一种产耐高温碱性木聚糖酶的嗜热芽孢杆菌及其应用

摘要

本发明公开了一种产耐高温碱性木聚糖酶的嗜热芽孢杆菌（Bacillus thermophilus）701，属于微生物发酵技术领域。是从造纸厂采集土样分离出一株嗜热芽孢杆菌，经反复的紫外诱变及亚硝基胍诱变筛选获得，特性是耐高温、耐碱性强。该菌株已于2013年10月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2013537。本发明的嗜热芽孢杆菌701所制备的耐高温碱性木聚糖酶比活力为350-420IU/ml,，适用温度范围为40-75℃，最适反应温度65℃，在75℃酶活完全稳定；适用反应pH值范围为5.0-11.0，在pH值为11.0时酶活完全稳定，最适反应pH值为10.0。

说明书

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体是一种产耐高温碱性木聚糖酶的嗜热芽孢杆菌及其应用。 

背景技术

纤维素、半纤维素和木质素是植物半纤维素的主要成分，它们共同作用构成了植物细胞壁的支撑骨架，在三者之中半纤维素占据了植物干重的35%以上，半纤维素也是多种复合聚糖的总称，其主要成分为木聚糖，它是一种复杂的多聚五碳糖。木聚糖的主链是通过β-1-4糖苷键把多个吡喃木糖基连接起来，侧链上连接着不同的取代基，这样有乙酰基、葡萄糖醛酰基、L-阿拉伯糖基等（Collins et al.,2005）。所以木聚糖的完全降解就需要多种酶的共同参与。一般将木聚糖分为硬木木聚糖和软木木聚糖。硬木木聚糖主要是由0-乙酰-4-0-甲基葡萄糖醛酰木糖聚合而成，以β-1-4糖苷键相连。软木聚糖由阿拉伯4-0-甲基葡萄糖醛酰木糖残基聚合而成（Beg et al，2001）。有的分类方法也把木聚糖分为可溶性木聚糖和不可溶性木聚糖。 

木聚糖酶（1,4-β-D-xylanase:EC3.2.1.8）是一种重要的工业用酶，在分解木聚糖时起生物催化作用，可以将木聚糖分解成多糖或单糖的蛋白质或RNA。木聚糖酶广泛存在于自然界的生物体中。细菌、真菌、动物体内等都能产生木聚糖酶。 

由于木聚糖酶在工业上潜在的应用价值，在近十年内引起了人们的更多注意，其中碱性木聚糖酶主要应用于纸浆和造纸企业。碱性木聚糖酶在造纸行业中的应用主要包括制浆、协助漂白、改纤维性质、废纸脱墨等方面。 

在工业生产中，制浆过程是在碱性的条件下，用高温蒸煮的方法除去木质素，为使溶解制浆纤维素纯度达到98%，这就需要大量的氢氧化钠处理纸浆，造成了严重的环境污染，为此许多学者转而尝试生物处理制浆，而用于制浆漂白的木聚糖酶应是耐热和耐碱的。冯建良等（Kimura et al.2000）用木聚糖酶预处理麦草与常规化学法制浆进行了比较试验，木聚糖酶预处理提高了原料的脱木素程度，还可以降低制浆的卡伯值。木聚糖酶在辅助漂白方面有较广泛而深入的研究，且取得了很大成果。研究发现，无论是针叶木浆、阔叶木浆或是竹浆、草浆，木聚糖酶均可以降解纸浆中残余的木质素，提高了白度(AL BALAA et al,2006；Meek and Lipman,1922)。用于纸浆漂白的木聚糖酶必须具有耐高温特点，Khasin等得到了一个来源于碱性菌株Bacillus sterarothermophilus T26木聚糖酶，该木聚糖酶在pH9.0及65℃时对纸浆有最好的漂白效果（Khasin et al,1993），很多木聚糖酶不具备这样的特点，限制了商 业化应用。全世界每年产生的废纸数量是惊人的，废纸回收后再利用工作就变得尤为重要了，可以使在资源重复利用的同时也保护了环境。1991年，由韩国学者首次报道了应用木聚糖酶能将油墨从新闻废纸浆中脱除。此后，人们开始研究利用木聚糖酶进行废纸脱墨，以减轻或消除化学脱墨带来的环境污染（曹军卫等，2004）。 

