一种快速测定禽源多杀性巴氏杆菌培养物中细菌总数的方法

摘要

本发明涉及一种快速测定禽源多杀性巴氏杆菌培养物中细菌总数的方法，它包括以下步骤：①洗涤液配制；②取样；③样品处理；④检测：利用紫外分光光度计，测定处理后的样品于600nm波长时的OD值，以步骤①中洗涤液为参比；⑤计算：当OD值在0.4-1.2的范围内时，样品的含菌数为(4129.4×OD600+509.31)×106CFU/mL，当OD值＜0.4时，将样品适当浓缩后测定，当OD值＞1.2时，将样品适当稀释后测定，并计算含菌总数。本发明的目的在于提供一种快速测定禽源多杀性巴氏杆菌培养物中细菌总数的方法。本发明的优点在于：1.简单；2.快速；3.误差小。

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速测定禽源多杀性巴氏杆菌培养物中细菌总数的方法。

背景技术

禽霍乱，又名禽出血性败血症、禽巴氏杆菌病或禽摇头瘟等，是由多杀性 巴氏杆菌(Pasteurella multocida)引起的侵害各种禽类的接触性传染病。 该病的流行季节主要为夏末和秋季，主要通过消化道和呼吸道传染。各种日龄 均易感，但多发生于性成熟的禽类。该病最急性发作时，病程短促、死亡快， 常看不见发病即死亡。急性发作时，病禽体温升高，羽毛松乱，精神萎顿，独 居一隅，闭目瞌睡。口、鼻分泌物增多而引起呼吸困难、摇头企图甩出喉头粘 液。典型的剖检病变为急性败血症，心包内充满透明橙黄色渗出物，心冠脂肪 上有出血点。肝、脾肿大，质地变脆、表面密布有大量针尖大的圆形灰白色坏 死点。肠道出血，以小肠前段和大肠粘膜充血和出血最严重，小肠后段和盲肠 较轻。肠内容物呈胶冻样，肠粘膜脱落，肠淋巴集结环状肿大、出血。慢性发 作时，病禽表现为消瘦，下痢，鼻炎，关节炎。病程稍长者可见局部关节肿胀， 影响病禽行走。该病广泛分布于世界各地，给养禽业带来了巨大的经济损失。

细菌计数是对细菌进行各方面研究的基础。平板菌落计数法是最常用的方 法。平板菌落计数法的原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下 可以通过生长形成肉眼可见的菌落。可以将菌悬液连续稀释，取一定量的稀释 液进行平板培养，根据培养出的菌落数，推算菌悬液中的活菌数。该方法适用 于样品中的活的可培养的菌数的测定，灵敏度高，对操作者的素质要求较高， 耗费的时间较长。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速测定禽源多杀性巴氏杆菌培养物中细菌总 数的方法。

本发明的目的通过如下技术方案实现：一种快速测定禽源多杀性巴氏杆菌 培养物中细菌总数的方法，它包括以下步骤：

①洗涤液配制：配制适合禽源多杀性巴氏杆菌生长的液体培养基作为洗涤 液，室温保存；

②取样：取一定体积的待测样品；

③样品处理：将样品5000g离心5min，吸出上清，加入与去上清后所剩 的样品等体积的洗涤液，轻轻吹打混匀，再次5000g离心5min，吸出上清， 再加入与去上清后所剩的样品等体积的洗涤液，轻轻吹打混匀；

④检测：利用紫外分光光度计，测定处理后的样品于600nm波长时的OD 值，以步骤①中洗涤液为参比；

⑤计算：当OD值在0.4-1.2的范围内时，样品的含菌数为 (4129.4×OD₆₀₀+509.31)×10⁶CFU/mL，当OD值＜0.4时，将样品适当浓缩后测 定，当OD值＞1.2时，将样品适当稀释后测定，并计算含菌总数。

