抗原嵌合体、抗原组合物、疫苗及其制备方法和试剂盒

摘要

本发明提供了一种抗原嵌合体，包括：抗原与能形成多聚体的黏膜免疫佐剂蛋白质单体的融合蛋白，和所述能形成多聚体的黏膜免疫佐剂蛋白质单体，其中，所述能形成多聚体的黏膜免疫佐剂蛋白质单体选自霍乱毒素B亚单位(CTB)和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)中的一种，所述多聚体为五聚体，而且在所述嵌合体中所述融合蛋白与所述能形成多聚体的黏膜免疫佐剂蛋白质单体的摩尔比为1:4。本发明利用黏膜免疫佐剂蛋白质能形成五聚体的特性，形成嵌合结构，从而形成效价更高的抗原。同时，利用黏膜免疫佐剂蛋白质增强免疫的作用，起到增强抗原免疫原性的效果。另外，本发明的重组抗原构成的嵌合蛋白抗原刺激黏膜产生分泌型IgA，诱导黏膜免疫产生。

说明书

技术领域

本申请涉及免疫领域，特别是用于黏膜免疫的抗原、疫苗及其制备方法和试剂盒。

背景技术

黏膜免疫系统是广泛分布于呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道黏膜下及一些外分泌腺 处的淋巴组织，是执行局部特异性免疫功能的主要场所。

由于95％以上的机体相关感染发生在黏膜部位或经由黏膜入侵机体，因此黏膜是 病原体侵入体内的最大门户。当前对动物生命与健康危害极大的以及难以防治的重要 传染病，如流感、结核、鼻疽、沙门氏菌病等都属于由黏膜入侵或与黏膜相关的疾病， 且由此引起的黏膜损伤及黏膜免疫功能的紊乱，常常成为机会性病原菌感染，甚至肿 瘤发生的重要机制。

黏膜免疫系统是机体抵抗病原体入侵的第一道免疫屏障，具有独特结构和功能的 独立免疫体系，对于防治病原体的定植和侵入有着积极的意义。有别于传统的系统免 疫系统，黏膜免疫系统是大量免疫细胞和免疫分子弥散在黏膜上皮内或黏膜下固有层 (弥散淋巴组织)，或由单个或多个淋巴滤泡聚集成的黏膜相关淋巴组织，机体50％ 以上的淋巴组织和80％以上的免疫细胞集中于黏膜免疫系统。并且黏膜分泌物中的抗 体以分泌型IgA和sIgM抗体为主。黏膜免疫系统按功能不同可分为两个部位：诱导 部位和效应部位。在诱导部位和效应部位间，主要通过淋巴细胞归巢发生联系。黏膜 免疫系统主要功能是对黏膜表面吸入或摄入的大量种类繁多的抗原进行识别并做出反 应。既可对大量无害抗原下调免疫反应或产生耐受，也可对有害抗原或病原体产生高 效体液和细胞免疫，进行有效免疫排斥或清除。

黏膜免疫理论上是预防经黏膜感染产生致病作用病原体最为有效的免疫途径，因 为通过其它途径免疫时，疫苗难以诱导产生明显的黏膜免疫反应。然而，迄今为止已 获批准或正在临床研究中的疫苗，绝大多数却仍旧采用的是注射途径免疫，仅有少数 为黏膜途径免疫。究其原因，困扰黏膜免疫疫苗产品开发的主要困难除了局部黏膜免 疫特异性抗体检测的困难外，更为重要的是因为机体的宿主防御作用，黏膜免疫无法 如注射途径免疫时能准确的控制进入机体的抗原水平。抗原通过口服或者局部给药达 到黏膜表面后，将经历黏膜分泌液稀释、粘液凝胶吸附、蛋白酶/核酸酶水解以及被内 膜屏障清除，因此只有极少数的抗原能通过黏膜进入体内，发挥有效的黏膜免疫反应。 一般，水溶性以及无黏膜作用的抗原黏膜摄取率低，并且部分可能会在肠内产生免疫 耐受现象。解决黏膜免疫摄取率低最为有效的方法是通过对天然黏膜病原体的特征模 拟，以及应用有效的黏膜佐剂，增强与机体黏膜表面结合水平(最好能选择性的粘附 于M细胞)。目前仍然需要更为有效的黏膜免疫疫苗。

发明内容

为了增强用于黏膜免疫抗原的免疫原性，本发明提供了一种抗原嵌合体，其包括： 抗原与能形成多聚体的黏膜免疫佐剂蛋白质单体的融合蛋白，和所述能形成多聚体的 黏膜免疫佐剂蛋白质单体，其中，所述能形成多聚体的黏膜免疫佐剂蛋白质单体选自 霍乱毒素B亚单位(CTB)和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)中的一种，所 述多聚体为五聚体，并且在所述嵌合体中所述融合蛋白与所述能形成多聚体的黏膜免 疫佐剂蛋白质单体的摩尔比为1:4，其中所述抗原嵌合体稳定存在的PH大于7.0，优 选pH为8.0。CTB和LTB都是非常有效的黏膜免疫佐剂，而且都能够形成稳定的五 聚体，利用这一性质制备的抗原嵌合体，不但可保持其黏膜免疫佐剂性质，还增大了 抗原体积，易于被抗原递呈细胞(antigen presenting cell，APC)摄取，有利于进一步 促进黏膜免疫和系统免疫的激发。并且，嵌合体的稳定性与其pH值密切相关，在本 发明中，所述嵌合体稳定存在的PH大于7.0，优选pH为8.0。而此条件下的嵌合体， 特别是CTB形成五聚体的嵌合体，能够最有效地增强黏膜免疫效果。

在本发明一个实施方式中，所述的抗原嵌合体中的CTB和LTB为其天然组成结 构或其能够形成五聚体的突变体。与真核表达时发生糖基化修饰的CTB和LTB相比， 通过原核表达载体表达的具有天然结构的CTB和LTB及其突变体能够更加有效地激 发抗原的免疫反应，发挥其佐剂的功能。

在本发明一个实施方式中，所述抗原嵌合体中所述抗原的分子量在10至100kD 范围内，优选16kD至65kD。在10-100kD范围内的抗原能够更好地保证CTB或LTB 折叠成正确的构象，以易于形成稳定的五聚体。抗原分子量过小可能会受CTB或LTB 影响，促使融合蛋白其自身形成聚体，从而不能正确折叠，分子量过大则可能产生位 阻效应，阻碍CTB或LTB五聚体的形成。

在本发明的实施方式中，所述抗原为适用于黏膜免疫的抗原。特别是经由黏膜途 径感染人体或动物体的病原菌的抗原，包括但不限于幽门螺杆菌抗原、伤寒抗原、流 感HA抗原。

在本发明的一个优选实施方式中，所述幽门螺杆菌抗原选自幽门螺杆菌尿素酶B 亚单位(UreB)、幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A(CagA)蛋白和幽门螺杆菌中性粒 细胞激活蛋白(NAP)中的至少一种。这些抗原具较强的免疫原性，无毒性，是良好 的疫苗候选抗原。

在本发明的实施方式中，所述融合蛋白包含位于所述抗原与所述黏膜免疫佐剂蛋 白质单体之间的3个G4S(Gly-Ser-Ser-Ser-Ser)连接体。此柔性连接体的加入可以避 免抗原蛋白质与CTB或LTB在复性折叠时的相互影响，有助于形成正确的构象。

本发明还提供了一种抗原组合物，包含如上所述的抗原嵌合体，其中所述抗原嵌 合体稳定存在的PH大于7.0，优选pH为8.0。

本发明还提供了一种疫苗，包含上述抗原组合物和适用于疫苗的赋形剂。优选地， 所述疫苗为口服疫苗、经鼻给药的疫苗或经直肠给药的疫苗。

本发明还提供了一种用于制备抗原组合物的试剂盒，包括表达上述融合蛋白的载 体和表达上述能形成多聚体的黏膜免疫佐剂蛋白质单体的载体。优选地，其中所述载 体均为原核表达载体。

本发明还提供了制备上述抗原嵌合体的方法，包括用上述试剂盒中的载体分别表 达所述融合蛋白和所述能形成多聚体的黏膜免疫佐剂蛋白质单体，然后通过复性方法 使这两种蛋白结合形成所述嵌合体，其中所述复性方法包括将所述两种蛋白共同放置 在含有尿素和DTT(或巯基乙醇)的复性液中进行复性的步骤。优选所述复性液中尿 素的浓度为1.0M至2.5M。所述DTT或巯基乙醇的浓度为0.2mM至1.0mM。

本发明还提供了一种通过复性制备嵌合体的方法，所述嵌合体包含(1)一种蛋白 质与能形成多聚体的单体蛋白质的融合蛋白和(2)能形成多聚体的单体蛋白质，通过 所述(1)融合蛋白中的单体蛋白质和所述(2)单体蛋白质形成多聚体来形成嵌合体， 所述方法包括：

