一种中国被毛孢在药品、保健食品或食品中应用

摘要

本发明涉及一种中国被毛孢在药品、保健食品或食品中应用，尤其是将中国被毛孢的菌丝体及代谢产物用于制备防治PM2.5危害的口服制剂、注射液、输液剂、或栓剂中的应用。本发明的特点是将中国被毛孢的菌丝体及代谢产物用于制备防治PM2.5危害的口服制剂、注射液、输液剂、或栓剂，中国被毛孢是通过特定的生产方法制备而成。本发明的优点是制备的产品既能促进体内巨噬细胞吞噬PM2.5的能力，达到快速降低PM2.5毒性的效果，又能促进身体内的PM2.5分泌进入肠道，并被快速的排出体外，减少PM2.5在体内的沉积，达到快速减毒以及排毒的功效。本发明对PM2.5的危害防治意义重大。

说明书

技术领域

本发明涉及一种中国被毛孢在药品、保健食品或食品中应用，尤其是将中国被毛孢的菌丝体及代谢产物用于制备防治PM2.5危害的口服制剂、注射液、输液剂、或栓剂中的应用。 

背景技术

PM2.5即细颗粒物，又称细粒或细颗粒，是指环境空气中空气动力学当量直径小于等于2.5微米的颗粒物。细颗粒物可携带重金属、硫酸盐、有机物、病毒等直接进入呼吸道、肺部和体内；细颗粒物进入呼吸道内表面后，与肺组织相互作用，被肺泡巨噬细胞吞噬，通过肺的内呼吸进入血液到达其他器官，或长期潴留于肺泡中，进入肺间质，形成病灶^[1]。2013年10月17日，世界卫生组织下属国际癌症研究机构(IARC)发布报告，首次指认大气污染对人类致癌，并视其为普遍和主要的环境致癌物。世界卫生组织在2005年发布的《空气质量标准》中，PM2.5的日平均标准值为30μg/m³，年平价值为10μg/m³。中国现行的PM2.5日平均标准值为75μg/m³，年平价值为35μg/m³。2014年1月10日，绿色和平组织发布的中国74个城市2013年的PM2.5年均浓度排名中，92％的城市PM2.5值不达标，43％的城市PM2.5超标2倍以上。有研究表明，当空气中PM2.5的浓度长期高于10μg/m³，就会带来死亡风险的上升，浓度每增加10μg/m³，总死亡风险上升4％，心肺疾病带来的死亡风险上升6％，肺癌带来的死亡风险上升8％^[2]。中国科学院陈竺院士等研究者，于《柳叶刀》杂志上发表的文章中估计，中国每年因室外空气污染导致的早死人数在35万-50万人之间^[3]。PM2.5的危害极大，而目前，对于PM2.5危害的防治主要为体外的手段，包括雾霾天减少外出，室内安装过滤或吸收PM2.5的设备，外出戴专业防尘口罩等，这些手段均给生活带来诸多不便；对于通过呼吸系统进入体内的PM2.5，并没有很好的应对手段。因此，制备出对PM2.5危害有防治作用的药品、保健食品或食品尤为重要。 

在本发明之前未发现中国被毛孢的菌丝体及代谢产物有防治PM2.5危害的研究报道。 

军事医学科学院张英鸽教授在《纳米毒理学》专著中指出，纳米颗粒存在于PM2.5中，与PM2.5相比，纳米颗粒可以更容易地进入人类呼吸道及肺泡，并在 其中沉积，颗粒越小沉积越多，对人体的危害也就越大；因此，纳米颗粒常常被用作PM2.5的替代材料进行毒理学研究^[1]。本发明使用纳米活性炭(200纳米左右，由张英鸽教授提供)作为PM2.5的替代材料进行实验。张英鸽团队与本发明人之一李春启团队等合作，在国际上首先发现，进入斑马鱼和大鼠体内的纳米活性炭颗粒能通过肠道的杯状细胞分泌而排泄，这一新颖的纳米排泄途径被命名为肠杯状细胞分泌通路(IGCSP)^[4]；在此基础上，本发明使用斑马鱼IGCSP模型和巨噬细胞吞噬模型，评价柯氏牌蝙蝠蛾被毛孢菌丝体胶囊对PM2.5的防治功效。 

斑马鱼是一种常见的热带鱼，由于饲育容易、胚胎透明、体外受精、突变种多、遗传学工具成熟等诸多优点，近年来已成为新药研发的新兴模式动物^[5-8]。由于斑马鱼基因与人类基因的相似度达到87％，这意味着在其身上做药物实验所得到的结果在多数情况下也适用于人体^[9-10]。 