较之现有技术而言，本发明的优点在于：

1、简单。与平板菌落计数法相比，省去了稀释、培养、人工计数的步骤。

2、快速。与平板菌落计数法相比，省去了细菌培养的时间。禽源杀性巴氏 杆菌在平板上形成肉眼明显可见的菌落约需时16h-18h，该方法仅需30min 即可得出结果。

3、误差小。平板菌落计数法对操作人员的素质要求较高，不同人员操作得 到的数据差异较大，可重复性较差。而该方法利用紫外分光光度计进行读数， 可重复性好。

附图说明

图1是样品OD₆₀₀值与含菌数的线性关系图。

图2是图1中部分样品OD₆₀₀值与含菌数的线性关系图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明内容进行详细说明：

1、洗涤液的选择

常规细菌的洗涤液选择无菌蒸馏水或生理盐水，但禽源多杀性巴氏杆菌在 这两种液体中迅速死亡，所以只能选择适合禽源多杀性巴氏杆菌生长的液体培 养基如马丁肉汤、LB培养基、胰蛋白胨大豆肉汤、脑心浸液肉汤等。本技术方 案的建立选择马丁肉汤。

2、禽源多杀性巴氏杆菌CVCC44801株(购自国家兽医微生物菌种保藏中心)， 划线接种于马丁琼脂平板，37℃培养20h，挑取10个单菌落接种于400mL马 丁肉汤中，于37℃振荡培养箱中，200rpm振荡培养5h。此时还处于多杀性巴 氏杆菌的对数生长期内，培养液中的活菌数即为总菌数。

3、将培养液取出，于2℃-8℃冷水中水浴30min。

4、按表1取样，将样品5000g离心5min，吸出上清，加入等体积无菌马 丁肉汤，轻轻吹打混匀。再次5000g离心5min，吸出上清，加入表中相应终 体积的无菌马丁肉汤，轻轻吹打混匀。以无菌马丁肉汤为参比，测定不同倍数 稀释或浓缩后的样品于600nm波长时的OD₆₀₀值，每个样品测3次，记录其平均 值。

表1培养液的稀释或浓缩

5、无菌取样1mL，以马丁肉汤将其进行10倍连续稀释，取10^-6、10^-7、10^-8稀释度的菌液铺马丁琼脂平板，每个稀释度铺3块平板，每个平板用量为200 μL，37℃温箱中培养后16h-18h，读取平板上的菌落数，同一稀释度的3块 板取平均数，选取菌落数在30-300之间的稀释度即表2中10^-6稀释度，推算出 每毫升培养液的活菌数为1105×10⁶CFU/mL。

表2培养后各平板的菌落数

6、以OD₆₀₀值为横坐标，以含菌数除以10⁶的值为纵坐标，绘制曲线，见图 1，线性相关系数为0.9934。当OD600值在0.402和1.210之间时，线性相关系 数为0.9989，见图2，可信度更高。

7、结论：当OD₆₀₀值在0.402和1.210之间时，样品的含菌数与OD₆₀₀值的线 性相关系数为0.9989，回归方程为y＝4129.4x+509.31，即样品的含菌数为 (4129.4×OD₆₀₀+509.31)×10⁶CFU/mL。当样品的OD₆₀₀值不在0.402和1.210之 间时，为确保含菌数的准确，不能直接利用该公式计算。当样品的OD₆₀₀＜0.4时， 将样品适当浓缩；当样品的OD₆₀₀值＞1.2时，将样品适当稀释，测定后推算含菌 数。

实施例1：

禽源多杀性巴氏杆菌CVCC44801株(购自国家兽医微生物菌种保藏中心)， 划线接种于马丁琼脂平板，37℃培养20h，挑取单个菌落接种于20mL马丁肉 汤中，加50％葡萄糖注射液2mL，37℃培养15h。测定该培养液中含菌数的具 体操作方法如下：