将所述(2)能形成多聚体的单体蛋白质在含6M至9M，优选8M的尿素，且pH 为3.0至4.0的缓冲液中预复性0.5至3小时，优选预复性1小时；和

将所述(1)融合蛋白和所述(2)能形成多聚体的单体蛋白质在含有1.0M至2.5M 的尿素和0.2mM至1.0mM的DTT或巯基乙醇的复性液中复性形成所述嵌合体，

优选地，所述复性液的pH大于7.0，更优选所述复性液的pH为8.0。

在本发明中，我们选择在复性液中保持一定浓度的尿素和DTT(或巯基乙醇)， 能够有效避免形成多聚体的单体其自身聚集成为五聚体，并且在一定pH条件下，能 够促进嵌合体的形成，提高嵌合体组装的效率，有效克服了采用常规复性处理导致嵌 合体组装效率较低的缺陷。该复性方法可用于形成需要形成蛋白质嵌合体的多个领域， 并不限于此处所述的疫苗领域。

附图说明

图1为电脑模拟的霍乱毒素(CT)立体结构图；

图2为电脑模拟的CTB五聚体立体结构图；

图3为电脑模拟的CTB-UreB融合蛋白立体结构图；

图4为电脑模拟的CTB-UreB/4CTB嵌合体蛋白的立体结构图；

图5为根据本发明的实施方式制备的PET-28a-CTB-X质粒双酶切电泳图，其 中各个泳道的样品如下：M：DL10000DNA Marker；泳道1,2,3：PET-28a-CTB-UreB 双酶切；泳道4,5,6：PET-28a-CTB-CagA双酶切；泳道7：PET-28a-CTB-NAP双 酶切；

图6为根据本发明的实施方式制备的CTB-UreB融合蛋白的蛋白质电泳图， 其中各个泳道的样品如下：M:Fermentas蛋白预染Marker；泳道1,2,3,4,5,6,7：IPTG 诱导后PET-28a-CTB-UreB/BL21-DE3菌体；

图7为根据本发明的实施方式制备的CTB-CagA和CTB-NAP融合蛋白的蛋白 电泳图，其中各个泳道的样品如下：M：Fermentas蛋白预染Marker；泳道1,2,3,4： IPTG诱导后含PET-28a-CTB-CagA/BL21-DE3菌体；泳道5,6,7,8：IPTG诱导后含 PET-28a-CTB-NAP/BL21-DE3菌体；

图8为根据本发明的实施方式制备的ＣＴＢ－ＵｒｅＢ融合蛋白纯化电泳图，其中各 个泳道的样品如下：Ｍ：Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ蛋白预染Marker；泳道1:SP HP峰前样品；泳道 2,3:SP HP洗脱峰样品；泳道4：SP HP峰后样品；

图9A为根据本发明的实施方式制备的ＣＴＢ－ＵｒｅＢ/4ＣＴＢ嵌合体蛋白纯化电泳 图，其中各个泳道的样品如下：M：Fermentas蛋白预染Marker；泳道1,2,3,4：QHP 洗脱峰；

图9B为根据本发明的实施方式制备的ＣＴＢ－ＵｒｅＢ/4ＣＴＢ嵌合体蛋白稳定性研究 结果的电泳图，其中各个泳道的样品如下：M:Fermentas蛋白预染；泳道1-7样品 分别为pH9.0、8.0、7.0、6.0、5.0、4.0、3.0条件下处理后的样品电泳结果。

图10为根据本发明的实施方式制备的CTB-CagA融合蛋白纯化电泳图，其中 各个泳道的样品如下：M:Fermentas蛋白预染Marker；泳道1,2,3,4：QHP洗脱峰；

图11A为根据本发明的实施方式制备的CTB-CagA/4CTB嵌合体蛋白纯化电 泳图，其中各个泳道的样品如下：M:Fermentas蛋白预染Marker；泳道1,2,3：SP HP 洗脱峰；

图11B为根据本发明的实施方式制备的CTB-CagA/4CTB嵌合体蛋白稳定性 研究结果的电泳图，其中各个泳道的样品如下：M:Fermentas蛋白预染；泳道1-7 样品分别为pH9.0、8.0、7.0、6.0、5.0、4.0、3.0条件下处理后的样品电泳结果；

图12为根据本发明的实施方式制备的CTB-NAP融合蛋白纯化电泳图，其中 各个泳道的样品如下：M:Fermentas蛋白预染Marker；泳道1：　包涵体(8Ｍ尿 素)；泳道2，3，4：　ＱＨＰ洗脱峰；

图13为根据本发明的实施方式制备的CTB-NAP/4CTB嵌合体蛋白纯化电泳 图，其中各个泳道的样品如下：M:Fermentas蛋白预染Marker；泳道1,2,3：QHP 洗脱峰；

图14为根据本发明的实施方式CTB-UreB/4CTB嵌合体蛋白免疫小鼠血清特 异性IgG检测结果；

图15为根据本发明的实施方式CTB-UreB/4CTB嵌合体蛋白免疫小鼠肠黏膜 特异性sIgA检测结果；

图16为根据本发明的实施方式CTB-CagA/4CTB嵌合体蛋白免疫小鼠肠黏膜 特异性IgG检测结果；

图17为根据本发明的实施方式CTB-CagA/4CTB嵌合体蛋白免疫小鼠肠黏膜 特异性sIgA检测结果；

图18为根据本发明的实施方式CTB-NAP/4CTB嵌合体蛋白免疫小鼠血清特 异性IgG检测结果；

图19为根据本发明的实施方式CTB-NAP/4CTB嵌合体蛋白免疫小鼠肠黏膜 特异性sIgA检测结果；

图20为根据本发明的实施方式CTB-UreB/4CTB嵌合体蛋白免疫小鼠，用 HPSS1攻击后其特异性血清IgG抗体检测结果图；

图21为根据本发明的实施方式CTB-UreB/4CTB嵌合体蛋白免疫小鼠，用 HPSS1攻击后其特异性肠黏膜sIgA抗体检测结果图；

图22为根据本发明的实施方式CTB-UreB/4CTB嵌合体蛋白免疫小鼠，用 HPSS1攻击后胃组织病理切片检测结果。其中A:CTB-UreB/4CTB嵌合体蛋白组 小鼠胃组织切片(×250)；B:UreB组小鼠胃组织切片(×250)；C:UreB组小鼠 胃组织切片(×400)-；

图23A和23B分别为UreB-CTA₂/5CTB与CTB-UreB/4CTB组装效率比较结 果的电泳图，泳道1为对比例1的实验结果，泳道2为根据本发明的实施例的实 验结果。

具体实施方式

为了更加清楚地阐述本发明，下文将详细地说明本发明的各个优选的实施方 式，以及各个实施方式的技术效果。

本发明主要提供了增强免疫原性的抗原及其制备方法。一方面，其通过利用 黏膜免疫佐剂加强免疫反应；另一方面，利用CTB或LTB形成五聚体的特点，提 高黏膜免疫佐剂效果的同时，增大了抗原的体积，易于被APC摄取，更加有利于 免疫应答的发生。另外，本发明的发明人选择在复性液中保持一定浓度的尿素和 DTT(或尿素和巯基乙醇)，能够有效避免形成多聚体的单体其自身聚集成为五聚 体，从而促进嵌合体的形成，提高嵌合体组装的效率。有效克服了采用常规复性 处理导致嵌合体组装效率较低的缺陷。

下面从免疫佐剂的选择、抗原的选择和复性方法等几个方面更加详细地说明 本发明的技术方案。

关于免疫佐剂

为了增强抗原的免疫原性，本发明选用了CTB或LTB分别与抗原结合形成 新的抗原组合物。

霍乱毒素是一种强有力的黏膜免疫佐剂，由1个A亚单位和5个B亚单位(见 图1)组成。5个B亚单位以非共价结合成非常紧凑稳定的圆桶状五聚体(见图2)， B亚单位单体两侧各有一个三链反平行片层，在五聚体中彼此相邻的单体通过片层 和大量的盐键相互作用，使B亚单位五聚体成为最稳定的蛋白复合物之一。CTA 是霍乱毒素的活性部分，CTB无毒性，其主要功能是通过与哺乳动物小肠上皮细 胞上的单唾液酸神经节苷脂(GM1)结合而使得CTA进入细胞而产生免疫反应。 CTB具有很强的免疫原性，因为它除了通过与GM1结合而提高肠道对经它协助的 口服疫苗的摄取率，还能特异地影响小肠黏膜细胞间的紧密联结或小带闭锁结构， 增加通透性，防止口服疫苗在小肠黏膜处被消化分解，保持其抗原性，从而提高 机体产生的抗体效价，使机体产生良好的免疫反应。目前认为CTB是至今为止最 有效、最安全的黏膜免疫佐剂之一。

LTB也是高效的黏膜免疫佐剂。大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)为产肠毒性大 肠杆菌分泌到胞周质的一种热不稳定外毒素，是由具有ADP核糖基转移酶活性的 A亚单位以及与神经节苷脂结合的B亚单位组成的AB₅型六聚体蛋白，A亚单位 是其毒性的主要单位，B亚单位具有免疫原性和佐剂功能。LT不仅具有免疫原性， 而且是一种有效的黏膜佐剂，能明显增强机体针对候选抗原的IgA和IgG反应， 同时还能降低机体对这些候选抗原的免疫耐受性，诱发针对它们的长期记忆，因 此LTB作为黏膜佐剂得到了广泛关注。

