谷氨酰胺和赖氨酸的乳酸菌胆盐耐受性的方法，所述方法为含有谷氨酰胺转氨酶的培养基培养所述乳酸菌。本发明中涉及的所述乳酸菌包括乳酸乳球菌8148菌株、植物乳杆菌亚种菌株、罗伊氏乳杆菌和干酪乳杆菌等所有细胞壁中含谷氨酰胺和赖氨酸的乳酸菌类菌钟，本发明优选谷氨酰胺转氨酶在培养基中的终浓度为3～25U/mL，同时通过谷氨酰胺转氨酶母液多次添加到培养基的方法进一步了提高乳酸菌胆盐耐受性。本发明所述方法简单，成本较低，易于工业化生产，通过所述方法可以显著提高现有市售的乳酸菌类益生菌对胆盐的抗性，有助于其在肠道内发挥功能。

说明书

技术领域

本发明涉及提高乳酸菌胆盐耐受性的方法，特别涉及一种提高细胞壁肽聚糖中含谷氨酰胺和赖氨酸的乳酸菌耐受胆盐性的方法。

背景技术

益生菌是指来源于宿主并对宿主健康有一定促进作用的微生物活体。而已经被证明是益生菌的菌株中，大部分属于乳酸菌。大量研究表明，能够作为人类胃肠道中益生菌的乳酸菌具有抗氧化、降低胆固醇、增强免疫力、抗肿瘤等重要生物学功能。益生菌能够在宿主体内有多大程度的存活量，和到达部位后的繁殖能力决定着其对宿主提供益处的力度或效果。这就要求制品中的乳酸菌能够通过上消化道以大量的存活菌到达肠道并且定植于肠粘膜，以发挥其益处，因而乳酸菌细胞应该具有对胆盐的耐受性。

胆盐(Bile salt)是由肝细胞分泌的胆汁酸与甘氨酸或牛磺酸结合而形成的钠盐或钾盐。胆盐的主要作用是帮助消化脂肪，所以胆盐对细胞膜中磷脂、脂肪酸和膜蛋白具有一定的破坏作用，从而改变了细胞膜的渗透性，对细胞造成伤害，使乳酸菌类益生菌死亡。因而，对胆盐具有一定的耐受性是乳酸菌能够在肠道存活、生长并发挥功效的先决条件之一，即：能够在正常生理胆盐浓度胁迫后生长和代谢的菌株才可能在肠道中存活。因此，提高乳酸菌对胆盐的耐受性是乳酸菌制品研制与开发的技术关键。

现有的方法主要包括从自然界分离筛选耐胆盐的乳酸菌菌株，对现有的商业化菌株进行定向选育、诱变或基因操作，以及利用微胶囊包裹菌株，以提高其耐胆盐的能力。这些方法在应用性方面都存在一些问题，如分离筛选兼具益生性和耐胆盐的菌株难度较大，后续的安全性评价也需要时间和成本，并且存在着由于安全性不达标导致不能应用的问题；对于第二种方法，由于现在的消费者对纯天然绿色食品的青睐和对基因修饰食品的排斥，如果对已实际应用的菌株进行定向选育、诱变或基因操作，存在着消费者接受度较低的风险；而第三种方法，目前国内外已经发展了多种微胶囊化技术应用于益生菌，但各自都存在着一些缺点，不能兼顾工业化生产与保持细菌活性之间固有的矛盾。

谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase，简称TG)是由331个氨基组成的分子量约38000的具有活性中心的单体蛋白质，其可催化蛋白质多肽发生分子内和分子间发生共价交联，从而改善蛋白质的结构和功能，对蛋白质的性质如：发泡性，乳化性，乳化稳定性，热稳定性、保水性和凝胶能力等效果显著，进而改善食品的风味、口感、质地和外观等。

