阻断西妥昔单抗和EGFR结合的抗体、其试剂盒及杂交瘤细胞

摘要

本发明公开了一种阻断西妥昔单抗和EGFR结合的抗体、其试剂盒及杂交瘤细胞，所述抗体包括SEQ NO.：4、SEQ NO.：5、SEQ NO.：6中至少一个表示的氨基酸序列。所述抗体能够特异性结合西妥昔单抗，并实现阻断西妥昔单抗与EGFR结合的功能。所述抗体可用作评估西妥昔免疫原性的阳性对照，用于监测该评估方法的敏感性和特异性。还可用于监测西妥昔单抗生物活性测定方法的敏感性及特异性。本发明还公开了一种分泌该抗体的杂交瘤细胞和利用该抗体的试剂盒。本发明还提供了评估抗体中和性能的方法。

说明书

技术领域

本发明属于杂交瘤制备单克隆抗体技术领域，涉及单抗的制备，及单抗 结合活性的测定。

本发明提供了分离的抗西妥昔单抗的抗体，该抗体还能够阻断西妥昔与 其受体表皮生长因子受体(EGFR)的结合。在临床分析西妥昔单抗的免疫 原性方面可以发挥重要作用，可以作为阳性对照，监测评估免疫原性试验的 敏感性和特异性。

背景技术

近年来，抗体药物以其安全有效、特异性高等优点被广泛应用于肿瘤、 移植排异、感染性疾病、自身免疫疾病等多种疾病的临床治疗。但选用抗体 药物进行治疗会出现一个不容忽视的问题，即抗体免疫原性对治疗的影响， 这些免疫原性不但会引起机体的急性过敏反应，同时对药物本身也具有竞争 抑制作用。对抗体药物免疫原性的检测是生物技术药物申请临床试验和注册 的重要内容。尽管在动物模型中显示免疫原性并不一定预期在人体也会出现 免疫反应，但评价药物引起的免疫反应仍显得十分重要。

西妥昔单抗是一种以EGFR为特异性靶点的重组人鼠嵌合型IgG1单克 隆抗体，它能竞争性抑制其他配体与EGFR的结合，抑制下游信号通路的激 活，促进肿瘤细胞凋亡。经美国食品药物管理局批准可使用于治疗转移型结 肠直肠癌和头颈癌。由于西妥昔单抗的可变区是鼠源的，相对于人源抗体， 更容易引起机体的免疫原性，临床上需要评估其免疫原性。目前，评估抗体 药物的免疫原性主要从两个方面进行，一方面是检测病人有没有产生抗药抗 体，另一方面检测病人产生的抗药抗体有无阻断药物与靶位点结合的能力， 即抗体的中和性能。在各种评估免疫原性的检测方法中，都需要有阳性对照， 用于监测方法的敏感性和特异性。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性结合西妥昔单抗，并能够阻断西妥昔单 抗与EGFR结合的单抗，可以作为研究西妥昔免疫原性的阳性对照。

本发明提供了一种抗体，所述抗体包括SEQ NO.：5、SEQ NO.：6、SEQ NO.： 7中至少一个表示的氨基酸序列。

在一个实施方式中，所述抗体包括具有由SEQ NO.：1的核酸序列编码的 轻链可变区和SEQ NO.：3的核酸序列编码的重链可变区。

在一个实施方式中，所述抗体包括具有SEQ NO.：2的氨基酸序列的轻链 可变区和具有SEQ NO.：4的氨基酸序列的重链可变区。

在一个实施方式中，所述抗体能够阻断西妥昔单抗与EGFR的结合。

本发明还提供了一种用于检测西妥昔单抗免疫原性的试剂盒，包括上述抗 体作为阳性对照。

在一个实施方式中，所述试剂盒用于在动物实验或临床实验研究西妥昔单 抗的药理和药物代谢。在一个实施方式中，所述试剂盒用于研究在受试者体内 是否存在抗西妥昔的单抗。

本发明还提供了一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株分泌能够特异性结 合西妥昔单抗的抗体，所述抗体能够阻断西妥昔单抗和EGFR的结合。

本发明的又一个实施方式提供所述抗体的用途，所述抗体用于在动物实验 或临床实验研究西妥昔单抗的药理和药物代谢。在另一个实施方式中，所述抗 体用于研究在受试者体内是否存在抗西妥昔的单抗。在一个优选实施方式中， 所述受试者为人。

附图说明

图1为ELISA检测15-B2-4-1与商品化西妥昔单抗Erbitux的结合特异性 的结果。

图2为Erbitux的标准曲线。

图3为ELISA评价15-B2-4-1中和性能的结果曲线。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解， 下面结合具体图示，进一步阐述本发明。

具体而言，涉及四个方面：一，单克隆抗体15-B2-4-1的制备过程；二， 单克隆抗体15-B2-4-1与西妥昔单抗结合的特异性；三，单克隆抗体15-B2-4-1 的中和性能；四，单克隆抗体15-B2-4-1的氨基酸序列。

1.杂交瘤技术制备单克隆抗体

主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选、杂交瘤细胞的 克隆化、单抗的制备等。

(1)动物免疫：采用6周龄BALB／C雌鼠。抗原为商品化的西妥昔单抗 Erbitux。常规免疫法，免疫途径为皮下注射。用50ug Erbitux与福氏完全佐剂 等体积混合，于小鼠背部皮下分3到4点注射；经两周后进行二次相同剂量免 疫，用福氏不完全佐剂；两周后进行三次免疫，用福氏不完全佐剂；两周后加 强免疫，用福氏不完全佐剂；3天后取脾细胞进行融合。