本发明提供了一种重组抗原组合物，包括：抗原与CTB或LTB的融合蛋白；和 相应的CTB或LTB蛋白。利用5个CTB或LTB非共价键结合的特性，能够形成上述 融合蛋白与另外4个相应的CTB或LTB单体的复合物的嵌合结构，从而增大了抗原 的有效体积，易于被APC摄取。同时，已知CTB和LTB是强有力的免疫佐剂，能够 降低机体对候选抗原的免疫耐受，从而更有效地发挥其免疫促进作用。并由于形成抗 原与5个CTB或LTB的嵌合蛋白而形成了效价更高的抗原，从而增强了整个抗原组 合物的免疫原性。

关于抗原

为了更好地发挥黏膜免疫的作用，优先选用经黏膜感染的病原菌的抗原，包括但 不限于幽门螺杆菌抗原、伤寒抗原、流感HA抗原。利用本发明制备的抗原嵌合体， 能够增强相关抗原的免疫原性，利于构建更加有效的疫苗。

下文中以幽门螺杆菌为例，详细说明和验证了本发明的技术方案和技术效果。

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)是一种是寄生于胃上皮细胞表面的革兰氏阴 性微需氧菌，1983年由澳大利亚学者Warren和Marshall首先从人胃黏膜中分离出， HP能在酸性环境下定植和生存，使机体产生炎症和免疫反应，破坏胃黏膜屏障，使胃 黏膜上皮细胞的凋亡增殖平衡失调。HP是人类上消化道疾病的重要致病菌，是慢性胃 炎、胃溃疡及十二指肠溃疡的主要病因。1994年WHO已确认其与胃癌的发生密切相 关，并将其列为一类致癌因子。HP是全球感染率最高的细菌之一，据报道，90％的亚 洲人和60％的欧洲人感染HP，因此预防和治疗HP感染成为了全球关注的焦点。

目前临床上主要使用二联或三联抗生素治疗HP感染。但存在以下明显不足之处： 1)耐药菌株产生；2)易复发与再感染；3)毒副作用与费用较高；4)无法达到群体防治效 果，无法有效控制HP传播与感染。因此，研制疗效明确的疫苗对于预防和控制HP 感染具有十分重要的意义。目前所研究的HP疫苗主要为全菌疫苗、亚单位疫苗(基因 工程疫苗)、活载体疫苗和DNA疫苗。大多数研究采用HP全菌或全菌裂解物，或HP 毒性蛋白如尿素酶、空泡毒素、毒素相关蛋白、中性粒细胞激活蛋白等单独或联合不 同佐剂进行接种，在动物模型中均能引起保护性应答反应。

预防性疫苗是通过机体的免疫应答发生作用，因此选择有效的HP抗原免疫机体， 可刺激机体产生保护性免疫应答，从而起到预防机体感染HP的作用。随着HP致病 机制研究的深入以及分子生物学技术的发展-基因工程菌株的构建和运用为有效抗原 的筛选提供了有利条件，同时为预防和根除HP感染迈出了关键的一步。

以幽门螺杆菌相关疫苗的制备为例，发明人优先选择了幽门螺杆菌尿素酶、幽门 螺杆菌CagA蛋白和幽门螺杆菌NAP作为用于幽门螺杆菌的有效抗原。本发明应用基 因生物工程技术，制备了三种HP抗原和CTB的融合蛋白(CTB-X(X＝UreB，CagA， NAP))(见图3)，并利用5个CTB非共价键结合的特性，形成CTB-X(X＝UreB，CagA， NAP)-4CTB的嵌合结构(见图4)，从而通过HP抗原与5个CTB的嵌合蛋白形成效 价更高的抗原，并进行了相关的动物免疫原性试验验证。

尿素酶

尿素酶(Ure)在HP定植感染过程中有分解尿素、中和胃酸的作用，对HP的致病 性具有重要意义，HP尿素酶既是定植因子又是毒力因子。尿素酶基因是所有HP菌株 共同拥有的，其编码的蛋白具有很强的尿素酶活性，尿素酶分布于HP表面，占全菌 总蛋白量的5～10％。目前发现尿素酶基因大小约为7.5kb，共有9个读码框(ORF)分 别为UreA、UreB、UreC、UreD、UreE、UreF、UreG、UreH和UreI。其中UreA和 UreB为尿素酶的两个结构亚单位，具有高度的保守性，是PCR检测HP感染常选择 的目的基因，以及基因疫苗的侯选基因。

UreB是HP主要的外膜抗原成分，由569个氨基酸残基编码产生，是HP抗原性 最强的保护性蛋白，具有无毒性、抗原性强且相对保守等特点，其在HP的致病过程 中起关键作用。通过不同菌株的比较，其尿素酶B亚单位氨基酸同源性达到97.9％以 上，表明HP菌株间UreB的抗原变异性极小。此外，UreB的主要活性部分位于菌体 表面，其大分子量和颗粒状结构有利于黏膜免疫接种，因此尿素酶分子可以作为疫苗 抗原的合理选择。同时在体内HP表面具有黏附胞质蛋白的特性，能够将自溶释放的 尿素酶黏附到活菌表面，这给HP疫苗的研究又提供了一个重要的理论依据。经实验 证实，通过黏膜免疫途径给予UreB蛋白疫苗,能够诱导并激发机体的保护性免疫应答， 表明UreB是HP感染重要的保护性候选抗原之一，也是基因工程疫苗的首选抗原，具 有显著的优势。

大量的文献报道，用重组的尿素酶亚单位B(rUreB)口服免疫预先感染了猫胃螺杆 菌(Helicobacter Felis，Hf)的小鼠，结果发现免疫的小鼠不仅彻底清除了Hf感染， 而且能够预防小鼠再次感染；Kleanthous等用rUreB加上LT作为黏膜佐剂免疫小鼠， 与对照组相比结果发现：免疫组胃内尿素酶活性显著降低，且胃黏膜组织HP定量培 养显示HP减少97％以上；Michetti等对口服不同剂量(180mg、60mg、20mg，4次/天) 的尿素酶与LT(5μg)的安全性和免疫原性进行了临床实验研究，结果发现：所有的志 愿者都能够耐受，且能够减少胃内HP的定植，从而减轻了胃炎的程度；Saldinger等 采用rUreB结合霍乱毒素(CT)免疫感染了Hf的BALB/c小鼠，结果发现：免疫组小鼠 全部清除了Hf；进一步研究发现，脾脏CD⁴⁺T细胞增生，血清中lgG1增加，同时伴 随IL-4的增高，γ-干扰素的减少，从而推测rUreB可能诱导了Th2CD⁴⁺T细胞的增 生，有助于清除HP。有学者对HP感染志愿者进行了Ⅰ期临床实验，用UreB结合LT 免疫后,同样发现HP感染的密度显著减少；Lee等对非人灵长类动物进行的类似研究 也表明，通过减少胃内HP的密度有助于减轻胃炎的程度。然而Solnick等报道用尿素 酶口服和肌肉注射免疫恒河猴，而后进行HP攻击试验，结果发现：UreB虽然能够诱 导体液免疫，但是所有给予HP攻击的恒河猴都感染了HP，而且细菌密度在实验组和 对照组中没有统计学差异。上述结果显示目前的UreB相关的HP疫苗还不够完善，有 待于进一步研究。

CagA蛋白

CagA基因也称为细胞毒素相关基因，其表达产物为CagA蛋白。作为细菌分泌的 一种毒素，它由Ⅳ型分泌系统Cag致病岛(pathogenecityisland，PAI)从细菌转运到 宿主细胞中被磷酸化，参与宿主细胞的信号转导及引起细胞骨架结构的重排。研究表 明，cagA阳性HP为毒力菌株，与萎缩性胃炎、胃癌与消化道溃疡等常见的消化道疾 病密切相关，90％以上的HP临床分离菌株cagA呈阳性表达。具有CagA基因的HP 几乎都表达CagA蛋白，并产生可测的抗体反应。据文献报道CagA阳性菌株能够直 接或间接(通过NF-κB)诱导胃上皮细胞分泌IL-8，而IL-8在中性粒细胞趋化和激活 过程中起重要作用，可导致胃黏膜的损伤。动物实验发现CagA基因和CagA蛋白与 胃炎、消化性溃疡，尤其是胃癌的发生有良好的相关性。Marchetti等用重组CagA免 疫HP小鼠感染模型，证实能产生诱导保护性免疫反应，保护率达到了70％。Crabtree 等应用重组CagA作为抗原，经胃免疫长期感染HP的小鼠，结果成功清除了HP，且 有效保护了小鼠免遭HP的再次感染。提示CagA作为HP疫苗保护性抗原具有较高的 可行性，但这种抗原产生的保护作用仅局限于产生CagA的菌株有效，对不产生CagA 的菌株无保护作用。可见，目前针对CagA蛋白也尚无满意的疫苗。

NAP

Evans等在HP的水溶性抽提物中发现一种NAP，它能够募集并活化嗜中性粒细 胞，促进中性粒细胞对胃上皮细胞的黏附，激活中性粒细胞释放反应性氧代谢物，而 引起胃黏膜炎症病变。