目前，还尚未公开采用谷氨酰胺转氨酶处理乳酸菌以提高其胆盐耐受性的相关文献资料。

发明内容

本发明提供一种可以提高细胞壁肽聚糖中含谷氨酰胺和赖氨酸的乳酸菌耐受胆盐能力的方法，所述方法具有操作简单，成本低，实用性强等特点。

一种提高细胞壁肽聚糖中含谷氨酰胺和赖氨酸的乳酸菌胆盐耐受性的方法，所述方法为：用含有谷氨酰胺转氨酶的培养基培养所述乳酸菌；

进一步，所述谷氨酰胺转氨酶分至少两次添加；

再进一步，所述谷氨酰胺转氨酶优选分2到5次添加；

所述谷氨酰胺转氨酶在制备培养基开始到培养结束前的时间内添加。

所述乳酸菌具体包括乳酸乳球菌8148菌株、植物乳杆菌植物亚种菌株、罗伊氏乳杆菌和干酪乳杆菌等细胞壁肽聚糖中含谷氨酰胺和赖氨酸的乳酸菌类菌钟；

在最后一次添加所述谷氨酰胺转氨酶后，使谷氨酰胺转氨酶在培养基中的终浓度为3～25U/mL；

优选谷氨酰胺转氨酶在培养基中的终浓度为3～25U/mL；

进一步优选谷氨酰胺转氨酶在培养基中的终浓度为12U/mL；

进一步提高乳酸菌胆盐耐受性的方法还包括用水配制成50～500U/mL的谷氨酰胺转氨酶母液，用滤膜过滤，将谷氨酰胺转氨酶母液添加到所述乳酸菌培养基中；

上述乳酸菌的培养基包括MRS液体培养基、GM17液体培养基和MRS固体培养基。

本发明的有益效果

其一：

发明人发现凡是细胞壁肽聚糖中含谷氨酰胺和赖氨酸的乳酸菌类益生菌，都可以采用本发明的方法，有效地提高其对胆盐的耐受性。

采用谷氨酰胺转氨酶处理后能提高乳酸乳球菌和植物乳杆菌等的胆盐耐受性原理如下：

革兰氏阳性细菌细胞壁的结构简单，主要是由肽聚糖层所构成，肽聚糖是异型多糖大分子，每一肽聚糖单体含有三个组成部分，即双糖单位、由四个氨基酸连起来的短肽“尾”和肽“桥”。不同的革兰氏阳性菌可能具有组成不同的短肽“尾”和肽“桥”。特别是一些革兰氏阳性菌的短肽”尾”的组成是L-丙氨酸→D-谷氨酰胺→L-赖氨酸→D-丙氨酸，这其中恰巧具有了谷氨酰胺转氨酶的催化底物谷氨酰胺和赖氨酸。因此，发明人研究后认为，采用谷氨酰胺转氨酶处理乳酸菌后，使乳酸菌的细胞壁交联度增加，加密的细胞壁可有效阻挡胆盐分子穿过细胞壁去损伤细胞膜，从而赋予了采用谷氨酰胺转氨酶处理后的乳酸菌抗胆盐的优良特性。

本发明虽然能提高乳酸菌的胆盐耐受性，但是对酸胁迫效果不明显。酸胁迫和胆盐胁迫对细胞的损伤原因差异很大。酸胁迫会导致胞内pH值降低，抑制胞内酶活和转运系统的活性，造成糖酵解速率降低，从而影响细胞能量的产生。同时，胞内低pH值会诱导细胞消耗自身的能量来将胞内过多的H⁺泵出胞外，必然会进一步加重能量的消耗，从而严重抑制细胞生长。胆盐的主要作用是帮助人体消化脂肪，所以胆盐对细胞膜中磷脂、脂肪酸和膜蛋白具有一定的破坏作用，从而改变了细胞膜的渗透性，对细胞造成伤害。研究结果也证明了谷氨酰胺转氨酶处理对乳酸菌细胞的酸胁迫没有效果。

其二：

谷氨酰胺转氨酶，谷氨酰胺转氨酶广泛存在于动物组织，可催化蛋白质中L-赖氨酸和谷氨酰胺之间的结合反应，因而能使蛋白质或多肽之间发生共价交联，形成共价化合物的聚合物。人们一直都在食用含有谷氨酰胺转氨酶催化形成γ-谷氨酰赖氨酸异肽键的食物如水产加工品、火腿、香肠、面类、豆腐等，因此，用谷氨酰胺转氨酶处理乳酸菌类益生菌菌株对人体是安全的。

