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摘要
缩略语表(Abbreviation)
第1章 文献综述
1.1 猪繁殖与呼吸综合征
1.2 PRRS的流行病学特点
1.3 PRRSV的病原特性
1.3.1 病毒的分类及特性
1.3.2 PRRSV的生物学特性
1.4 PRRSV分子生物学
1.4.1 基因组的基本结构
1.4.2 PRRSV的蛋白质
1.4.3 PRRSV的遗传变异
1.5 PRRS的诊断研究
1.5.1 病毒分离
1.5.2 分子生物学检测方法
1.5.3 血清学诊断方法
1.6 PRRSV的免疫学反应
1.6.1 体液免疫反应
1.6.2 细胞免疫反应
1.7 PRRS疫苗研究进展
1.7.1 PRRS传统常规疫苗
1.7.2 PRRS新型疫苗研究进展
第2章 高致病性PRRSV双抗夹心ELISA抗原检测试剂盒的研制
2.1 材料
2.1.1 毒株、细胞与菌株
2.1.2 载体和质粒
2.1.3 抗体、酶和相关试剂
2.1.4 培养基与抗生素及其配制
2.1.5 主要缓冲液与相关试剂及其配制
2.1.6 实验动物
2.2 方法
2.2.1 细胞培养和病毒增殖
2.2.2 病毒RNA的提取
2.2.3cDNA的合成
2.2.4 ORF7基因的扩增
2.2.5 限制性内切酶酶切反应
2.2.6 PCR产物或酶切产物的电泳检测
2.2.7 PCR产物或酶切产物的回收与纯化
2.2.8 外源DNA片段与质粒载体的连接反应
2.2.9 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)
2.2.10 连接产物的转化
2.2.11 质粒的小量制备
2.2.12 诱导表达
2.2.13 SDS-PAGE电泳
2.2.14 Western blot检测分析
2.2.15 免疫原的制备
2.2.16 免疫程序
2.2.17 SP2/0骨髓瘤细胞的活化
2.2.18 SP2/0骨髓瘤细胞的制备
2.2.19 免疫脾细胞的制备
2.2.20 饲养细胞的制备
2.2.21 细胞融合
2.2.22 阳性杂交瘤细胞的筛选
2.2.23 杂交瘤细胞的克隆化
2.2.24 单克隆抗体的生产
2.2.25 单克隆抗体特性的鉴定
2.2.26 单克隆抗体的纯化
2.2.27 标准阴、阳性对照的制备
2.2.28 双抗体夹心ELISA检测方法条件的优化
2.2.29 单抗包被板的制备
2.2.30 单抗与PRRSV经典毒株和变异毒株反应性的研究
2.2.31 特异性检验
2.2.32 敏感性检验
2.2.33 重复性检验
2.2.34 符合率检验
2.2.35 试剂盒的稳定性检测
2.2.36 人工接种动物的抗原消长规律的研究
2.3 结果与分析
2.3.1 PRRSV ORF7基因的RT-PCR结果
2.3.2 原核表达质粒的构建
2.3.3 重组N蛋白的原核表达
2.3.4 Western Blotting检测
2.3.5 免疫原的制备
2.3.6 细胞融合及阳性杂交瘤细胞株的筛选
2.3.7 单抗腹水的制备
2.3.8 单抗效价的测定
2.3.9 单抗与PRRSV的反应性研究
2.3.10 单抗亚类的鉴定
2.3.11 单抗的纯化
2.3.12 包被抗体和酶标记物的选择
2.3.13 方阵滴定确定包被抗体和酶标记物的浓度
2.3.14 抗原和包被单抗最佳反应时间的确定
2.3.15 酶标记物与抗原最佳反应时间的确定
2.3.16 底物液最佳反应时间的确定
2.3.17 临界值的确定
2.3.18 ELISA操作程序的确定
2.3.19 经典毒株和变异毒株的检测
2.3.20 特异性检测
2.3.21 敏感性检测
2.3.22 重复性检测
2.3.23 符合率检测
2.3.24 稳定性检测
2.3.25 人工感染动物的抗原消长规律的研究
2.4 讨论
2.4.1 ORF7基因的原核表达
2.4.2 抗PRRSV N蛋白单克隆抗体的制备