NAP高度保守，临床研究发现60％的HP感染者血清中存在NAP特异抗体。NAP 是一种铁蛋白，编码它的NAP基因几乎在所有HP中可检测到，但是在体外表达的 NAP其活性存在很大差异。它能够通过CD11a/CD18和CD11b/CD18与内皮细胞间粘 附分子(ICAM-1)相互作用，而使白细胞黏附内皮细胞；选择性地与中性粒细胞的酸 性糖鞘脂相结合而调节白细胞的功能；与粘蛋白相结合为HP定植于胃黏膜上皮细胞 埋下了伏笔，因此NAP在其黏附和致病过程中起重要作用。Satin等采用纯化重组的 NAP口服免疫了10只小鼠，结果8只小鼠获得了保护性免疫。提示NAP可作为有效 的保护性抗原用于HP感染的疫苗防治。

在本发明优选的实施方式中，本发明提供了一种重组幽门螺杆菌抗原组合物，包 括幽门螺杆菌抗原与CTB的融合蛋白和CTB蛋白。借助CTB本身能够形成五聚体的 性质，增大抗原的体积,易于被APC摄取。另外，CTB是良好的免疫佐剂。因此，本 发明的重组幽门螺杆菌抗原组合物能够有效增强幽门螺杆菌抗原的免疫原性，利于构 建更加有效的疫苗。

在进一步的实施方式中，所述幽门螺杆菌抗原选自幽门螺杆菌UreB蛋白、幽门 螺杆菌CagA蛋白和幽门螺杆菌NAP中的至少一种。这几种抗原均是目前已知的幽门 螺杆菌抗原中无毒性、抗原性强而且相对保守的抗原，更加适合用于疫苗。

抗原与免疫佐剂的结合方式的选择

常规免疫佐剂的使用一般是通过与抗原的直接混合，然后与抗原同时给药以 激发机体的免疫反应，但是其增强抗原免疫原性的效果不理想。本发明通过制备 抗原与黏膜免疫佐剂蛋白质单体的融合蛋白，再将其与这种能形成多聚体的黏膜 免疫佐剂蛋白质单体通过非共价结合形成嵌合蛋白，不但可保持其黏膜免疫佐剂 性质，还可增大了抗原体积，更易于被抗原递呈细胞摄取。

对于融合蛋白的制备，本发明中在抗原和CTB(或LTB)的蛋白之间加入柔 性连接体，以使得蛋白融合后抗原和CTB(或LTB)各自的折叠不会受到影响， 从而分别形成正确的构象。在一个实施方式中，本发明选择了3个G4S的连接体。 但是，本发明中并不限于用此种连接体，其余连接体，比如螺旋形式的连接体 (linker)肽(A(EAAAK)nA)以及葡萄糖球菌蛋白A(PA)等也可用于本发 明中。

进一步地，在保证了融合蛋白两个部分，尤其是CTB(或LTB)构象的基础 上，有利于五聚体的正确形成和形成五聚体的效率。

嵌合体的制备方法

本发明还提供了一种试剂盒，包括表达上述抗原与CTB(或LTB)的融合蛋白的 载体和表达相应黏膜免疫佐剂单体蛋白(CTB或LTB)蛋白的载体。如本领域普通技 术人员所公知，除了目的蛋白之外，所述表达载体中还应包括表达目的蛋白质所必需 的元件，例如启动子、终止子、可选的标记基因等。

所述表达载体优选是原核表达载体，例如，pET系列等原核载体。使用原核表达 载体制备目的蛋白的方法和试剂为本领域所公知，可参见本领域常用工具书，例如冷 泉港实验室编译的《分子克隆实验指南》((美)萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，北京， 科学出版社出版)、《细胞实验指南》((美)D.L.斯佩克特等著，黄培堂等译，北京， 科学出版社出版)等。

对于嵌合体的制备，一直以来都属于一个技术难题。如何在与融合蛋白嵌合之前 避免单体自身形成五聚体，是影响嵌合体收率的关键。一般情况下，原核表达蛋白后 大部分会形成包涵体，需要经过洗涤之后用尿素溶液溶解包涵体。被尿素溶液所溶解 的蛋白质基本属于变性状态，很难产生其天然构象。而常规的复性过程就是逐步除去 尿素的过程，以使其逐步重折叠形成正确的构象。但是，对于能够形成多聚体的单体 蛋白质，其去除尿素的过程中，很容易自发形成多聚体，而不是跟融合蛋白中的单体 蛋白质形成多聚体。因此，常规方法制备嵌合体时产率会非常低。

本发明的发明人选择在复性液中保持一定浓度的尿素和DTT(或尿素和巯基乙 醇)，能够有效避免形成多聚体的单体其自身聚集成为五聚体，促进嵌合体的形成，提 高嵌合体组装的效率。有效克服了采用常规复性处理导致嵌合体组装效率较低的缺陷。

本发明提供了一种通过复性制备嵌合体的方法，所述嵌合体包含(1)一种蛋白质 与能形成多聚体的单体蛋白质的融合蛋白和(2)能形成多聚体的单体蛋白质，通过所 述(1)融合蛋白中的单体蛋白质和所述(2)单体蛋白质形成多聚体来形成嵌合体， 所述方法包括：将所述(2)能形成多聚体的单体蛋白质在含6M至9M，优选8M的 尿素，且pH为3.0至4.0的缓冲液中预复性0.5至3小时，优选预复性1小时；和将 所述(1)融合蛋白和所述(2)能形成多聚体的单体蛋白质在含有1.0M至2.5M的尿 素和0.2mM至1.0mM的DTT或巯基乙醇复性液中复性形成所述嵌合体。

不同于一般的复性液，本发明采用含一定浓度尿素和还原剂的复性液，使融合蛋 白和单体蛋白质缓慢复性过程中组合成为所需的嵌合体。在优选过程中通过在一定pH 条件下进行预复性，然后在还原剂存在下，在浓度稍低的尿素溶液中缓慢复性，意外 地得到了高收率的嵌合体。

而对于大规模生产来说，收率的高低直接影响了生产的成本，更直接影响了大规 模生产的可能性。采用本发明的方法，嵌合体的收率可以达到实现大规模生产的水平。

下文通过具体的实施例详细说明本发明的优选实施方式。

1.抗原的制备方法

实施例1CTB-UreB/4CTB制备：

1.1.1重组工程菌PET-28a-CTB-UreB/BL21-DE3的构建

1.1.1.1融合基因CTB-UreB的构建：

UreB DNA序列来自HP菌株MEL-HP27，CTB DNA序列来自霍乱弧菌O395 株，在融合DNA片段间引入富含甘氨酸/丝氨酸具有柔性功能的(G4S)3连接体 (linker)序列(用斜体下划线表示)，并合成CTB-UreB基因密码子。