乳酸乳球菌一直以来这两个亚种被人们用来作为乳制品发酵剂，具有重要的经济价值，同时，它也是目前乳酸菌中研究最为深入的模式菌株，因此用其得到的实验结果在很大程度上能反映出乳酸菌的共性。植物乳杆菌是人体肠道内天然存在的一种细菌，服用植物乳杆菌后，对健康人群和病患者具有特定的医疗保健作用。目前，大量的植物乳杆菌菌株作为益生菌已经得到商业化应用。

综上所述，本发明在食品安全方面是绝对安全的，并且所研究的几种乳酸菌具有这一类乳酸菌的代表性。

其三：

本发明方法简单，成本较低，易于工业化生产，通过所述方法可以显著提高现有市售的乳酸菌类益生菌对胆盐的抗性，有助于其在肠道内发挥功能。例如：按照本实施例1中的方法用12U/mL谷氨酰胺转氨酶处理后的乳酸乳球菌在生长10h时对0.04％胆盐耐受性比未处理的提高了5.63倍；按照实施例2中的方法处理后的植物乳杆菌植物亚种在生长10h时对0.04％胆盐耐受性比未处理的提高了7.59倍。

附图说明

图1：0.04％胆盐胁迫2h对乳酸乳球菌8148菌株生长的影响情况图；

图2：谷氨酰胺转氨酶加入方式对乳酸乳球菌8148菌株0.04％胆盐胁迫2h耐受性的影响情况图；

图3：不同浓度谷氨酰胺转氨酶处理对乳酸乳球菌8148菌株0.04％胆盐胁迫2h耐受性的影响情况图；

图4：不同浓度谷氨酰胺转氨酶处理对植物乳杆菌植物亚种菌株0.04％胆盐胁迫2h耐受性的影响情况图。

具体实施方式

实施例1

一种通过谷氨酰胺转氨酶处理乳酸乳球菌8148菌株，提高其耐受胆盐能力的方法。

本实施例中，M17肉汤培养基粉末购买自青岛海博。M17肉汤培养基是用42.3g M17肉汤培养基粉末加热溶解于1000ml蒸馏水中,121℃高压灭菌15分钟,备用。

所述乳酸乳球菌8148菌株来自中国工业微生物菌种保藏管理中心，CICC编号20406。

本发明的操作步骤依次为：

1、配制GM17液体培养基：具体方法是在M17肉汤培养基中添加终浓度为5g/L葡萄糖，得到GM17液体培养基。

2、接种：将活化好的乳酸乳球菌8148菌株以5％的量接种于GM17培养基中，30℃下静置培养4h作为种子液。

3、培养：再以5％的接种量将种子液接种于GM17培养基中培养乳酸乳球菌8148菌株。

4、谷氨酰胺转氨酶溶液配制：用水配制成200U/mL的谷氨酰胺转氨酶母液，用0.45μm滤膜过滤后，放置4±2℃的条件下冷藏备用。

5、谷氨酰胺转氨酶处理：分别于2h、4h、6h加入等量步骤4得到的谷氨酰胺转氨酶母液，使谷氨酰胺转氨酶在培养基中的终浓度为3～25U/mL。

6、静置培养：静置培养至8h，得到谷氨酰胺转氨酶处理后的乳酸乳球菌8148菌株。

其中，本实施例选择GM17培养基是由于乳酸乳球菌8148菌株在GM17培养基的生长较好，本实施例的方法不限于培养基，本实施例的GM17培养基可以替换为凡是能够使乳酸乳球菌8148菌株生长的液体培养基。

