与结直肠炎恶性转变相关的miRNA标志物和试剂盒

摘要

本发明属于生物技术和医学技术领域，提供了一种与结直肠炎恶性转变相关的miRNA标志物，该标志物为miR-138-5p、miR-145-5p、miR-146a-5p和miR-150-5p的组合。还提供了一种上述miRNA标志物的引物。还提供了一种上述miRNA标志物在制备直肠癌早期诊断试剂盒中的应用。还提供了一种直肠癌早期诊断试剂盒。本发明提供的与结直肠炎恶性转变相关的miRNA标志物miR-138-5p、miR-145-5p、miR-146a-5p、miR-150-5p对结直肠癌进行早期筛查具有操作简单、高特异性、高灵敏性的特点。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和医学技术领域，特别涉及一种与结直肠炎 恶性转变相关的miRNA标志物对直肠癌早期筛查的应用。

背景技术

结直肠癌是第三常见的恶性疾病和癌症致死的第二主要原因。就 如其他恶性疾病一样，基因因素是导致结直肠癌形成的重要原因，但 是，只有20％的结直肠癌病例可以追溯到家族性基因变异。事实上， 大部分的散发性结直肠癌和环境因素密切相关，最常见的抑癌基因 APC的突变导致了Apc/GSK3β/Axin复合物的破坏，从而激活了 Wnt/β-catenin信号转导通路。Wnt/β-catenin信号转导通路的异常激活 不仅促进小肠上皮细胞的增殖，也抑制了其向腺窝底部的迁移和凋 亡。典型的“结直肠癌发生的基因途径”已经被充分的研究，环境因素 导致结直肠癌发生的最新机制和慢性炎症有关，称为肠炎相关性结直 肠癌(CAC)。近几年来随着中国人的饮食和生活方式的改变，结直 肠癌的发生率迅速增高，而且大部分的结直肠癌病例和慢性肠炎相 关。临床上已经发现，肠炎相关性结直肠癌往往伴随着慢性肠炎疾病， 例如克罗恩病，溃疡性肠炎。流行病学和临床研究表明，在伴随慢性 肠炎30年后，溃疡性肠炎增加了18-20％的肠炎相关性结直肠癌的发病 率，而克罗恩病增加了8％的发病率。在小鼠模型中，注射致癌物 azoxymethane(AOM)和慢性肠炎诱导物DSS会导致多发的肠肿瘤，但 是如果没有炎症的存在，则需要注射多倍剂量的AOM并需要更长时 间才能导致肿瘤的形成。这些临床和实验结果表明，CAC是典型的炎 症致癌。但是，不像Apc/Wnt/β-catenin信号转导通路，肠炎相关的结 肠直肠癌的发病机制，特别是肠炎恶性转变的机制尚不清楚，主要是 因为缺少动态研究的合适模型。小肠上皮组织的杯状细胞能够分泌一 层黏液蛋白，这层黏液蛋白能够保护上皮组织免受机械的和化学的损 伤，以及炎症因素的损害。这种黏液蛋白主要是由Muc2基因所编码。 已有研究表明，杯状细胞的减少和Muc2的表达降低在溃疡性肠炎和 结直肠癌中非常常见。MUC2对于维持肠道稳态非常重要，将小鼠的 Muc2基因敲除后，肠上皮细胞的增殖、迁移和凋亡都发生了改变， 最重要的是，Muc2敲除小鼠能够自发地导致小肠、大肠和直肠肿瘤 的发生。而研究发现肿瘤的发生与慢性炎症相关，与Wnt/β-catenin信 号通路无关。Muc2敲除引起的炎症促进了Apc突变小鼠的肿瘤发生， 而且在Muc2敲除小鼠中，周期依赖性激酶抑制物p21WAF1的表达降 低促进了肿瘤的形成。我们更深入的研究发现，Muc2敲除小鼠在出 生后3个月以内会自发形成慢性肠炎，其组织病理特点与人的溃疡性 肠炎类似。在3个月之后，Muc2-/-小鼠会形成结肠和直肠肿瘤。因 此，3个月可能是慢性肠炎发展为结直肠癌的关键时间点。所以 Muc2-/-小鼠可以作为一种动态研究慢性肠炎恶性转变形成结直肠 癌的理想模型。为了揭示肠炎恶性转变的分子机制，我们分离了 Muc2-/-小鼠的肠上皮细胞来做miRNA，我们在肠炎恶性转变的关键 时间点发现了一些异常表达的miRNA。我们在人的肠炎和结直肠癌组 织中对上述的一些miRNA做了验证，有趣的是，这些表达降低的 miRNA在小鼠组织中同样表达降低，并且和一些细胞因子的表达增高 相关，这些发现预示着表观改变可能在肠炎恶性转变中起着重要的作 用。