基因序列为SEQ ID No.1：

ATGACACCTCAAAATATTACTGATTTGTGTGCAGAATACCACAACACACA    50

AATACATACGCTAAATGATAAGATATTTTCGTATACAGAATCTCTAGCTG  100

GAAAAAGAGAGATGGCTATCATTACTTTTAAGAATGGTGCAACTTTTCAA  150

GTAGAAGTACCAGGTAGTCAACATATAGATTCACAAAAAAAAGCGATTGA  200

AAGGATGAAGGATACCCTGAGGATTGCATATCTTACTGAAGCTAAAGTCG  250

AAAAGTTATGTGTATGGAATAATAAAACGCCTCATGCGATTGCCGCAATT  300

AGTATGGCAAAT

ATGAAAAAGATTAGCAGAAAAGAATATGTTTCTATGTATGGCC  400

CTACTACAGGCGATAAAGTGAGATTGGGCGATACAGACTTGATCGCTGAA  450

GTAGAACATGACTACACCATTTATGGCGAAGAGCTTAAATTCGGTGGCGG  500

TAAAACTTTGAGAGAAGGCATGAGCCAATCCAACAACCCTAGCAAAGAAG  550

AACTGGATTTAATCATCACTAACGCTTTAATCGTGGATTACACCGGTATT  600

TATAAAGCGGATATTGGTATTAAAGATGGCAAAATCGCTGGCATTGGCAA  650

AGGCGGCAACAAAGACATGCAAGATGGCGTTAAAAACAATCTTAGCGTGG  700

GTCCTGCTACTGAAGCCTTAGCTGGTGAAGGTTTGATCGTAACTGCTGGT  750

GGTATTGACACACACATCCACTTCATCTCCCCCCAACAAATCCCTACAGC  800

TTTTGCAAGCGGTGTAACAACGATGATTGGTGGCGGAACTGGCCCTGCTG  850

ATGGCACTAACGCAACCACTATCACTCCAGGCAGAAGAAATTTAAAATGG  900

ATGCTCAGAGCGGCTGAAGAATATTCTATGAATTTAGGTTTCTTAGCTAA  950

AGGTAACGCTTCTAATGATGCGAGCTTAGCCGATCAAATTGAAGCCGGTG  1000

CGATTGGCTTTAAAATCCATGAAGACTGGGGAACAACTCCTTCTGCAATC  1050

AATCATGCGTTAGATGTTGCGGACAAATACGATGTGCAAGTCGCTATCCA  1100

TACGGACACTTTGAATGAAGCCGGTTGTGTAGAAGACACTATGGCAGCCA  1150

TTGCCGGACGCACTATGCACACTTTCCACACTGAAGGCGCTGGTGGCGGA  1200

CACGCTCCTGATATCATTAAAGTAGCCGGCGAACACAACATTCTGCCCGC  1250

TTCCACTAACCCCACTATCCCTTTCACTGTGAATACAGAAGCAGAACACA  1300

TGGACATGCTTATGGTGTGCCACCACTTGGATAAAAGCATTAAAGAAGAT  1350

GTTCAGTTCGCTGATTCAAGGATCCGCCCTCAAACCATTGCGGCTGAAGA  1400

CACTTTGCATGACATGGGGATTTTCTCAATCACTAGTTCTGACTCTCAAG  1450

CTATGGGTCGTGTGGGTGAAGTTATCACCAGAACTTGGCAAACAGCTGAC  1500

AAAAACAAAAAAGAATTTGGCCGCTTGAAAGAAGAAAAAGGCGATAACGA  1550

CAACTTCAGAATCAAACGCTACTTGTCTAAATACACCATTAACCCAGCGA  1600

TCGCTCATGGGATTAGCGAGTATGTAGGTTCTGTAGAAGTGGGCAAAGTG  1650

GCTGACTTGGTATTGTGGAGTCCAGCATTCTTTGGCGTGAAACCCAACAT  1700

GATCATCAAAGGTGGGTTTATTGCATTGAGTCAAATGGGCGATGCGAACG  1750

CTTCTATCCCTACCCCACAACCAGTTTATTACAGAGAAATGTTCGCTCAT  1800

CATGGTAAAGCCAAATACGATGCAAACATCACTTTTGTGTCTAAAGCGGC  1850

TTATGACAAAGGCATTAAAGAAGAATTAGGGCTTGAAAGACAAGTGTTGC  1900

CGGTAAAAAATTGCAGAAACATCACTAAAAAAGACATGCAATTCAACGAC  1950

ACTACCGCTCACATTGAAGTCAATCCTGAAACTTACCATGTGTTCGTGGA  2000

TGGCAAAGAAGTAACTTCTAAACCAGCCACTAAAGTGAGCTTGGCGCAAC  2050

TCTTTAGCATTTTCTAA  2067。

1.1.1.2表达载体PET-28a-CTB-UreB的构建：

表达载体PET-28a、HP UreB-CTB融合基因片段，分别用NdeI和HindIII酶 切后，经琼脂糖电泳凝胶中的目的DNA回收纯化，然后进行连接反应，根据目的 片段和载体摩尔数比为1:3-1:10的原则，16℃连接反应16小时，设计连接反应体 系如下：

1.1.1.3大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl₂法)

从-70℃保存的DH5α甘油菌中挑取微量菌划板，挑取E.coli DH5α受体菌的 单菌落于装有5ml LB培养基的有盖试管中，37℃振荡(200rpm)培养10～12小 时，得到种子液，将5ml种子液接入100ml新鲜LB培养基中振荡(200rpm)培 养，至菌液的OD600为0.4～0.9时，取新鲜培养液1.5ml转入Eppendorf管中， 冰上放置10分钟，然后于4℃下4000rpm离心10分钟，小心弃上清，重复前两 步一次，收集菌体。加入冰预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液300μl轻轻悬浮细胞，冰 上放置30分钟，4℃下4000rpm离心10分钟，弃去上清，沉淀加入100μl预冷 的0.1mol/L CaCl₂溶液轻轻悬浮细胞，即为感受态细胞。如果感受态细胞需贮存 以后再使用，则需用预冷的30μl50％甘油与70μl的0.1mol/L的CaCl₂溶液(甘 油终浓度为15％)重悬细胞，置-70℃保存(可保存半年)，备用。

1.1.1.4用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞

从-70℃冰箱中取出感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上， 加入连接反应液(含量不超过50ng，体积不超过10μl)，轻轻弹匀，冰上放置 30分钟，42℃水浴中热冲击90后，迅速置于冰上冷却5分钟，向管中加入800μ l LB液体培养基，混匀后37℃150rpm振荡培养1.5小时，涂布于含卡那霉素(Kan) 的筛选平板，37℃培养过夜。

1.1.1.5融合蛋白克隆菌的构建及筛选：

挑取经转化的DH5α单菌落，提取质粒，经双酶切后片段大小为2067bp(见 图5)，酶切后片段大小与设计一致，证明重组质粒构建成功。

1.1.1.6融合蛋白工程菌的构建及筛选：

大肠杆菌BL21-DE3的感受态菌制备、转化及重组菌的质粒抽提方法同融合蛋 白克隆菌的构建及筛选。

从含Kan的筛选平板上挑取单克隆菌落，加入5ml的LB试管中，37℃150rpm 振荡培养4小时，加入1mM的IPTG诱导表达，其表达结果见图6。

1.1.2重组工程菌PET-28a-CTB-UreB/BL21(DE3)的发酵

1.1.2.1种子活化

种子活化采用LB(胰蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；NaCl10g/L)培养基， 配制体积为50mL，121℃灭菌20分钟，冷却后加入Kan(50mg/L)和工作种子批 菌液各50μl，37℃±1℃，培养15～16小时。

1.1.2.2种子制备

种子采用2YT培养基(胰蛋白胨16g/L；酵母提取物10g/L；NaCl5g/L)， 配制体积为3L，121℃灭菌20分钟后加入活化好的种子液3ml，37℃±1℃，培养 4～6小时。

1.1.2.3发酵罐发酵

1.1.2.3.1基础培养基

上述基础培养基用纯化水溶解后，加纯化水至50L。

1.1.2.3.2补料

按以上补料配方进行配制，先用纯化水溶解后，再加纯化水至4L，121℃灭菌 20分钟后使用。

1.1.2.3.3补碱

4M的氢氧化钠1L。

1.1.2.3.4IPTG溶液

用已灭菌纯化水溶解5.0g IPTG，经0.22μm滤膜过滤后置2～8℃冰箱备用， 保存期为24h。

1.1.2.3.5培养参数

在发酵罐上设置培养参数：

补料：

当培养至OD600在20～30之间时加入IPTG溶液，继续培养3小时后放罐。

1.1.2.3.4离心

培养结束，发酵液转移到预冷的贮罐中，待发酵液冷却至15℃以下后，使用 管式离心机离心收集菌体。

1.1.3CTB-UreB/4CTB的制备

1.1.3.1CTB-UreB的制备

(1)包涵体制备

细菌培养结束，将发酵液转移到预冷的贮罐中，待发酵液冷却至15℃以下后， 使用管式离心机离心收集菌体。。

菌体用50mM Tris-HCl，0.5％Triton X-100，150mM NaCl，1mM EDTA pH8.0 缓冲液以1：10(W/V)比例悬浮，4℃预冷后，高压匀浆破菌900bar，3次，14000g 离心20min，收集沉淀。

将收集的包涵体沉淀以1：10(W/V)的比例分别用50mM Tris-HCl，0.5％Triton  X-100，2M尿素，1mM EDTA pH8.0缓冲液洗涤沉淀3次，50mM Tris-HCl，5mM  DTT，pH8.0缓冲液洗涤1次。洗涤条件为：室温搅拌30min，6000g离心20min。

(2)CTB-UreB蛋白变性

用50mM Tris-HCl，8M尿素，10mM DTT，10％甘油，pH8.0的包涵体溶解 液充分溶解包涵体，4℃搅拌过夜，12000rpm离心30min，取上清备用。

(3)CTB-UreB蛋白纯化

经过DEAE和SPHP层析得到纯化的CTB-UreB。

DEAE柱纯化

平衡液：20mM Tris-HCl,8M尿素,10mM DTT,10％甘油pH8.0

洗脱液：20mM Tirs-HCl,8M尿素,250mM NaCl,10mM DTT10％甘油pH8.0 SPHP纯化

平衡液：20mM PB+8M尿素+5mM DTT10％甘油pH7.2

洗涤液：20mM PB,8M尿素,30mM NaCl,5mM DTT,10％甘油pH7.2，电导 小于3.7ms/m

洗脱液:20mM PB,8M尿素,0.3M NaCl,5mM DTT,10％甘油pH7.2

洗杂液：20mM PB,8M尿素,1M NaCl,5mM DTT,10％甘油pH7.2

CTB-UreB纯化电泳见图8。

1.1.3.2.CTB-UreB/4CTB的制备

将CTB原液用50mM Tris-HCl,8M尿素,pH8.0缓冲液稀释调pH至3.0～4.0， 室温放置1小时，然后调pH到8.0，4℃放置备用。

将两种蛋白CTB-UreB与CTB单体以摩尔数比为1：4混合后，5倍体积稀释 到最终复性液中(50mM Tris-HCl pH8.0+10％甘油+150mM NaCl)，控制DTT的 浓度范围在0.2-1.0mM之间，尿素浓度范围在1.0M-2.5M之间。室温放置过夜。