胁迫抗性的测定一般采用存活率法，此法需要多次10倍稀释，误差难以避免。为减少由于稀释带来的误差，本发明采用基于比浊法的耐受率法来测定乳酸乳球菌8148菌株的胆盐耐受性。乳酸乳球菌8148菌株在0.04％胆盐胁迫2h后直接接种GM17培养基进行培养。由于胆盐对细胞的损伤，导致活细胞数减少，延滞期明显延长，对数期生长速率相对较慢，但是最终生物量与未胁迫的对照组一致。细胞对胆盐的耐受性越强，则生物量与未受胁迫的对照组的越接近，耐受率越高，即抗性越强，反之亦然。如图1所示，胆盐耐受率曲线呈现出前期迅速降低至最低值，后期逐渐升高至100％的特点。曲线的后期足以反映出细胞经胆盐胁迫后活细胞的生长能力，即对胆盐胁迫的耐受性。因此，胆盐耐受率曲线的后期上升阶段的情况可以用来表征细胞对胆盐胁迫的抗性大小。

胆盐耐受率的具体测定方法为：菌株培养8h后，将5mL菌液离心，离心条件为4000r/min,10min，弃上清液，将细胞沉淀用生理盐水洗涤一次，重悬于含0.04％(w/v)胆盐的生理盐水中，置37℃下水浴2h。在4000r/min,10min下离心，生理盐水洗涤一次。用5mL的培养基重悬细胞沉淀，充分混匀作为种子液，以5％的接种量接种于培养基中，于0h、9h、10h、11h、12h、13h测生物量OD₆₀₀。同时用生理盐水代替胆盐溶液进行相同的实验操作，以此作为对照。根据公式计算胆盐胁迫耐受率。

胆盐胁迫耐受率(％)＝OD_胁迫/OD_对照*100％

对照实验：第一组为不加谷氨酰胺转氨酶的实验组，即按照实施例1的步骤1,2,3,6操作后，按照上述方法测定其胆盐胁迫耐受率；第二组为一次性添加谷氨酰胺转氨酶至终浓度的实验组，即：将实施例1中的步骤5替换为“在培养的0时刻在培养基中一次性添加谷氨酰胺转氨酶至终浓度3-25U/mL”，其他同实施例1；第三组为实施例1的实验组；

其中，第二组和第三组中，添加谷氨酰胺转氨酶至终浓度9U/mL的实验结果如表1记载。

表1  谷氨酰胺转氨酶加入方式对乳酸乳球菌8148菌株0.04％胆盐耐受性的影响

由附图2和表1可见，在培养的0时刻一次性添加谷氨酰胺转氨酶和培养过程中分三次加入终浓度为9U/mL的谷氨酰胺转氨酶，均可以明显提高乳酸乳球菌8148菌株对胆盐的耐受性。并且，培养过程中分三次加入的效果明显要优于在培养的0时刻一次性加入。

发明人也测定了不同浓度谷氨酰胺转氨酶对乳酸乳球菌8148菌株对0.04％胆盐胁迫2h耐受性的影响，数据见附图3，结果表明，培养过程中分三次等量添加谷氨酰胺转氨酶，在0～12U/mL范围内，随着所添加的谷氨酰胺转氨酶浓度的增加，乳酸乳球菌8148菌株0.04％胆盐耐受性也随之提高，尤其是添加12U/mL的效果更加显著。但是，当谷氨酰胺转氨酶添加浓度为15和20U/mL时，效果反而低于谷氨酰胺转氨酶添加浓度为6U/mL的，并且谷氨酰胺转氨酶添加浓度为20U/mL的效果比15U/mL的更差。