ZL 2011 1 0223048.5和ZL 2011 1 0156872.3对中国被毛孢(Hiresutella sinensis X.J.Liu，Y.L.Guo.)的菌丝体及代谢产物的制备方法有了具体说明。本发明分为3个部分进行说明，分别为：①中国被毛孢的菌丝体及代谢产物提高体内巨噬细胞吞噬PM2.5的能力。②中国被毛孢的菌丝体及代谢产物促进体内的PM2.5分泌进入肠道。③中国被毛孢的菌丝体及代谢产物促进肠道内的PM2.5排泄。通过以上的实验说明，中国被毛孢的菌丝体及代谢产物既能促进体内巨噬细胞吞噬PM2.5的能力，达到快速降低PM2.5毒性的效果，又能促进PM2.5进入肠道，并被快速的排出体外，减少PM2.5在体内的沉积时间，达到快速排毒功效，所以，中国被毛孢的菌丝体及代谢产物的胶囊可以广泛应用于制备防治PM2.5危害的药品、保健食品和食品。 

发明内容

本发明目的在于提供一种学名为中国被毛孢(Hiresutella sinensis X.J.Liu，Y.L.Guo.)的菌丝体及代谢产物用于抗PM2.5的新用途，具体涉及中国被毛孢的菌丝体及代谢产物的生产菌种--蝙蝠蛾被毛孢菌的固体或液体产物/组分及复方在制备防治PM2.5的危害食品、保健食品和药品中应用。 

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案： 

中国被毛孢的菌丝体及代谢产物提高体内巨噬细胞吞噬PM2.5的能力。 

中国被毛孢的菌丝体及代谢产物促进体内的PM2.5分泌进入肠道。 

中国被毛孢的菌丝体及代谢产物促进肠道内的PM2.5排泄。 

所述中国被毛孢的菌丝体及代谢产物通过下述方法制备而得 

(1)半固体菌种斜面培养： 

培养基溶于煮沸的水中，调节pH至7.2，在121℃、灭菌30分钟，制成斜面培养基；冷却后放入28℃培养箱培养3天，确认无杂菌污染后，接入中国被毛孢菌种，均匀涂布；控制温度17～19℃培养，培养时间30～45天；然后，放入0～4℃冰箱保存； 

其中斜面培养基的组成按重量百分比为：脱脂蚕蛹粉2.1～3.0％，玉米粉1.5％，麸皮1～5％，葡萄糖2％，KH₂PO₄0.02％，MgSO₄ 0.01％，琼脂1.8％，其余为水； 

(2)液体菌种摇瓶培养： 

把斜面培养后的菌种接种到装有液体培养基的摇瓶，在摇床震荡培养，培养温度17～19℃，摇床转速100～120rpm，培养8～13天，接入无菌接种罐内，供液体菌种增殖培养接种用； 

摇瓶菌种培养基的组成按重量百分比为：脱脂蚕蛹粉2.1～3.0％，玉米粉1.5％，麸皮1～5％，葡萄糖2％，KH₂PO₄ 0.02％，MgSO₄ 0.01％，其余为水； 

(3)液体菌种增殖培养： 

液体菌种增殖培养在培养罐中培养，培养条件为：罐压0.03～0.05Mpa，通气量1：0.2，罐温17～19℃，搅拌速度120～140rpm，培养7～12天；当培养液中葡萄糖糖量快速下降，菌丝生长旺盛，菌丝稠密，菌丝体体积浓度不低于13％，检查无杂菌后，移入发酵罐； 

液体菌种增殖培养的培养基组成按重量百分比为：脱脂蚕蛹粉2.1～3.0％，玉米粉1.5％，麸皮1～5％，葡萄糖2％，KH₂PO₄ 0.02％，MgSO₄ 0.01％，其余为水； 

(4)发酵培养 

发酵培养在培养罐中培养，培养条件为：罐压0.03～0.05Mpa，通气量1：0.2，罐温17～19℃，搅拌速度120～140rpm，培养9～12天，菌丝体体积浓度达25％以上，葡萄糖降至1.0％，视为发酵终点，放罐； 

发酵培养基的组成按重量百分比为：脱脂蚕蛹粉 2.1％，麸皮 5％，玉米粉1.5％，葡萄糖 2％，鱼蛋白胨0.25％，肉蛋白胨0.75％，酵母膏0.1％，KH₂PO₄ 0.02％，MgSO₄ 0.01％，其余为水；调节pH至7.2； 