上述溶液经过螯合FF和QHP纯化，得到纯化的CTB-UreB/4CTB。

螯合FF

平衡液：20mM Tris-HCl+5％甘油+20mM咪唑pH8.0，

洗脱液：20mM Tris-HCl+5％甘油+200～300mM咪唑洗脱目的蛋白，收全峰

洗杂液：20mM Tris-HCl+5％甘油+500mM咪唑pH8.0

Q HP纯化

缓冲液A：20mM Tris-HCl+5％甘油pH7.5

缓冲液B：20mM Tris-HCl+5％甘油+0.3M NaCl pH7.5

0-100％B10CV洗脱目的蛋白。

CTB-UreB/4CTB纯化电泳见图9A。

1.1.3.3.稳定性研究

将纯化后的CTB-UreB/4CTB抗原嵌合体原液加稀盐酸调整至不同pH值，室温放 置1小时后取样品进行SDS-PAGE电泳，电泳结果见图9B，其中各个泳道的样品如 下：M:Fermentas蛋白预染；泳道1-7样品分别为pH9.0、8.0、7.0、6.0、5.0、4.0、 3.0条件下处理后的样品电泳结果。

由图9B结果可见，随着pH降低，在电泳图上显示位于嵌合体位置的蛋白浓度逐 渐降低，且出现了多条分子量小于本嵌合体的蛋白条带，说明产生了小分子量的降解 产物。而在大于pH7.0，特别是pH8.0下本嵌合体蛋白稳定，未出现分子量小于本嵌 合体的蛋白条带。这说明CTB-UreB/4CTB抗原嵌合体在中性偏碱性环境中稳定，在 偏酸性环境下容易解离。具体而言，在pH>7.0的情况下比较稳定，　优选pH为8.0。

1.2CTB-CagA/4CTB的制备方法

1.2.1重组工程菌PET-28a-CTB-CagA/BL21-DE3的构建

采用与实施例1相同的步骤制备CTB-CagA，区别仅在于采用CagA基因代替 UreB基因。经构建的工程菌质粒经双酶切后片段大小为1266bp(见图5)，其融 合蛋白的表达见图7。

基因序列为SEQ IDNo.:2，其中linker用斜体下划线表示：

ATGACACCTCAAAATATTACTGATTTGTGTGCAGAATACCACAACACACA   50

AATACATACGCTAAATGATAAGATATTTTCGTATACAGAATCTCTAGCTG 100

GAAAAAGAGAGATGGCTATCATTACTTTTAAGAATGGTGCAACTTTTCAA  150

GTAGAAGTACCAGGTAGTCAACATATAGATTCACAAAAAAAAGCGATTGA  200

AAGGATGAAGGATACCCTGAGGATTGCATATCTTACTGAAGCTAAAGTCG   250

AAAAGTT`TGTGTATGGAATAATAAAACGCCTCATGCGATTGCCGCAATT 300

AGTATGGCAAAT

ATGAAATTATTTGGAAATTCCAATAACAATAATAATGGACTCA 400

AAAACGAACCCATTTACGCTCAAGTTAATAAAAAGAAAGCAGGACAAGCA    450

ACTAGCCCTGAAGAGCCCATTTACGCTCAAGTTGCTAAAAAGGTGAGTGC  500

AAAAATTGACCAACTCAACGAAGCTACATCAGCAATAAATAGAAAAATTG  550

ACCGGATTAACAAAATTGCATCAGCAGGTAAAGGAGTGGGCGGTTTCAGT  600

GGAGCAGGGCGATCAGCTAGTCCTGAACCCATTTACGCTACAATTGATTT 650

TGATGAGGCAAATCAAGCAGGCTTCCCTCTTAGGAGAAGCACTGCAGTTA  700

ATGATCTCAGTAAAGTAGGGCTTTCAAGGGAACAAGAATTGACTCGTAGA  750

ATTGGCGATCTCAATCAGGCAGTGTCAGAAGCTAAAACAGGTCATTTTGA 800

CAAACTAGAACAAAAGATGGATGAACTCAAAGATTCTACAAAAAAGAATG 850

CTTTGAAGCTATGGGCTGAAAGCACGAAACAAGTGCCTACTGGTTTGCAG  900

GCGAAATTGGACAATTACGCTACTAACAGCCACACACGCATTAACAGTAA 950

TGTCCAAAATGGAGCAGTCAATGAGAAAGTGACCGGTATGCTAACGCAAA  1000

AAAACCCTGAGTGGCTCAAGCTCGTGAATGATAAGATAGTTGCACATAAT  1050

GTGGGAAGCGCTCATTTGTCAGAGTATGATAAAATTGGATTCAACCAAAA  1100

GAATATGAAAGATTATTCTGATTCGTTCAAGTTTTCCACCAAGTTGAACA 1150

ATGCCGTAAAAGACATTAAGTCTAGCTTTGTGCAATTTTTAACCAATACA 1200

TTTTCTACAGGATCTTACAGCTTGATGAAAGCAAATGCGGAACATGGAGT  1250

CAAAAATACTACAAAATAA  1269

1.2.2重组工程菌PET-28a-CTB-CagA/BL21(DE3)的发酵

采用与实施例1相同的方法进行重组工程菌PET-28a-CTB-CagA/BL21(DE3) 的发酵。

1.2.3CTB-CagA/4CTB的制备

1.2.3.1CTB-CagA的制备

⑴采用与实施例1相同的方法进行CTB-CagA包涵体的提取。

⑵包涵体用包涵体溶解液以1：20(W/V)的比例混合，4℃搅拌3小时，过 夜，12000rpm离心30min收集上清。

⑶Q FF柱纯化

缓冲液A：20mM Tirs-HCl+8M尿素+5mM DTT5％甘油pH7.5

缓冲液B：20mM Tirs-HCl,8M尿素,1.0M NaCl,5mMDTT5％甘油,pH7.5

用A液平衡、淋洗，B液洗脱。

⑷SP Big beads柱纯化

缓冲液A：20mM Tris-HCl,8M尿素,5mM DTT,5％甘油,pH7.5

缓冲液B：20mM Tirs-HCl,8M尿素,150mM NaCl,5mM DTT5％甘油,pH7.5

用A液平衡、淋洗，B液洗脱。

CTB-CagA纯化电泳见图10。

1.2.3.2CTB-CagA/4CTB的制备

将CTB原液用50mM Tris-HCl,8M尿素,pH8.0缓冲液稀释调pH至3.0～4.0， 室温放置1小时，然后调pH到8.0，4℃放置备用。

将两种蛋白CTB-CagA与CTB单体以摩尔数比为1：4混合后，5倍体积稀释 到最终复性液中(50mM Tris-HCl pH8.0+10％甘油+150mM NaCl)，控制DTT的 浓度范围在0.2-1.0mM之间，尿素浓度范围在1.0M-2.5M之间。室温放置过夜。

上述溶液经过螯合FF和SP HP纯化，得到纯化的CTB-CagA/4CTB。

螯合FF柱纯化

缓冲液A：20mM Tris-HCl+5％甘油+20mM咪唑pH8.0

缓冲液B：20mM Tris-HCl+5％甘油+200mM咪唑洗脱目的蛋白

100％B洗杂

SP HP柱纯化

缓冲液A：20mM Tris-HCl+5％甘油pH7.5

缓冲液B：20mM Tris-HCl+5％甘油+0.3M NaCl pH7.5

CTB-CagA/4CTB嵌合体蛋白纯化电泳图见图11A。

1.2.3.3稳定性研究

将纯化后的CTB-CagA/4CTB抗原嵌合体原液加稀盐酸调整至不同pH值，室温放 置1小时后取样品进行SDS-PAGE电泳，电泳结果见图11B，其中各个泳道的样品如 下：M:Fermentas蛋白预染；泳道1-7样品分别为pH9.0、8.0、7.0、6.0、5.0、4.0、 3.0条件下处理后的样品电泳结果。

由图11B结果可见，随着pH降低，在电泳图上显示位于嵌合体位置的蛋白浓度 逐渐降低，且出现了多条分子量小于本嵌合体的蛋白条带，说明产生了小分子量的降 解产物，而在大于pH7.0，特别是pH8.0下本嵌合体蛋白稳定，未出现分子量小于本 嵌合体的蛋白条带。这说明CTB-CagA/4CTB抗原嵌合体在中性偏碱性环境中稳定， 在偏酸性环境下容易解离。具体而言，在pH>7.0的情况下比较稳定，　优选pH为8.0。

1.3CTB-NAP/4CTB的制备方法

1.3.1重组工程菌PET-28a-CTB-NAP/BL21-DE3的构建

采用与实施例1相同的步骤制备CTB-NAP，区别仅在于采用NAP基因代替 UreB基因。经构建的工程菌质粒经双酶切后片段大小为789bp(见图5)，其融合 蛋白的表达见图7。