实施例2

一种通过谷氨酰胺转氨酶处理植物乳杆菌植物亚种菌株，提高其耐受胆盐能力的方法。

本实施例中，MRS肉汤培养基粉末购买自青岛海博。所述植物乳杆菌植物亚种菌株来自中国工业微生物菌种保藏管理中心，CICC编号6073。

本发明的操作步骤依次为：

1、配制MRS液体培养基：具体方法是称取52.4g MRS肉汤培养基粉末，加热溶解于1000ml蒸馏水中,121℃高压灭菌15分钟，得到MRS液体培养基。

2、接种：将活化好的植物乳杆菌植物亚种菌株以5％的量接种于MRS液体培养基中，30℃下静置培养9.5h作为种子液。

3、培养：再以5％的接种量接种于MRS液体培养基中，培养植物乳杆菌植物亚种菌株。

4、谷氨酰胺转氨酶溶液配制：用水配制成200U/mL的谷氨酰胺转氨酶母液，用0.45um滤膜过滤后，放置4±2℃的条件下冷藏备用。

5、谷氨酰胺转氨酶处理：分别于植物乳杆菌植物亚种菌株培养2h、4h、6h时加入步骤4得到的谷氨酰胺转氨酶母液，最后一次添加谷氨酰胺转氨酶后，使谷氨酰胺转氨酶在培养基中的终浓度为3～25U/mL。

6、静置培养：静置培养至8h，得到谷氨酰胺转氨酶处理后的植物乳杆菌植物亚种菌株。

其中，本实施例选择MRS液体培养基是由于植物乳杆菌植物亚种菌株在MRS液体培养基的生长较好，本实施例的方法不限于培养基，本实施例中的MRS液体培养基可以替换为凡是能够使植物乳杆菌植物亚种菌株生长的液体培养基。

发明人对实施例2，即采用谷氨酰胺转氨酶处理后的植物乳杆菌植物亚种菌株做了0.04％胆盐胁迫2h实验，结果见附图4。

从附图4可以看出，培养过程中分三次等量添加谷氨酰胺转氨酶12U/mL对植物乳杆菌植物亚种提高抗胆盐能力的效果最好，但是，当谷氨酰胺转氨酶添加浓度为15U/mL时，效果反而低于谷氨酰胺转氨酶添加浓度为9U/mL的。因此，此法对乳杆菌类益生菌提高胆盐抗性同样有效。

实施例3

一种通过谷氨酰胺转氨酶处理植物乳杆菌植物亚种菌株，提高其耐受胆盐能力的方法。

本实施例中，MRS肉汤培养基购买自青岛海博，所述植物乳杆菌植物亚种菌株来自中国工业微生物菌种保藏管理中心，CICC编号6073。

本发明的操作步骤依次为：

1、配制MRS液体培养基：具体方法是称取52.4g MRS肉汤培养基粉末，加热溶解于1000ml蒸馏水中,121℃高压灭菌15分钟，得到MRS液体培养基。

2、接种：将活化好的植物乳杆菌植物亚种菌株以5％的量接种于MRS液体培养基中，30℃下静置培养9.5h作为种子液。

3、培养：再以5％的接种量接种于MRS液体培养基中，培养植物乳杆菌植物亚种菌株。

4、谷氨酰胺转氨酶溶液配制：用水配制成100U/mL的谷氨酰胺转氨酶母液，用滤膜过滤，备用。

5、谷氨酰胺转氨酶处理：从培养植物乳杆菌植物亚种菌株开始到培养结束前1h的任意时间内，向液体培养基中分二到五次加入的谷氨酰胺转氨酶母液，最后一次添加谷氨酰胺转氨酶母液后，使谷氨酰胺转氨酶的终浓度为3～25U/mL。