(5)固液分离： 

经发酵培养后的发酵液经固液分离器分离，分离出菌丝体和发酵清液； 

(6)膜分离： 

将固液分离过程中的发酵清液用300-4000分子量的膜分离器分离，得膜分离浓液； 

(7)菌丝体与分离浓液干燥： 

将膜分离浓液喷入干燥器，与菌丝体一同干燥，干燥温度在80-100℃，得产品。 

通过技术方案中的3个实验发现，中国被毛孢的菌丝体及代谢产物能提高体内巨噬细胞吞噬PM2.5能力，使进入体内的PM2.5快速地被巨噬细胞吞噬，并且在溶酶体和氧化爆发的作用下消化PM2.5中的有害物质，达到减毒的效果；同时，中国被毛孢的菌丝体及代谢产物促进体内的PM2.5分泌进入肠道，加速PM2.5从体内排出，从而减少PM2.5对细胞、组织和器官的损害，最终达到清除体内PM2.5的效果。因此，中国被毛孢的菌丝体及代谢产物可以在制备抗PM2.5危害的食品、保健食品和药品中应用。 

本发明的含中国被毛孢的菌丝体及代谢产物的药品和保健食品可以是任何合适形式，例如固体，半固体，液体或气溶胶形式。一般情况下，药品含有蝙蝠蛾被毛孢或提取物作为活性成分，与适合外部，肠道，或肠胃外给药的有机或无机载体或赋形剂混合。制品可以是复方的，制备上述制剂时，可使用常规的制剂的辅料和技术。 

本发明的含中国被毛孢的菌丝体及代谢产物的食品可以是任何合适形式，例如固体，半固体，液体或气溶胶形式。制备上述食品时，可使用常规的食品制备技术。 

有益效果：本发明的含中国被毛孢的菌丝体及代谢产物的药品和保健食品可以是任何合适形式，例如固体，半固体，液体或气溶胶形式。一般情况下，药品含有蝙蝠蛾被毛孢或提取物作为活性成分，与适合外部，肠道，或肠胃外给药的 有机或无机载体或赋形剂混合。制品可以是复方的，制备上述制剂时，可使用常规的制剂的辅料和技术。 

附图说明：

图1：柯氏胶囊提高体内巨噬细胞吞噬PM2.5的能力 

A、空白组、模型组、柯氏胶囊组处理电镜对照图(单位剂量μg/ml) 

B、空白组、模型组、柯氏胶囊组中吞噬活性炭的巨噬细胞个数图表对照 

C、空白组、模型组、柯氏胶囊组中巨噬细胞对PM2.5的促进倍数对照 

图2：柯氏胶囊促进体内的PM2.5分泌进入肠道。 

图3：柯氏胶囊促进肠道内的PM2.5排泄。 

具体实施方式

下面对本发明的实施作具体说明： 

实施例1: 

中国被毛孢的菌丝体及代谢产物提高体内巨噬细胞吞噬PM2.5的能力。 

在发明的3个实施例中，均以杭州柯氏生物科技有限公司提供的柯氏胶囊作为中国被毛孢的菌丝体及代谢产物，对相应能力的测试，其中的柯氏胶囊是按ZL 2011 1 0223048.5和ZL 2011 1 0156872.3的方法制备而得的，测定提高体内巨噬细胞吞噬PM2.5的能力。 

1、实验动物 

转基因Albino斑马鱼，在28℃条件下用养鱼用水培养(养鱼)用水水质：每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为480～510μS/cm；pH为6.9～7.2；硬度为53.7～71.6mg/LCaCO₃)。取4～5对斑马鱼亲本交配，按照Westerfield^[11]的方法孵化胚胎。将处于最佳处理阶段的斑马鱼置于解剖显微镜下观察，挑取发育正常的斑马鱼移入6孔微孔板中。实验完成后，用三卡因甲磺酸对的斑马鱼进行过度暴露处理，从而将斑马鱼麻醉处死。麻醉处死的操作步骤符合美国兽医协会(AVMA)对动物麻醉处死的规范要求。 

2、受试药： 

中国被毛孢的菌丝体及代谢产物的水提物。中国被毛孢的菌丝体及代谢产物由杭州柯氏生物科技有限公司提供，再制成水提液。 

3、实验仪器与试剂 

解剖显微镜(SMZ645，Nikon公司)；6孔板(NestBiotech)；PM2.5材料(纳米活性炭，军事医学科学院张英鸽教授提供)；显微注射仪(IM300，Narishige)。 