1、取样：分别取4mL培养液加入两个5mL EP管中。

2、样品处理：打开TGL-15B型离心机(上海安亭科学仪器厂)，将两个EP 管对称放入，5000g离心5min，吸出上清，弃去。加入4mL无菌马丁肉汤， 轻轻吹打混匀。5000g离心5min，吸出上清，弃去。加入4mL无菌马丁肉汤， 轻轻吹打混匀。

3、检测：打开UV1600型紫外分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)，调节 波长值为600nm。吸取无菌马丁肉汤3mL于玻璃比色皿中，放入参比位，吸取 处理后的样品3mL于玻璃比色皿中，放入样品位，测得OD₆₀₀值为0.648。

4、计算：OD₆₀₀值位于0.40和1.20之间，直接按公式(4129.4×OD₆₀₀+509.31) ×10⁶CFU/mL计算，得到该培养液的禽源多杀性巴氏杆菌的含量为 3.185×10⁹CFU/mL。

实施例2：

禽源多杀性巴氏杆菌CVCC44801株(购自国家兽医微生物菌种保藏中心)， 划线接种于马丁琼脂平板，37℃培养20h，用8.5％NaCl洗下菌落，制成含菌 混悬液。测定该混悬液中含菌数的具体操作方法如下：

1、取样：分别取4mL混悬液加入两个5mL EP管中。

2、样品处理：打开TGL-15B型离心机(上海安亭科学仪器厂)，将两个EP 管对称放入，5000g离心5min，吸出上清，弃去。加入4mL无菌马丁肉汤， 轻轻吹打混匀。5000g离心5min，吸出上清，弃去。加入4mL无菌马丁肉汤， 轻轻吹打混匀。

3、检测：打开UV1600型紫外分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)，调节 波长值为600nm。吸取无菌马丁肉汤3mL于玻璃比色皿中，放入参比位，吸取 处理后的样品3mL于玻璃比色皿中，放入样品位，测得OD₆₀₀值为1.834。

4、样品再处理及检测：因为OD₆₀₀值＞1.2，再进行处理。吸取无菌马丁肉 汤1.5mL于玻璃比色皿中，再吸取处理后的样品1.5mL于同一玻璃比色皿中 混匀，即2倍稀释，放入样品位，测得OD₆₀₀值为1.016。

5、计算：先按公式(4129.4×OD₆₀₀+509.31)×10⁶CFU/mL计算，得到 4.7×10⁹CFU/mL，再乘以稀释倍数2，即该混悬液的禽源多杀性巴氏杆菌含量为 9.4×10⁹CFU/mL。

实施例3：

禽源多杀性巴氏杆菌CVCC44801株(购自国家兽医微生物菌种保藏中心)， 划线接种于马丁琼脂平板，37℃培养20h，挑取单个菌落接种于20mL马丁肉 汤中，加50％葡萄糖注射液10mL，37℃培养6h。测定该培养液中含菌数的具 体操作方法如下：

1、取样：分别取4mL培养液加入两个5mL EP管中。

2、样品处理：打开TGL-15B型离心机(上海安亭科学仪器厂)，将两个EP 管对称放入，5000g离心5min，吸出上清，弃去。加入4mL无菌马丁肉汤， 轻轻吹打混匀。5000g离心5min，吸出上清，弃去。加入4mL无菌马丁肉汤， 轻轻吹打混匀。

3、检测：打开UV1600型紫外分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)，调节 波长值为600nm。吸取无菌马丁肉汤3mL于玻璃比色皿中，放入参比位，吸取 处理后的样品3mL于玻璃比色皿中，放入样品位，测得OD₆₀₀值为0.103。

4、样品再处理及检测：因为OD₆₀₀值＜0.4，再进行处理。分别取4mL培养 液加入8个5mL>600值为0.983。

5、计算：先按公式(4129.4×OD₆₀₀+509.31)×10⁶CFU/mL计算，得到 4.6×10⁹CFU/mL，再除以浓缩倍数10，即该混悬液的禽源多杀性巴氏杆菌含量 为4.6×10⁸CFU/mL。