发明内容

针对现有技术不足，本发明的目的是提供一种与结直肠炎恶性转 变相关的miRNA标志物和试剂盒。

为实现上述目的，本发明提供一种与结直肠炎恶性转变相关的 miRNA标志物，该标志物为miR-138-5p、miR-145-5p、miR-146a-5p 和miR-150-5p的组合。以上四种miRNA在Muc2-/-小鼠模型的慢性肠 炎恶性转变过程中表达明显降低，在人肠炎组织及结直肠癌组织中表 达也明显降低，说明其与慢性肠炎恶性转变密切相关。

本发明还提供一种上述miRNA标志物的引物，该引物为：

miR-138-5p的正向引物序列为：5’-TGGAGCTGGTGTTGTGAA TC-3’，如SEQ ID NO：1所示；

miR-145-5p的正向引物序列为：5’-GGGTCCAGTTTTCCCAGGA -3’，如SEQ ID NO：2所示；

miR-146a-5p的正向引物序列为：5’-TTCGGTGAGAACTGAAT TCCA-3’，如SEQ ID NO：3所示；

miR-150-5p的正向引物序列为：5’-CCGGGTCTCCCAACCCT TGTA-3’，如SEQ ID NO：4所示；

通用反向引物序列为：5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’，如 SEQ ID NO：5所示。

本发明还提供一种上述miRNA标志物在制备直肠癌早期诊断试 剂盒中的应用。具体地，通过检测被试者结直肠组织中的四种miRNA 的含量，并与正常水平相比较来对患者的病情发展做出预判，以此来 指导临床治疗。在一个特定的实施方案中，使用定量PCR的方法来检 测被试者结直肠组织中的四种miRNA含量。

优选的，上述miRNA标志物的引物在制备直肠癌早期诊断试剂盒 中的应用。

本发明还提供一种直肠癌早期诊断试剂盒，试剂盒含有上述 miRNA标志物的引物。

优选的，该试剂盒还包括PCR反应常用的酶和试剂。

优选的，该试剂盒包括组织总RNA提取试剂、总RNA加poly(A) 试剂、RT-PCR试剂、定量PCR试剂。

优选的，所述RT-PCR试剂中包括RT-引物：

hsa-miR-138：5’-GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGG GCAATTTTTTTTTTTCGGCCT-3’；

hsa-miR-145：5’-GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGG GCAATTTTTTTTTTTAGGGAT-3’；

hsa-miR-146a：5’-GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGG GCAATTTTTTTTTTTAACCCA-3’；

hsa-miR-150：5’-GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGG GCAATTTTTTTTTTTCACTGG-3’；

内参SNORD44：5’-GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTG GGCAATTTTTTTTTTTagtcag-3’；

所述定量PCR试剂中包括序列：

通用反向引物：5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’；

通用Taqman探针:56-FAM/CAGAGCCAC/ZEN/CTGGGCAAT TT/3IABkFQ。

本发明的有益效果：

本发明提供的与结直肠炎恶性转变相关的miRNA标志物 miR-138-5p、miR-145-5p、miR-146a-5p、miR-150-5p对结直肠癌进行 早期筛查具有操作简单、高特异性、高灵敏性的特点。

附图说明

图1Muc2-/-小鼠肠上皮miRNA array聚类分析结果；

图2Muc2+/+和Muc2-/-小鼠的肠上皮细胞因子表达水平；

图3在Muc2+/+和Muc2-/-小鼠的肠上皮细胞中验证差异表达的 miRNA；

图4miR-138-5p在16对结肠癌组织中的表达水平；

图5miR-145-5p在16对结肠癌组织中的表达水平；

图6miR-146a-5p在16对结肠癌组织中的表达水平；

图7miR-150-5p在16对结肠癌组织中的表达水平；

图8miR-138-5p在6对结肠炎组织中的表达水平；

图9miR-145-5p在6对结肠炎组织中的表达水平；

图10miR-146a-5p在6对结肠炎组织中的表达水平；

图11miR-150-5p在6对结肠炎组织中的表达水平。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1结肠炎相关的癌模型Muc2基因敲除小鼠结肠上皮细胞中 miRNA表达谱