4、实验方法 

通过显微注射的方法，将PM2.5材料(纳米活性炭)注射到Albino斑马鱼幼鱼的血液循环内，将注射后的斑马鱼分4组(每组30斑马鱼)，分别为模型组(不加任何药物处理)，100μg/ml给药组，333μg/ml给药组，1000μg/ml给药组；没有注射纳米活性炭同时不加任何药物处理的斑马鱼作为空白组。中国被毛孢的菌丝体及代谢产物水提液以溶解的方式给药，相当于人的口服给药和经皮吸收；给药浓度根据预实验的无可见不良反应剂量水平(NOAEL＝1000μg/ml)而得。给药组1天后，使用中性红进行整体斑马鱼巨噬细胞染色^[12]，每组随机挑选10尾斑马鱼进行拍照。利用图像处理软件分析斑马鱼巨噬细胞中的活性炭信号(S)，即吞噬活性炭的巨噬细胞，并计算给药组对巨噬细胞吞噬PM2.5的增强倍数，公式为：巨噬细胞对PM2.5吞噬的增强倍数＝S(给药组)/S(模型组)。实验数据用mean±SE表示。 

5、实验结果 

药物处理结束后，对各实验组进行拍照，并将典型图片汇总为图1A。在图1A中，图片为斑马鱼头部区域，黑色虚线为巨噬细胞吞噬活体碳的分析区域，红色斑块为中性红染色后的巨噬细胞，黑色箭头所指为吞噬了活性炭的巨噬细胞(巨噬细胞由于吞噬了活性炭而显示为黑色)。空白组的巨噬细胞均为红色，而注射了活性炭的斑马鱼，巨噬细胞有出现吞噬现象而出现黑色(黑色箭头所指)，说明进入体内的活性炭能被巨噬细胞吞噬。对各实验组吞噬活性炭的巨噬细胞进行统计，绘制柱状图(图1B,*p<0.05,**p<0.001VS.模型组)，并计算给药组对巨噬细胞吞噬PM2.5的促进倍数(图1C,*p<0.05,**p<0.001VS.模型组)。由图1可知，给药组在浓度为100μg/ml、333μg/ml和1000μg/ml时，对巨噬细胞吞噬PM2.5的促进倍数分别为1.3、2.1和3.1，与模型组相比较，均有统计学意义(p<0.05,p<0.001,p<0.001)，说明给药组对巨噬细胞吞噬PM2.5有明显的增强作用，并且呈现浓度依赖性，浓度越高，促进吞噬作用越明显。中国被毛孢的菌丝体及代谢产物能促进巨噬细胞吞噬PM2.5的能 力，达到快速降低PM2.5毒性的效果。马文俊等人利用小鼠碳粒廓清法(以碳素墨水作为碳粒材料)证实了蝙蝠蛾被毛孢菌丝体能增强巨噬细胞功能^[13]。 

实施例2: 

中国被毛孢的菌丝体及代谢产物促进体内的PM2.5分泌进入肠道。 

1、实验动物 

野生型AB系斑马鱼，在28℃条件下用养鱼用水培养(养鱼用水水质：每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为480～510μS/cm；pH为6.9～7.2；硬度为53.7～71.6mg/LCaCO₃)。取4～5对斑马鱼亲本交配，按照Westerfield^[11]的方法孵化胚胎。将处于最佳处理阶段的斑马鱼置于解剖显微镜下观察，挑取发育正常的斑马鱼移入6孔微孔板中。实验完成后，用三卡因甲磺酸对的斑马鱼进行过度暴露处理，从而将斑马鱼麻醉处死。麻醉处死的操作步骤符合美国兽医协会(AVMA)对动物麻醉处死的规范要求。 

2、受试药： 

中国被毛孢的菌丝体及代谢产物的水提物。中国被毛孢的菌丝体及代谢产物由杭州柯氏生物科技有限公司提供，再制成水提液。 

3、实验仪器与试剂 

解剖显微镜(SMZ645，Nikon公司)；6孔板(Nest Biotech)；PM2.5材料(纳米活性炭，军事医学科学院张英鸽教授提供)；显微注射仪(IM300，Narishige)。 

4、实验方法 

通过显微注射的方法，将PM2.5材料(纳米活性炭)注射到斑马鱼幼鱼的卵黄囊内(相当于肌肉注射)；将注射后的斑马鱼分4组(每组15尾斑马鱼)，分别为模型组(不加任何药物处理)，100μg/ml给药组，333μg/ml给药组，1000μg/ml给药组；中国被毛孢的菌丝体及代谢产物水提液以溶解的方式给药，相当于人的口服给药和经皮吸收；给药浓度根据预实验的无可见不良反应剂量水平(NOAEL＝1000μg/ml)而得。给药处理5天后，统计肠道分泌纳米活性炭的斑马鱼数量，并计算肠道分泌活性炭发生率(分泌率＝肠道分泌活性炭数/总数)，通过与模型组相比(卡方检验)，判断中国被毛孢的菌丝体及代谢产物是否内促进体内纳米活性炭(PM2.5)分泌进入肠道。 

