恶性黑素瘤中调控hTERT基因相关miRNAs的筛选与功能研究

摘要

目的：检测hTERT mRNA及其蛋白在恶性黑素瘤及色素痣石蜡包埋组织中的表达，分析hTERT mRNA表达与恶性黑素瘤临床病理特征及其蛋白之间的关系；预测并筛选恶性黑素瘤中调控hTERT基因的相关miRNAs ，分析候选miRNAs与hTERT mRNA表达之间的关系；通过细胞功能学实验探索过表达或抑制相关miRNAs表达后对hTERT mRNA及其蛋白表达的影响；采用双荧光素酶报告基因实验分析相关miRNAs与hTERT基因的靶向调控机制。方法：采用qPCR及免疫组化检测hTERT mRNA及其蛋白在恶性黑素瘤及色素痣石蜡包埋组织中的表达；通过TargetScan在线软件预测hTERT基因调控相关的miRNAs，按照筛选标准筛选出候选miRNAs；采用定制的miRNA PCR Array检测候选miRNAs在恶性黑素瘤和色素痣石蜡包埋组织中的表达情况，筛选出相关差异表达的miRNAs；合成相关差异miRNAs的类似物和抑制物，转染到人恶性黑素瘤A 375细胞中，通过MTT法、流式细胞术、划痕实验和Transwells方法检测转染前后人恶性黑素瘤A375细胞的增殖、周期、凋亡、迁移和侵袭能力等生物学行为的变化，同时采用qPCR及western-blot技术检测转染前后hTERT mRNA及其蛋白的变化水平；采用双荧光素酶报告基因实验探索相关差异miRNAs靶向调控hTERT基因的机制。结果：恶性黑素瘤组织中hTERT mRNA及其蛋白的表达均高于色素痣，发生远处转移者hTERT mRNA表达明显高于未发生者，且hTERT mRNA的表达与hTERT蛋白的表达呈正相关关系。经预测和筛选，共筛选出14个候选miRNAs，经定制的miRNA PCR Array检测发现5个差异表达的miRNAs：miR-497-5p、miR-195-5p和miR-455-3p表达明显下调，而miR-212-5p和miR-424-5p表达明显上调；且miR-497-5p、miR-195-5p和miR-455-3p的表达与hTERT mRNA及其蛋白的表达呈负相关。细胞功能学实验结果表明：过表达miR-497-5p、miR-195-5p和miR-455-3p均能够显著抑制人恶性黑素瘤A375细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并阻滞细胞周期、促进细胞凋亡；而抑制miR-497-5p、miR-195-5p和miR-455-3p的表达后均能够逆转过表达的效应。同时，过表达miR-497-5p、miR-195-5p和miR-455-3p后hTERT mRNA及其蛋白表达均明显减少。双荧光素酶报告基因实验结果显示，miR-497-5p、miR-195-5p和miR-455-3p通过与hTERT基因3’UTR区直接结合参与调控恶性黑素瘤的发生和发展。结论：在人恶性黑素瘤中，miR-497-5p、miR-195-5p和miR-455-3p通过直接靶向作用于hTERT 3’UTR区发挥抑癌基因样作用，有望成为恶性黑素瘤靶向治疗的新选择。

目录

声明

中英文缩略词对照表

前言

第一部分 hTERT在黑素瘤中的表达

1 研究内容与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

第二部分 调控hTERT基因相关miRNAs的预测、筛选、表达及其与hTERT表达的相关性分析

1 研究内容与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

第三部分 miR-497-5p、miR-195-5p和miR-455-3p在黑素瘤A375细胞中靶向调控hTERT的机制研究

1 研究内容与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

结论

本研究的创新之处：

本研究中存在的主要不足之处：

致谢

参考文献

综述:人端粒酶逆转录酶基因的调控机制研究进展

攻读博士学位期间获得的学术成果

个人简历

导师评阅表