小鼠的肠上皮细胞的收集：选择3月龄的Muc2+/+和Muc2-/-，每 组包括四只小鼠，将小鼠处死，取结肠洗净，纵向剖开，各取一段置 于20ml冰PBS；将组织移入37℃15mM EDTA30ml中；37℃振荡， 220rpm，30min，充分振荡，去除肠组织；4℃离心5000rpm，5min； 先弃去上清，5ml冷PBS重悬细胞，分装于1.5mlEP管中；4℃离心， 3000rpm，5min；弃去上清，EP管开盖置于液氮中；取出后开盖置于 -80℃过夜，次日将EP管盖上。

总RNA的提取：按照操作手册用Trizol试剂(Invitrogen，Carlsbad， CA)提取总RNA。

miRNA array(表达谱)：实验操作由芝加哥大学基因研究所实施。

聚类分析结果如图1所示：21个miRNA下调，70个miRNA上调 (change fold>2or<0.5；T<0.01,p value<0.05,q value<0.05)。

实施例2Muc2小鼠结肠上皮细胞中细胞因子的表达、差异表达 miRNA的验证

小鼠结肠上皮细胞RNA提取与实施例1中方法相同；

利用qRT-PCR检测细胞因子mRNA表达水平，反应体系：正向引 物(20μm)0.15μl，反向引物(20μm)0.15μl，cDNA0.7μl，H₂O9μl， 荧光染料SYBR>

细胞因子mRNA表达水平如图2所示：与对照相比，Muc2-/-小鼠 的结肠上皮细胞中几种细胞因子IL-6、COX-2、IL-10、TNFα、IL-1 β表达水平明显上升。

IL-6：

正向引物：TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC，

反向引物：TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC；

COX-2：

正向引物：TGAGCAACTATTCCAAACCAGC，

反向引物：GCACGTAGTCTTCGATCACTATC；

IL-10：

正向引物：GCTCTTACTGACTGGCATGAG，

反向引物：CGCAGCTCTAGGAGCATGTG；

IL-1β：

正向引物：GCAACTGTTCCTGAACTCAACT，

反向引物：ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT；

TNFα：

正向引物：CCCTCACACTCAGATCATCTTCT，

反向引物：GCTACGACGTGGGCTACAG；

IKKβ：

正向引物：CTGAAGATCGCCTGTAGCAAA，

反向引物：TCCATCTGTAACCAGCTCCAG；

GAPDH：

正向引物：TCTGGAAAGCTGTGGCGTGAT，

反向引物：GCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG。

为了验证小鼠miRNA array的结果，选择15个miRNA利用荧光定 量PCR技术来验证，如图3所示：mmu-miR-146a、mmu-miR-138、 mmu-miR-5123、mmu-miR-196b、mmu-miR-5099、mmu-miR-150、 mmu-miR-145、mmu-miR-27a、mmu-miR-23a表达下调；mmu-miR-705、 mmu-miR-760-3p、mmu-miR-1962、mmu-miR-669c、 mmu-miR-3104-5p、mmu-miR-5132表达上调，荧光定量PCR的结果与 miRNA array的结果一致。

mmu-miR-146a-5p逆转录引物：GTGCAGGGTCCGAGGTCAGA GCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTAACCCA；

定量正向引物：TTCGGTGAGAACTGAATTCCA；

mmu-miR-138-5p逆转录引物：GTGCAGGGTCCGAGGTCAGA GCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCGGCCT；

定量正向引物：TGGAGCTGGTGTTGTGAATC；

mmu-miR-5123逆转录引物：GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGC CACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCACACC；

定量正向引物：TGGTGTAGATCCATATGCCAT；

mmu-miR-196b-5p逆转录引物：GTGCAGGGTCCGAGGTCAGA GCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCCCAAC；

定量正向引物：TTCGGTAGGTAGTTTCCTGTT；

mmu-miR-5099逆转录引物：GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGC CACCTGGGCAATTTTTTTTTTTGGAGCA；

定量正向引物：TGTCGGTTAGATCGATGTGG；

mmu-miR-150-5p逆转录引物：GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAG CCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCACTGG；

定量正向引物：CGGTCTCCCAACCCTTGTA；

mmu-miR-145a-5p逆转录引物：GTGCAGGGTCCGAGGTCAGA GCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTAGGGAT；

定量正向引物：GGGTCCAGTTTTCCCAGGA；

mmu-miR-27a-3p逆转录引物：GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAG CCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTGCGGAA；

定量正向引物：TTCGGTTCACAGTGGCTAAG；

mmu-miR-23a-3p逆转录引物：GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAG CCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTGGAAAT；

定量正向引物：TCGGATCACATTGCCAGGG；

mmu-miR-705逆转录引物：GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCC ACCTGGGCAATTTTTTTTTTTGCCCAC；