基因序列为SEQ ID No.:3，其中linker用斜体下划线表示：

ATGACACCTCAAAATATTACTGATTTGTGTGCAGAATACCACAACACACA   50

AATACATACGCTAAATGATAAGATATTTTCGTATACAGAATCTCTAGCTG 100

GAAAAAGAGAGATGGCTATCATTACTTTTAAGAATGGTGCAACTTTTCAA  150

GTAGAAGTACCAGGTAGTCAACATATAGATTCACAAAAAAAAGCGATTGA 200

AAGGATGAAGGATACCCTGAGGATTGCATATCTTACTGAAGCTAAAGTCG  250

AAAAGTTATGTGTATGGAATAATAAAACGCCTCATGCGATTGCCGCAATT  300

AGTATGGCAAAT

ATGAAAACATTTGAAATTTTAAAACATTTGCAAGCGGATGCGA  400

TCGTGTTGTTTATGAAAGTGCATAACTTCCATTGGAATGTGAAAGGCACG    450

GATTTTTTTAATGTACATAAAGCTACTGAAGAAATTTATGAAGAGTTTGC    500

GGACATGTTTGATGATCTCGCTGAAAGGATCGTTCAATTAGGACACCACC    550

CCTTAGTCACTTTATCCGAAGCGATCAAACTCACTCGTGTTAAAGAAGAA    600

ACTAAAACGAGCTTCCACTCTAAAGACATTTTTAAAGAAATTCTAGAGGA  650

CTATAAACACCTAGAAAAAGAATTTAAAGAGCTCTCTAACACCGCTGAAA   700

AAGAAGGCGATAAAGTCACCGTAACTTATGCGGATGATCAATTGGCCAAG   750

TTGCAAAAATCCATTTGGATGCTGCAAGCCCATTTAGCTTAA  792。

1.3.2重组工程菌PET-28a-CTB-NAP/BL21(DE3)的发酵

采用与实施例1相同的方法进行重组工程菌PET-28a-CTB-NAP/BL21(DE3) 的发酵。

1.3.3CTB-NAP/4CTB的制备

1.3.3.1CTB-NAP的制备

⑴采用与实施例1相同的方法进行CTB-NAP包涵体的提取。

⑵CTB-NAP包涵体经洗涤后用20mM Tris-HCl，8M尿素，pH8.0的缓冲液 溶解过夜，12,000rpm离心30分钟取上清。

⑶QFF层析：

缓冲液A：20mM Tris-HCl+5％甘油pH7.5

缓冲液B：20mM Tris-HCl+5％甘油+0.3M NaCl pH7.5

用A液平衡、淋洗，B液洗脱。CTB-NAP融合蛋白纯化电泳图见图12。

1.3.3.2CTB-NAP/4CTB的制备

⑴CTB-NAP的处理：用20mM Tris-HCl，8M尿素，pH8.0的缓冲液将上述 CTB-NAP样品稀释，并调pH至8.0，并补加巯基乙醇使其终浓度为3mM。

⑵CTB的处理：用20mM Tris-HCl，8M尿素，pH8.0的缓冲液将CTB原液 稀释，并调pH到3.5～3.7，放置1小时后，调pH到8.0，并补加巯基乙醇使其终 浓度为3mM。

⑶复性：取上述处理好的两种蛋白CTB-NAP与CTB单体以摩尔数比为1： 4混合，用50mM Tris-HCl，5％甘油，0.03mM GSSG，pH8.0缓冲液以1:6稀释， 并控制巯基乙醇的浓度范围在0.2-1.0mM之间，尿素浓度范围在1.0M-2.5M之间。 21℃放置过夜。

⑷NI FF纯化：

缓冲液A:50mM Tris-HCl，5％甘油，20mM咪唑，PH8.0

缓冲液B:50mM Tris-HCl，5％甘油，300mM咪唑，PH8.0

复性样品补加终浓度为20mM咪唑，上NI FF，流速8ml/min，用A液淋洗， 用B液洗脱。

⑸QHP纯化：

缓冲液A:50mM Tris-HCl，5％甘油

缓冲液B:50mM Tris-HCl，5％甘油，1M NaCl PH8.0

过NI FF洗脱样(电导在4～5之间)上QHP，上样速度3ml/min，用A液平 衡、淋洗，30％缓冲液B洗脱(流速为1ml/min)。

CTB-NAP/4CTB嵌合体蛋白纯化电泳图见图13。

2.重组幽门螺杆菌疫苗(rHP)小鼠免疫原性研究

2.1CTB-UreB/4CTB嵌合体蛋白的免疫原性研究

2.1.1BALB/c小鼠免疫方法

2.1.1.1试验动物：8-10周，体重18-20g，SPF级雌性BALB/c小鼠，

2.1.1.2试验药物：UreB，CTB-UreB融合体蛋白，CTB-UreB/4CTB嵌合体蛋白 均用Tris-HCl缓冲液(pH8.0)稀释，UreB蛋白免疫剂量为200μg/只，CTB-UreB融 合蛋白和CTB-UreB/4CTB嵌合体蛋白均以与UreB蛋白等摩尔数给药，抗酸剂用PBS 稀释至50mg/ml。

2.1.1.3试验分4组：UreB组，CTB-UreB组，CTB-UreB/4CTB组和生理盐水组 (或称，空白对照组(CON，Control))。

2.1.1.4小鼠的免疫程序：小鼠共免疫4次，每隔7天免疫1次。每只动物灌胃给 予0.2ml试验药物，给药前10min给予0.2ml的抗酸剂。所有动物给药前禁食12h，不 禁水，给药后1h再进水进食。

2.1.1.5样品采集及检测：

各组小鼠在免疫前一天和首次免疫后的2周、4周、6周、8周、10周需采血用于 检测血清IgG和IgA抗体水平。除最后一次眼球采血之外，其余均为鼠尾采血，所有 的血清离心前需4℃过夜，次日以4℃，5000rpm，15min离心，取上层血清，-20℃保 存。

各组动物在免疫后10周经眼球采血后被处死，剖腹，取近回盲部末端的回肠10cm， 用PBS冲洗肠道3次后，无菌刀片刮取肠黏膜，溶于1ml0.01mol/L PBS中(pH7.4， 含50mmol/L EDTA、20nmol/L蛋白酶抑制剂亮肽素和胃酶抑素)。10000rpm离心 10min，取上清并加入20μl100mmol/L PMSF(Sigma)。以ELISA检测血清IgG和肠黏 膜sIgA抗体水平。96孔酶标板每孔加入100μl Ure B抗原(1.25μg/ml)，4℃包被过夜， 次日弃去孔内溶液，用PBST洗涤3次；每孔加封闭液200μl(含2％BSA)，37℃封 闭2h，PBST洗涤3次；每孔加入100μl血清(1:300稀释)，37℃反应1h后PBST洗 涤三次，每孔加入100μl HRP标记的羊抗鼠IgG(1:2000～1:50000)/HRP标记的羊抗 鼠IgA(1:4000～1:8000)，37℃孵育1h，PBST洗涤6次；立即加入新鲜配制的底物 液，每孔100μl，室温反应15min，加终止液50μl；酶标检测仪测定每孔的吸光度 OD450值。

2.1.2结果

BALB/C小鼠经HP疫苗口服免疫后，其血清IgG和肠黏膜sIgA抗体反应见图14、 15。空白对照组和UreB蛋白组小鼠的抗体在给药后没有增加，相反，CTB-UreB融 合蛋白和CTB-UreB/4CTB嵌合体蛋白组的小鼠其血清IgG抗体在首次给药后4周明 显增加，至8周达高峰，与空白对照组比较均存在显著性差异(P<0.001)；肠黏膜sIgA 抗体也明显升高，与空白对照组比较差异显著(P<0.001)。其中CTB-UreB融合蛋白 组小鼠的抗-UreB抗体的阳转率为60％，CTB-UreB/4CTB嵌合体蛋白组小鼠的抗-UreB 抗体的阳转率为95％，表明CTB-UreB/4CTB嵌合体蛋白疫苗可诱导机体产生显著的 免疫应答反应。

2.1.3结论

口服给予重组CTB-UreB融合蛋白和CTB-UreB/4CTB嵌合体蛋白，能刺激机体产 生抗UreB抗原的特异性抗体。但CTB-UreB/4CTB嵌合体蛋白引起的免疫应答明显优 于CTB-UreB融合蛋白，表明CTB-UreB/4CTB嵌合体蛋白具有更好的免疫反应性和 抗原性，可以作为预防幽门螺杆菌的候选疫苗。

2.2CTB-CagA/4CTB嵌合体蛋白的免疫原性研究

2.2.1BALB/c小鼠免疫方法

免疫方法基本同2.1.1。其中试验药物CagA蛋白，CTB-CagA融合蛋白， CTB-CagA/4CTB嵌合体蛋白均用Tris-HCl缓冲液(pH8.0)稀释，CagA蛋白免疫剂 量为200μg/只，CTB-CagA融合蛋白和CTB-CagA/4CTB嵌合体蛋白均以与CagA蛋 白等摩尔数给药，给药容量为0.2ml/只。ELISA检测时用CagA抗原包板。其血清IgG 和肠黏膜sIgA抗体反应见图16、17。

2.2.3结论

口服给予重组CTB-CagA/4CTB嵌合体蛋白，能刺激机体产生抗CagA抗原的特异 性抗体。表明CTB-CagA/4CTB嵌合体蛋白具有更好的免疫反应性和抗原性，可以作 为预防幽门螺杆菌的候选疫苗。