目前，以无元素氯和全无氯漂白工艺为代表的纸浆绿色清洁漂白已经成为世界各国造纸业纸浆漂白发展的必然趋势，木聚糖酶酶法助漂新工艺已在欧洲和北美洲的30余家大型纸厂得到应用，成为生物技术在造纸工业应用最成功的一例。其中加拿大有约10%的硫酸盐法纸浆厂采用了该项新工艺。丹麦诺维信公司和美国山道斯化学公司等多家酶制剂厂商，纷纷推出了专门用于制浆处理的木聚糖酶和纤维素酶新产品，但到目前为止，工业上应用于纸浆漂白的木聚糖酶大多是中性偏酸的，最适反应温度大多在50℃左右，众所周知，纸浆蒸煮和漂白基本都是在高温和强碱的条件下进行的，使得现有的低温酸性木聚糖酶产品在此领域的应用受到极大的限制，另外，在饲料和食品领域，木聚糖酶应用在饲料的造粒和食品的焙烤工序中，仍然要求所用的木聚糖酶在高温条件下能够保持较高的酶活，因此，研究开发耐高温的木聚糖酶产品将会带来良好的经济效益和社会效益。 

从天然微生物中筛选性质更为优良的木聚糖酶产酶菌，是一个有效获得高产木聚糖酶菌株的一个最有效的手段。自从木聚糖酶具有生物漂白功能以来，人们把更多的目光投向了碱性木聚糖酶，筛选了很多具有应用前景的碱性木聚糖酶的生产菌株，分离了很多碱性木聚糖酶。1973年，Horikoshi等首次发现了来自碱性细菌中的木聚糖酶（Horikoshi and Atsukawa,1973），从碱性细菌Bacillus sp.No.C25922中纯化得到木聚糖酶，它的最适PH为6-8。之后，发现了来自碱性细菌Bacillus No.C2125的2个木聚糖酶：木聚糖酶A及木聚糖酶N，其中木聚糖酶A在pH12时也有一定的酶活（Honda et al,1985）。Dey等（Dey et al,1992）分离的嗜碱嗜热菌Bacillus sp.(NCIM59)，能产生2个没有纤维素酶活性的木聚糖酶，它们具有很好的耐碱性，最适pH为10.0。Nakamura等报道了来源于碱性菌株Bacillus sp.41M21的胞外木聚糖酶J它的最适pH为9.0（Nakamura et al，1993）。大多数真菌产生的木聚糖酶一般为酸性木聚糖酶，但也有例外，Taneja等筛选到一株嗜碱真菌AspergillusnidulansKK299，它产的木聚糖酶的最适pH为8（Taneja et al，2002），并且该酶对硬木木聚糖比软木木聚糖有更高的亲和性。 

中国专利CN101701205A公开了一种耐碱性木聚糖酶XynE2及其基因和应用，所产耐碱性木聚糖酶最适pH值7.8，最适温度65℃；中国专利CN102586134B公开了一株生产耐碱耐盐木聚糖酶的海洋绿色产色链霉菌菌株及其应用，所产木聚糖酶最适pH值6.0，最适温度70℃；中国专利CN102321558A公开了一种耐高温木聚糖酶的高产菌种及利用该菌发酵产耐 高温木聚糖酶的方法及得到的酶，所产耐高温木聚糖酶最适pH值7.0，最适温度60℃。 