定量正向引物：TGGGGTGGGAGGTGGGG；

mmu-miR-760-3p逆转录引物：GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAG CCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCCCCAC；

定量正向引物：CGGCGGCTCTGGGTCTG；

mmu-miR-1962逆转录引物：GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGC CACCTGGGCAATTTTTTTTTTTATGTGT；

定量正向引物：TGAGAGGCTGGCACTGGG；

mmu-miR-669c-5p逆转录引物：GTGCAGGGTCCGAGGTCAGA GCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTACACAC；

定量正向引物：TTCGGATAGTTGTGTGTGGAT；

mmu-miR-3104-5p逆转录引物：GTGCAGGGTCCGAGGTCAGA GCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTAGAGGG；

定量正向引物：TAGGGGGCAGGAGCCGGAG；

mmu-miR-5132-5p逆转录引物：GTGCAGGGTCCGAGGTCAGA GCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCCTGAG；

定量正向引物：GGGCGTGGGGTGGTGGA；

内参snoRNA202逆转录引物：GTGCAGGGTCCGAGGTCAGA GCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCATCAG；

定量正向引物：GTACTTTTGAACCCTTTTCCAT；

定量通用反向引物：CAGTGCAGGGTCCGAGGT；

定量通用Taqman探针：56-FAM/CAGAGCCAC/ZEN/CTGGGCA ATTT/3IABkFQ。

实施例3人结肠癌组织标本收集

16对结直肠癌组织、6对结肠肠炎组织及其配对正常组织皆从新 乡医学院第一附属医院和新乡医学院附属中心医院收集，标本储存于 -80℃环境中。

实施例4RNA提取

按照操作手册步骤用Trizol试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)提取冰 冻的结肠癌及其邻近正常结肠组织的RNA。用A-Plus^TM>

实施例5通过qRT-PCR对四个miRNA表达水平进行检测

为了检测来自结肠癌模型鼠中差异表达的miRNA是否有临床意 义，我们选择了四个miRNA：即miR-138、miR-145、miR-146a、mi R-150，在临床病人标本中进行验证。

使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo SCIE NTIFIC，USA)按操作手册对加poly(A)的miRNA进行逆转录。

使用实时荧光定量PCR(Applied Biosystem Inc.)对miRNA进行定 量分析。定量的反应体系：GoTaq Hot Start Colorless Master Mix10μl， 上游引物0.4μl，下游引物0.4μl，probe0.5μl，diluted cDNA2μl， RNase-free water6.7μl。反应条件：95℃2min；变性95℃10s，退火 /延伸60℃30s，共40个循环。

所使用的引物如下：

hsa-miR-138逆转录引物：GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCA CCTGGGCAATTTTTTTTTTTCGGCCT；hsa-miR-138定量正向引物： TGGAGCTGGTGTTGTGAATC。

hsa-miR-145逆转录引物：GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCA CCTGGGCAATTTTTTTTTTTAGGGAT；hsa-miR-145定量正向引物： GGGTCCAGTTTTCCCAGGA。

hsa-miR-146a逆转录引物：GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCC ACCTGGGCAATTTTTTTTTTTAACCCA；hsa-miR-146a定量正向引 物：TTCGGTGAGAACTGAATTCCA

hsa-miR-150逆转录引物：GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCA CCTGGGCAATTTTTTTTTTTCACTGG；hsa-miR-150定量正向引物： CCGGGTCTCCCAACCCTTGTA

内参SNORD44逆转录引物：GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGC CACCTGGGCAATTTTTTTTTTTagtcag；内参SNORD44定量正向引 物：TGGCCTGGATGATGATAAGCA。

定量通用反向引物：CAGTGCAGGGTCCGAGGT；

定量通用Taqman探针:56-FAM/CAGAGCCAC/ZEN/CTGGGC AATTT/3IABkFQ。

结肠癌组织与癌旁正常组织中4个miRNA的表达结果如图4-7所 示：与正常组织相比，16个癌组织中miR-138、miR-145、miR-146a、 miR-150的总体表达水平分别减少了3.37、3.39、2.56、4.99倍(P <0.001)。16个癌组织中miR-138和miR-150的表达都是降低的，15个 癌组织中miR-145和miR-146a的表达是降低的。

结肠炎组织与正常结肠组织中4个miRNA的差异表达结果如图 8-11所示：这4个miRNAs在人的结肠炎组织中的表达也是下调的，因 此，这几个miRNA可能参与结肠炎的恶性转化。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发 明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神 的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。