2.4.3 双抗夹心ELISA抗原检测试剂盒的研制
2.5 小结
第3章 伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒(rPRV-PRRSV)重组基因工程疫苗的研究
3.1 材料
3.1.1 毒株、细胞与菌株
3.1.2 载体和质粒
3.1.3 抗体、酶和相关试剂
3.1.4 培养基与抗生素及其配制
3.1.5 免疫反应试验所用抗原及血清
3.1.6 主要缓冲液与相关试剂及其配制
3.2 方法
3.2.1 细胞培养和病毒增殖
3.2.2 感染病毒的细胞样品总RNA的提取
3.2.3 总cDNA的合成及各个基因的PCR扩增
3.2.4 限制性内切酶酶切反应
3.2.5 PCR产物或酶切产物的电泳检测
3.2.6 线性质粒DNA末端去磷酸化
3.2.7 PCR产物或酶切产物的回收与纯化
3.2.8 外源DNA片段与质粒载体的连接反应
3.2.9 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)
3.2.10 连接产物的转化
3.2.11 质粒的制备与鉴定
3.2.12 重组伪狂犬病毒(PRV)基因组DNA的提取
3.2.13 脂质体共转染法
3.2.14 重组病毒的空斑纯化
3.2.15 PCR检测目的外源基因在重组病毒中的整合
3.2.16 Southern blot印迹分析
3.2.17 Western blot检测目的蛋白在真核细胞中的表达
3.2.18 GP5-ELISA试验
3.2.19 半数细胞培养物感染量(TCID50)的测定
3.2.20 微量中和试验(固定病毒-稀释血清法)
3.2.21 构建重组杆状病毒的操作流程及示意图
3.2.22 重组穿梭载体(Bacmid)的构建
3.2.23 重组穿梭载体(Bacmid)的提取
3.2.24 重组杆状病毒获得及毒价测定
3.2.25 重组杆状病毒转导哺乳动物细胞
3.2.26 小鼠脾淋巴细胞的制备
3.2.27 样品总RNA的提取及cDNA的合成
3.2.28 SYBR Green Ⅰ实时定量PCR
3.2.29 相对mRNA表达水平的计算
3.2.30 IFN-γ的定量检测(双抗体夹心ELISA)
3.2.31 动物实验
3.2.27 统计学方法
3.3 结果与分析
3.3.1 转移质粒pgG-CMV-EGFP的构建
3.3.2 转移质粒pgG-CMV-ORF2m-ORF5mut的构建
3.3.3 转移质粒pgG-CMV-ORF545-2m的构建
3.3.4 重组病毒的构建与纯化
3.3.5 重组病毒的Southern杂交鉴定
3.3.6 重组病毒的Western blot鉴定
3.3.7 免疫小鼠抗PRV特异性抗体的检测
3.3.8 免疫小鼠特异性针对PRRSV GP5的ELISA抗体
3.3.9 免疫小鼠特异性针对PRRSV的中和抗体
3.3.10 ELISA方法分析免疫小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ水平
3.3.11 实时荧光定量PCR检测小鼠脾细胞中IFN-γ mRNA表达
3.4 讨论
3.5 小结
第4章 杆状病毒表达系统介导的高致病性猪繁殖与呼吸综合征基因工程疫苗研究
4.1 材料
4.2 方法
4.3 结果与分析
4.3.1 转移质粒pFastBac-CMV-3456的构建
4.3.2 重组Bacmid-CMV-3456的构建
4.3.3 重组杆状病毒BV-CMV-3456的获得
4.3.4 外源基因在哺乳动物细胞内的转录与表达
4.3.5 重组病毒的纯化与毒价测定
4.3.6 免疫小鼠的ELISA抗体水平
4.3.7 免疫小鼠的中和抗体水平检测
4.3.8 实时荧光定量PCR检测免疫小鼠脾细胞中IFN-γ mRNA表达
4.3.9 免疫小鼠脾细胞分泌的IFN-γ水平分析
4.4 讨论
4.5 小结
参考文献
致谢
个人资料
教育经历