由此看来，国际及国内诸多专家、学者及科研工作人员不惜资金、人力和时间，加大了对耐高温、耐碱性木聚糖酶的研发力度，旨在将生物技术在造纸、食品、饲料等领域的应用推向一个更高、更新、更强的新时代，无论是新菌种的获得，还是采用基因重组技术，虽然耗费了如此之大的财力及精力，但结果不尽人意，很难达到耐高温、耐碱性木聚糖酶的研发目标及要求，要么耐温不耐碱；要么耐碱不耐温；要么耐碱耐高温范围不宽泛；要么木聚糖酶不纯并有纤维素酶活性；要么作用底物不适等等，分离选育一种产耐高温碱性木聚糖酶的优良菌株是一种必要。 

发明内容

本发明的目的是提供一种产耐高温碱性木聚糖酶的嗜热芽孢杆菌（Bacillus thermophilus）701。 

本发明提供的产耐高温碱性木聚糖酶的嗜热芽孢杆菌701是从湖南省雪丽造纸厂采集土样分离出一株嗜热芽孢杆菌HYX0021，经反复的紫外诱变及亚硝基胍诱变筛选获得，特性是耐高温、耐碱性强。 

本发明提供的产耐高温碱性木聚糖酶的菌株具体为嗜热芽孢杆菌（Bacillus thermophilus）701。该菌株已于2013年11月3日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学生命科学学院，邮编：430072），保藏号为CCTCC NO：M2013537，分类命名为嗜热芽孢杆菌（Bacillus thermophilus）701。 

本发明提供的嗜热芽孢杆菌701是革兰氏阳性，杆菌，好氧，产芽孢，在LB固体培养基上37℃培养24h，菌落呈圆形，菌落直径约为1.0-2.0㎜，乳白色，表面光滑，不透明，边缘不规则扩展。周生鞭毛，能运动，无荚膜，有芽孢，菌体大小为(0.7～0.9)μm×(3～3.5)μm，芽孢（0.6～0.9）μm×（1.0～1.5）μm，椭圆状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。液体培养基中生长时，形成皱醭。酪蛋白水解实验、淀粉水解实验、明胶液化实验、硝酸盐还原实验均为阳性；菌体能够利用葡萄糖、果糖、蔗糖，不能利用乳糖以及甘露醇；H₂S、接触酶实验、吲哚试验实验均为阴性。 

本发明提供的嗜热芽孢杆菌701进行16sRNA基因测序，将所得到的序列用Blast软件和Genbank中已有的16SrDNA序列进行同源性比较，利用软件MEGA4.0构建进化树，结果显示本发明菌株与嗜热芽孢杆菌（Bacillus thermophilus）聚为一支，序列相似性均为98％，综合701菌株的形态学特征、生理生化特征及16S rDNA核苷酸序列同源性分析结果，将菌株701鉴定为嗜热芽孢杆菌（Bacillus thermophilus）。 

本发明提供的嗜热芽孢杆菌701所制备的耐高温碱性木聚糖酶比活力为350-420IU/mL,，适用温度范围为40-75℃，最适反应温度65℃，在75℃酶活完全稳定；适用反应pH值范围为5.0-11.0，在pH值为11.0时酶活完全稳定，最适反应pH值为10.0。 

按诱变筛选方案，对突变株逐级筛选淘汰，最后对优良菌株经发酵性能测试筛选，得到一株产耐高温碱性木聚糖酶的菌株嗜热芽孢杆菌701，发酵液碱性木聚糖酶比活力为350-420IU/mL，对酶的热稳定性进行了分析，将粗酶液分别置于40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃下，每隔10分钟取样测定酶活。40℃、45℃、50℃、55℃下，60分钟酶活没有下降。60℃与65℃下，30分钟降到原有酶活的95％，60分钟降到85％。70℃下，30分钟降到原有酶活的85％，60分钟降到80％。75℃下，30分钟降到原有酶活的80％，60分钟降到70％。 

本发明的另一目的是嗜热芽孢杆菌701在制备耐高温碱性木聚糖酶中的应用。 

有益效果： 

本发明的嗜热芽孢杆菌701所制备的耐高温碱性木聚糖酶比活力为350-420IU/mL,，适用温度范围为40-75℃，最适反应温度65℃，在75℃酶活完全稳定；适用反应pH值范围为5.0-11.0，在pH值为11.0时酶活完全稳定，最适反应pH值为10.0。 