5、实验结果 

药物处理结束后，对各实验组进行拍照，并将典型图片汇总为图2。由图2可知，注射到斑马鱼体内的纳米活性炭能进入肠道，说明体内的纳米活性炭通过肠道排泄，这一现象与张英鸽教授团队的研究结果一致^[1]。 

中国被毛孢的菌丝体及代谢产物水提物在给药浓度为100μg/ml和333μg/ml时，斑马鱼肠道分泌活性炭发生率分别为36.7％和50％，均高于模型组(26.7％)，但与模型组相比，没有统计学意义(p>0.05)；在给药浓度为1000μg/ml时，分泌率为66.7％，与模型组(26.7％)相比，有显著性差异(p<0.01)。在给药浓度为100μg/ml至1000μg/ml范围内，中国被毛孢的菌丝体及代谢产物水提物促进体内纳米活性炭(PM2.5)分泌进入肠道，并且呈现浓度依赖性，浓度越高，促进作用越明显(表1，图2)。 

表1中国被毛孢的菌丝体及代谢产物促进体内的PM2.5分泌进入肠道 

*p<0.01VS.模型组 

实施例3: 

中国被毛孢的菌丝体及代谢产物促进肠道内的PM2.5排泄。 

1、实验动物 

野生型AB系斑马鱼，在28℃条件下用养鱼用水培养(养鱼用水水质：每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为480～510μS/cm；pH为6.9～7.2；硬度为53.7～71.6mg/LCaCO₃)。取4～5对斑马鱼亲本交配，按照Westerfield^[11]的方法孵化胚胎。将处于最佳处理阶段的斑马鱼置于解剖显微镜下观察，挑取发育正常的斑马鱼移入6孔微孔板中。实验完成后，用三卡因甲磺酸对的斑马鱼进行过度暴露处理，从而将斑马鱼麻醉处死。麻醉处死的操作步骤符合美国兽医协会(AVMA)对动物麻醉处死的规范要求。 

2、受试药： 

中国被毛孢的菌丝体及代谢产物的水提物。中国被毛孢的菌丝体及代谢产物由杭州柯氏生物科技有限公司提供，再制成水提液。 

3、实验仪器与试剂 

解剖显微镜(SMZ645，Nikon公司)；6孔板(Nest Biotech)；PM2.5材料(纳米活性炭，军事医学科学院张英鸽教授提供)。 

4、实验方法 

先让斑马鱼将混悬于水中的PM2.5材料(纳米活性炭)吞入肠道，然后挑取肠道纳米活性炭吞入量较一致的斑马鱼，分成4组(每组15尾斑马鱼)，分别为模型组(不加任何药物处理)，100μg/ml给药组，333μg/ml给药组，1000μg/ml给药组；中国被毛孢的菌丝体及代谢产物水提液以溶解的方式给药，相当于人的口服给药和经皮吸收；给药浓度根据预实验的无可见不良反应剂量水平(NOAEL＝1000μg/ml)而得。给药处理1天后，统计各实验组全排空(肠道内不含纳米活性炭)的斑马鱼数量，计算各实验组的全排空率(全排空数/总数)，通过比较给药组与模型组的全排空率(卡方检验)，判断中国被毛孢的菌丝体及代谢产物是否促进肠道内纳米活性炭(PM2.5)排泄。 

5、实验结果 

在给药浓度为100μg/ml和333μg/ml时，斑马鱼肠道内纳米活性炭的全排空率分别为46.7％和60％，均高于模型组(40％)，但与模型组相比，没有统计学意义(p>0.05)；在给药浓度为1000μg/ml时，全排空率分为100％，与模型组(40％)相比，有极显著性差异(p<0.001)。给药浓度在100μg/ml和1000μg/ml范围内，对纳米活性炭的排泄促进作用随着浓度的增加而增强，呈现浓度依赖性，说明中国被毛孢的菌丝体及代谢产物的水提物能明显地促进纳米活性炭(PM2.5)排泄(表2，图3)。 

表2中国被毛孢的菌丝体及代谢产物促进肠道内PM2.5的排泄 

*p<0.001 VS.模型组 

参考文献 

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