2.3CTB-NAP/4CTB嵌合体蛋白的免疫原性研究

2.3.1BALB/c小鼠免疫方法

免疫方法基本同2.1.1。其中试验药物NAP蛋白，CTB-NAP融合蛋白, CTB-NAP/4CTB嵌合体蛋白均用Tris-HCl缓冲液(pH8.0)稀释，NAP融合蛋白免疫 剂量为200μg/只，CTB-NAP融合蛋白和CTB-NAP/4CTB嵌合体蛋白均以与UreB蛋 白等摩尔数给药，给药容量为0.2ml/只。ELISA检测时用CagA抗原包板。

2.3.2结果

BALB/C小鼠经HP疫苗口服免疫后，其血清IgG和肠黏膜sIgA抗体反应见图18、 19。

2.3.3结论

口服给予重组CTB-NAP/4CTB嵌合体蛋白，能刺激机体产生抗NAP抗原的特异 性抗体。表明CTB-NAP/4CTB嵌合体蛋白具有更好的免疫反应性和抗原性，可以作为 预防幽门螺杆菌的候选疫苗。

3.重组幽门螺杆菌疫苗对幽门螺杆菌SS1株感染BALB/c小鼠的免疫保护作用

3.1试验方法

3.1.1免疫方法同2.1.1。

3.1.2HP SS1菌攻击：

试验组和阴性对照组动物在末次免疫后2周，连续3天灌胃给予HP SS1菌0.2ml (1×10⁹CFU/ml)，每日1次，给予HP SS1菌前10min灌胃给予0.2ml抗酸剂。

3.1.3样品采集及检测

血清及肠黏膜采集及检测方法同2.1.1.5。

所有动物用HPSS1菌攻击4W后全部处死，剖腹取胃，沿纵轴将胃组织分为三部 分，每部分均包括胃底、胃体和胃窦三部分。一份做定量细菌培养：用无菌镊夹取胃 窦部组织，黏膜面向下，涂布于HP选择性培养平板，37℃，在微需氧条件下培养1 天左右，见透明、光滑、针尖状小菌落，即为阳性。

一份置96孔板行快速尿素酶试验：将尿素酶试剂加入含鼠胃组织的96孔板各孔 中，每孔定量至100μl，密闭下室温静置0.5h，试剂由黄色变为红色判定位阳性，即样 本有Hp感染。

另一份置4％多聚甲醛固定，经石蜡包埋、切片、HE染色、Gimsa染色后用显微 镜观察HP SS1菌的定植情况和组织的炎症反应。

3.2结果

3.2.1免疫/攻击后小鼠毒副反应观察

各组小鼠精神状态良好，未发现精神萎靡、腹泻等不良反应。

3.2.2血清/肠黏膜IgG/sIgA抗体结果

空白对照组、UreB蛋白组以及UreB+CTB小鼠的抗体在给药后没有增加，而 CTB-UreB融合蛋白和CTB-UreB/4CTB嵌合体蛋白组的小鼠其血清IgG抗体和肠黏 膜sIgA抗体在首次给药后9.5周明显增加，与空白对照组比较均存在显著性差异。结 果见图20、21。

3.2.3组织涂片及快速尿素酶检测

各组小鼠在攻击后4周做快速尿素酶检测及组织涂片结果显示：模型组的8只动 物均被感染了HPSS1，尿素酶及组织涂片均为阳性；空白对照组(未给予HPSS攻击) 所有动物其尿素酶及组织涂片均为阴性结果；UreB组有7只动物显示尿素酶及组织涂 片结果为阳性；CTB-UreB组显示有5只动物尿素酶结果为阳性，其中4只动物涂片 结果为阳性；CTB-UreB/4CTB组仅有1只动物显示尿素酶检测阳性，而所有动物涂片 结果均为阴性。结果详见表1。

表1：根据本发明的实施方式rHP疫苗口服给予小鼠，再用HPSS1攻击后HP检 测结果

3.2.4病理组织切片染色结果

对照组小鼠胃小凹有大量成团的幽门螺杆菌定植，胃黏膜固有层深部至中部有大 量的巨噬细胞和中性粒细胞浸润，CTB-UreB融合蛋白组小鼠胃小凹有少量的幽门螺 杆菌定植，胃黏膜固有层深部有中等程度的巨噬细胞和中性粒细胞浸润，炎症反应较 轻；而CTB-UreB/4CTB嵌合体蛋白组胃小凹有极少量的幽门螺杆菌定植，组织切片 上未见巨噬细胞和中性粒细胞浸润(见图22)。

3.3结论

在整个实验过程中，给予CTB-UreB/4CTB嵌合体蛋白免疫的小鼠未发现不良反应， 病理学检查显示免疫小鼠胃内无明显炎症改变，表明以CTB-UreB/4CTB嵌合体蛋白 为抗原成分的HP疫苗以试验剂量进行免疫时具有良好的安全性。

CTB-UreB/4CTB嵌合体蛋白经口服免疫可有效诱导免疫应答反应，对HP SS1菌 攻击的小鼠具有良好的保护作用，作为抗HP感染的口服疫苗具有良好的应用前景。

上述检测例的结果表明，口服给予重组CTB-UreB融合蛋白和 CTB-UreB/4CTB嵌合蛋白，能刺激机体产生抗UreB抗原的特异性抗体；其中 CTB-UreB/4CTB嵌合蛋白免疫小鼠的血清抗UreB抗原的特异性IgG和胃黏液 s-IgA抗体滴度和阳转率均明显高于CTB-UreB融合蛋白，与空白对照组比较有显 著性差异，表明上述抗原具有良好的免疫反应性和抗原性，可以作为HP的候选疫 苗。

结果表明，CTB-UreB/4CTB嵌合蛋白产生的抗体水平显著高于仅仅用UreB 产生的抗体。而且无论是针对在血清中的抗体还是分泌型的抗体，都观察到 CTB-UreB/4CTB嵌合蛋白诱导产生了显著升高的抗体。这表明本发明的抗原组合 物明显提高了原抗原的免疫原性水平，增强了机体的免疫反应，有助于更加有效 的疫苗的制备。而且表2和图14分泌型IgA检测的结果还表明，本发明的重组抗 原构成的嵌合蛋白利于抗原穿透肠黏膜，并刺激黏膜产生分泌型IgA免疫。

对比例1

发明人构建载体并表达幽门螺杆菌抗原如UreB与霍乱毒素的A₂亚单位 (CTA₂)的融合蛋白，并将其在体外与表达的CTB蛋白组合，使其形成 UreB-CTA₂/5CTB嵌合蛋白。

根据现有技术理解，CTA₂与CTB的结合与CTB之间的结合同为非共价结合， 用同样的方法应该有相似的产率。

然而，实验结果表明UreB-CTA₂/5CTB嵌合蛋白组装效率<5％(见图23A)， 而CTB-UreB/4CTB嵌合蛋白组装效率>90％(见图23B)，本发明CTB-UreB/4CTB 的组装效率远远高于UreB-CTA₂/5CTB的组装效率。CTB-UreB/4CTB嵌合蛋白可 明显克服UreB-CTA₂/5CTB由于组装效率低导致产业化可能性低的缺陷。

对比例2

发明人尝试利用酵母为代表的真核表达系统同时表达CTB-抗原融合蛋白和 CTB，希望得到自然形成的有预期效果的嵌合体结构。发明人发现，采用酵母系统 表达时，CTB能正确形成由5个相同CTB单体组成的五聚体结构，但是表达的 CTB分子量(约为65KD)明显大于天然状态时(55KD)。提示采用真核系统表 达时，可能发生了CTB的糖基化翻译后修饰，致使表达的CTB与天然的CTB分 子存在较大差异，进而影响与GM1受体的结合力。同时，采用这种方式制备嵌合 体时对与CTB融合的抗原大小有严格要求，并且利用此表达方式时，融合蛋白和 CTB单体自然组装效率较低，致使整个表达体系的得率很低，不适用于大规模疫 苗的制备。

对比例3

发明人尝试在以大肠杆菌为代表的原核表达系统中，同时表达CTB-抗原融合 蛋白和CTB，希望能得到自然形成的嵌合体。由于霍乱毒素B亚单位的五聚体组 装机理不明，研究一致认为嵌合体的组装在穿膜过程中发生。在大肠杆菌表达系 统中，带信号肽的CTB-抗原融合蛋白无法正确穿膜，形成预期的嵌合体结构。并 且，在胞内表达的融合蛋白大都形成包涵体，CTB表达也因起始氨基酸甲硫氨酸 的存在无法形成天然CTB五聚体，因此也无法形成预期的嵌合体结构。

以上仅仅以幽门螺杆菌相关抗原为例，说明了本发明的CTB-X-4CTB系统在 增强抗原的免疫原性方面的应用和效果。基于本领域技术人员的经验和理解，可 以推测出本发明的CTB-X-4CTB系统还可以应用于多种其他黏膜免疫抗原，包括 但不限于幽门螺杆菌抗原、伤寒抗原、流感HA抗原，提高这些抗原的免疫原性， 并制备高效价疫苗。其相应的载体选择和制备、蛋白质的表达和纯化均为本领域 公知技术，本领域普通技术人员在了解了本发明的发明点之后，均可以利用本发 明的CTB-X-4CTB系统制备相应的融合蛋白和抗原组合物，并检测其相应的免疫 原性的提高。

所以，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在 本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本 发明保护的范围之内。