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。 

实施例1：出发菌株的筛选 

（1）从湖南省雪丽造纸厂造纸废浆中采集2g土样，加到含有50mL冷却无菌水的小三角瓶中，摇床200r/min，摇动20min，然后放在80℃水浴锅中，水浴10min，不断摇动三角瓶混匀土样，静置5min吸取上清液100μL，依次梯度稀释到10^-1～10^-9浓度，选取10^-3，10^-4，10^-5，10^-6浓度涂布牛肉膏蛋白胨平板，37℃培养24h，继续30℃培养24h。 

（2）根据微生物菌落的形状、大小、表面结构、边缘结构、质地、光泽、透明度、颜色和产生的可溶色素等方面的特征，用接种环将孤立的单个菌落挑出，移到筛选培养基平板上，并编号，34℃培养48h。 

所述筛选培养基组成为：牛肉膏3g，氯化钠5g，蛋白陈10g，琼脂粉15g，蒸馏水l000mL，pH7.2，121℃灭菌20min。 

（3）待菌株在平板上培养48h后，将不同编号平板上的优势菌落接种到筛选培养基斜面上，保藏以供复筛使用。 

（4）将保藏的不同编号的菌株分别接种到斜面活化2次后，将活化好的菌种接入种子培养基，180r/min，37℃，培养18h。再按5%的接种量接种到发酵培养基，200r/min，28℃，发酵48h。将所得发酵液10000r/min离心去菌体，发酵液上清液进行碱性木聚糖酶活力测定实验。 

所述种子发酵培养基组成为：葡萄糖2g，蛋白胨1g，NaH₂PO₄·2H₂O0.2g，Na₂HPO₄·2H₂O0.4g，MgSO₄·7H₂O0.05g，蒸馏水100mL，pH7.4，121℃灭菌20min。 

所述发酵培养基组成为：葡萄糖2g，蛋白胨2g，NaH₂PO₄·2H₂O0.02g，Na₂HPO₄·2H₂O0.04g，MgSO₄·7H₂O0.01g，CaCl₂0.01g，MnSO₄0.002g,蒸馏水l00mL pH7.4，121℃灭菌20min。 

（5）挑选产碱性木聚糖酶酶活力强的菌株进行甘油保存，得到本发明菌株的出发菌株HYX0021。 

实施例2菌株的诱变筛选 

（1）紫外线诱变 

吸取出发菌株HYX0021培养10-12h菌液，注入平面皿中，每个平面皿的菌液量为10mL。将盛有菌液的平皿置于诱变箱内紫外灯管下的磁力搅拌器上，平皿距紫外灯管的垂直距离为30cm。打开紫外灯，预热30min，使光波稳定。调节搅拌子的转速，转速稳定后，打开平皿盖子照射，并开始计时，平皿的照射时间分别为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10min。从每个平皿中取出0.1mL的菌悬液，做适当稀释，得不同稀释度的菌悬液。吸取稀释后的菌悬液0.3mL涂布分离培养基平板，置于恒温箱培养(为避免光复活平皿需用黑纸或牛皮纸包裹，整个诱变操作过程均在红光下进行)。 

（2）亚硝基胍诱变 

将亚硝基胍少许粉末置于平板培养基中央，培养过程中，亚硝基胍逐步扩散、在平板上形成自中央向外的浓度梯度，经培养可出现以平板中央为圆心的同心圆菌落群，平板中央临近区域菌落数为零，平板边缘区域菌落依次增多。出发菌种在不同致死率下产生不同程度变异菌种。 

（3）平板初筛 

利用透明圈大小进行初筛。将诱变后长出的菌落点种在分离平板上，34-35℃培养10-15h后，观察其周围透明圈大小，选取桦木木聚糖透明圈直径与菌落直径比值较大的菌落进行摇瓶复筛。 