6、静置培养：静置培养后得到谷氨酰胺转氨酶处理后的植物乳杆菌植物亚种菌株。

实施例4

一种通过谷氨酰胺转氨酶处理罗伊氏乳杆菌，提高其耐受胆盐能力的方法。

其中，所述罗伊氏乳杆菌来自中国工业微生物菌种保藏管理中心，CICC编号6123。

本发明的操作步骤依次为：

1、接种：将活化好的罗伊氏乳杆菌接种于购买的MRS肉汤培养基中，培养罗伊氏乳杆菌。

2、谷氨酰胺转氨酶溶液配制：用水配制成50～500U/mL的谷氨酰胺转氨酶母液，用滤膜过滤，备用。

3、谷氨酰胺转氨酶处理：从培养罗伊氏乳杆菌的0时刻到培养结束前的任意时间内，向液体培养基中至少一次加入的谷氨酰胺转氨酶母液，最后一次添加谷氨酰胺转氨酶

母液后，使谷氨酰胺转氨酶的终浓度为3～25U/mL。

4、静置培养：静置培养后得到谷氨酰胺转氨酶处理后的罗伊氏乳杆菌。

通过上述步骤处理后所述菌株的胆盐耐受性明显提高。

实施例5

一种通过谷氨酰胺转氨酶处理干酪乳杆菌，提高其耐受胆盐能力的方法。

其中，所述干酪乳杆菌来自中国工业微生物菌种保藏管理中心，CICC编号6108。

本发明的操作步骤依次为：

1、制备MRS液体培养基：称取52.4g MRS肉汤培养基粉末，加热溶解于1000ml蒸馏水中,121℃高压灭菌15分钟，得到MRS液体培养基。

2、谷氨酰胺转氨酶处理：向MRS液体培养基中分N次加入的谷氨酰胺转氨酶，最后一次添加谷氨酰胺转氨酶后，使谷氨酰胺转氨酶的终浓度为3～25U/mL，其中N为大于1的整数。

3、接种：将活化好的干酪乳杆菌接种于MRS液体培养基中，培养干酪乳杆菌。

4、静置培养：静置培养后得到谷氨酰胺转氨酶处理后的干酪乳杆菌。

通过上述步骤处理后所述菌株的胆盐耐受性明显提高。

发明人通过与实施例1、实施例2、实施例3、实施例4和实施例5相同或相似的实验，发现本发明的方法并不是适用于所有的乳酸菌，仅仅适用于部分乳酸菌，随后发明人对适用于本发明的乳酸菌类益生菌种类进行了研究，结果发现，乳酸乳球菌8148菌株、植物乳杆菌植物亚种等适用于本发明的乳酸菌的细胞壁肽聚糖具有共性。研究结果显示，植物乳杆菌植物亚种菌株每mg肽聚糖中含13.36μg谷氨酰胺和19.05μg赖氨酸，乳酸乳球菌8148菌株也含有谷氨酰胺和赖氨酸；文献报道乳酸乳球菌8148的衍生菌株MG1363，其细胞壁肽聚糖中也含有谷氨酰胺和赖氨酸，适用于本发明，同理，罗伊氏乳杆菌和干酪乳杆菌的细胞壁肽聚糖中也同时含有谷氨酰胺和赖氨酸。反之，对照则是乳酸乳球菌NFL菌株，经测定，其细胞壁肽聚糖中不含谷氨酰胺，只有赖氨酸，赖氨酸含量为64.62μg/mg肽聚糖，用谷氨酰胺转氨酶处理乳酸乳球菌NFL菌株的培养基后，其胆盐抗性没有变化。

测定结果表明适用于本发明的乳酸菌，其细胞壁肽聚糖中须同时含有谷氨酰胺和赖氨酸。

实施例6

一种通过谷氨酰胺转氨酶处理细胞壁肽聚糖中含谷氨酰胺和赖氨酸的乳酸菌，提高其耐受胆盐能力的方法。

本发明的操作步骤依次为：

1.菌株的选择：首先，满足本实施例的菌株属于乳酸菌，其次，所述菌株的细胞壁的肽聚糖中同时含有谷氨酰胺和赖氨酸。

2.制备MRS固体培养基：称取52.4g MRS肉汤培养基粉末和15g琼脂粉，加热溶解于1000ml蒸馏水中,121℃高压灭菌15分钟，得到MRS液体培养基。

3.谷氨酰胺转氨酶处理：向灭菌后凉至45℃的MRS液体培养基中一次性加入谷氨酰胺转氨酶，使谷氨酰胺转氨酶的终浓度为3～25U/mL。

4.接种：将活化好的干酪乳杆菌接种于MRS固体培养基中，混匀后，快速倒进培养皿中，制备成平板，培养乳酸菌。

5.静置培养：静置培养后得到谷氨酰胺转氨酶处理后的乳酸菌。

通过上述步骤处理后乳酸菌的胆盐耐受性明显提高。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。