所述分离平板培养基组成为：酵母粉0.2%，桦木木聚糖0.2%，蛋白胨0.5%，牛肉膏0.7%，磷酸氢二钾1.0%，氯化钠0.1%，琼脂1.8%，不足部分纯净水补足，pH7.0-8.0，121-123℃灭菌30-40min。 

（4）摇瓶复筛 

将初筛得到的菌落接种于复筛培养基中，34℃培养48小时，检测碱性木聚糖酶酶活。 

所述复筛培养基组成为：酵母粉0.2%，葡萄糖1%，蛋白胨0.4%，玉米粉0.6%，磷酸氢二钾0.8%，不足部分纯净水补足，pH7.0-8.0，121-123℃灭菌30-40min。 

（5）菌株稳定性检测： 

将复筛所得高酶活菌株进行传代培养，并跟踪摇瓶检测其酶活。经摇瓶复筛，最终确定了一株生产菌，并将其命名为701，该菌株的特性是产碱性木聚糖酶效率高，稳定性好。 

高产菌株701连续传代6次的摇瓶结果如表1所示： 

表1.菌株701稳定性检测结果 

  摇瓶酶活力（IU/mL） 相对酶活力（%） F1 380 100 F2 382 100.6 F3 388 102.0 F4 378 99.5 F5 388 102.3 F6 387 101.9

实施例3：菌株鉴定 

菌株生理生化鉴定：按照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第九版)方法进行碳源利用试验、过氧化氢酶试验、硫化氢试验、吲哚试验、硝酸盐和亚硝酸盐还原试验等试验；形态学鉴定：将待鉴定的菌株分别点种于牛肉膏蛋白胨培养基固体平板上，37℃培养2d，描述并记录菌落培养特征以及菌体形态特征。生理生化鉴定特征如表2所示。表中结果对照《伯杰氏细菌鉴定手册》与嗜热芽孢杆菌种属特征相符。分子生物学鉴定：细菌基因组DNA的提取参照《分子克 隆实验指南》（第3版）的方法。依据细菌16S rDNA中最保守的序列设计引物。引物F：5'-AGA GTT TGA TCM TGGCTC AG-3'；引物R：5'-AAG GAG GTG WTCCAR CC-3'由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反应条件：94℃5min，94℃30s，55℃40s，72℃2min，30个循环，72℃终延伸10min。PCR扩增产物送到北京三博远志生物技术有限公司测序。测序结果进行双向拼接后，将得到的16S rDNA序列提交到NCBI核酸数据库中进行BLAST在线分析。之后从NCBI的GenBank核酸数据库中随机选取报道中的部分芽孢杆菌16S rDNA序列，应用ClustalⅩ1.81和Phylodraw082软件构建系统进化树并分析。结合菌株的形态和生理生化特征，初步鉴定将701菌株暂定为嗜热芽孢杆菌。 

表2菌株701形态学及生理生化特性 

注：结果“+”表示阳性；“–”表示阴性。 

实施例4：碱性木聚糖酶的热稳定性分析 

对酶的热稳定性进行了分析，将实施例2粗酶液分别置于40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃下，每隔10分钟取样测定酶活。粗酶液40℃、45℃、50℃、55℃下，60分 钟酶活没有下降。60℃与65℃下，30分钟降到原有酶活的95％，60分钟降到85％。70℃下，30分钟降到原有酶活的85％，60分钟降到80％。75℃下，30分钟降到原有酶活的80％，60分钟降到70％，与现有技术相比达到同样的酶活，耐受温度较高。 

实施例5：碱性木聚糖酶pH稳定性分析 

对酶的pH稳定性进行了分析，将实施例2粗酶液分别置于pH值4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0下，每隔10分钟取样测定酶活。粗酶液pH值6.0、7.0、8.0、9.0下，60分钟酶活没有下降。pH值5.0与10.0下，30分钟降到原有酶活的95％，60分钟降到85％。pH值4.0与11.0下，30分钟降到原有酶活的80％，60分钟降到70％。同样条件下达到同样酶活耐pH值比现有技术菌株明显宽泛。