(2)细胞融合：最后一次免疫后第三天制备。

脾细胞悬液的制备，于细胞融合当天制备。取已经免疫的BALB／c小鼠， 摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时颈脱位致死 小鼠，取其脾脏，制备脾细胞悬浮液。

骨髓瘤细胞悬液的制备，提前两周复苏细胞，保证使用时细胞处于对数生 长期。

饲养层细胞的制备，提前两天获得小鼠腹腔巨噬细胞，加入96孔板培养。

细胞融合，采用PEG介导融合方法。取脾细胞与骨髓瘤细胞按照5∶1的比 例，在无血清的DMEM培养基中混匀，1500rpm离心5分钟，去掉上清，用力 振动离心管，振散细胞，在1分钟内加入1ml50％PEG(pH8.0，40℃)融合细 胞，边加边摇动，加完后静置90秒。加入无血清的DMEM培养基终止融合， 1500rpm离心5分钟，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的 细胞板中，37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养。

(3)杂交瘤细胞筛选

细胞培养箱中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培 养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10％-50％时，常规间接ELISA方法筛选 阳性孔。用Erbitux包板，检测杂交瘤细胞培养上清，二抗为酶标记羊抗鼠抗体， 小鼠抗血清作为阳性对照。筛选出抗体表达量高的杂交瘤细胞。

(4)杂交瘤细胞克隆化

筛选出的特异性强阳性孔用常规的有限稀释法克隆，获得单抗细胞株：15 -B2-4-1。

从原始孔中得到的阳性杂交瘤细胞，可能来源于二个或者多个杂交瘤细 胞，他们分泌的抗体是不同质的。为了得到完全同质的单克隆抗体，必须对杂 交瘤细胞进行克隆化。

制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含20％血清的HT培养基稀释至每毫升 含8个细胞，同时在杂交瘤细胞悬液中加入小鼠腹腔细胞，每毫升加入5E4个 细胞。按每孔接种0.1ml细胞悬液，即每孔含0.8个杂交瘤细胞。

37℃、7.5％CO2湿润培养7-10天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体； 在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测。

取抗体检测阳性孔的细胞扩大培养，并冻存。同时再进一步对阳性孔的细 胞进行克隆化。用ELISA的方法对克隆化的单抗进行鉴别。筛选出阳性克隆细 胞株：15-B2-4-1。

(5)制备抗体

将筛选出的杂交瘤细胞进行扩大培养。取6周龄左右的小鼠，腹腔注射 0.5ml石蜡油，一周后腹腔注射2E6个杂交瘤细胞，注射后7天可见小鼠腹部 明显变大，收集腹水，离心取上清，获得单克隆抗体腹水。用proteinA的吸附 柱纯化抗体，最终获得纯化后的单克隆抗体15-B2-4-1。

2.评估抗体15-B2-4-1与西妥昔单抗的结合特异性。

具体步骤：

(1)包被：用包被缓冲液分别稀释Erbitux，对照Herceptin及Enbrel至 5ug／ml，分别加入到不同的96孔板上，100ul/孔。2-8℃过夜。

(2)洗板：用洗液洗板3次，300ul/孔。

(3)封闭：200ul／孔0.1％BSA溶液，室温2.5小时。

(4)洗板：用洗液洗板3次，300ul/孔。

(5)稀释样品：用缓冲液稀释抗体15-B2-4-1，然后连续2倍稀释，400ng/ml， 200ng／ml，100ng／ml，50ng／ml，25ng／ml，12.5ng/ml，6.25ng／ml，3.12ng／ml， 1.56ng/ml，0.78ng／ml，0.39ng/ml，0.19ng／ml。

(6)将稀释好的样品转移到96孔板，100ul／孔。

(7)孵育：2-8℃过夜孵育。

(8)洗板：用洗液洗板3次，300ul/孔。

(9)酶结合物：羊抗鼠IgG Fc片段酶结合物IgG-HRP，用缓冲液稀释1∶ 8000，100ul／孔。37℃孵育30分钟。

(10)洗板：用洗液洗板3次，300ul／孔

(11)底物：加新鲜配制的底物，100ul/孔，37℃孵育6分钟。

(12)终止：2M H2SO4，50ul／孔。

(13)测定：酶标仪读数，波长450nm。

(14)结果：用GraphPad Prism5软件进行数据处理。采用4-参数方程。 结果见图1。

图1.ELISA检测15-B2-4-1与商品化西妥昔单抗Erbitux的结合特异性。 Herceptin与Enbrel是另外两个商品化的单抗药物。结果显示，15-B2-4-1不与 Herceptin及Enbrel结合，说明15-B2-4-1与Erbitux是特异性结合。

3.细胞ELISA评定15-B2-4-1的中和性能。

3.1做出Erbitux与EGFR结合反应的标准曲线。具体步骤如下：

(1)接种A431细胞到96孔细胞培养板，1E5／ml，每孔0.1ml。A431细 胞膜上能表达受体EGFR，可以跟西妥昔单抗特异性结合。

(2)培养24小时后，取出细胞培养板，用4％福尔马林固定细胞15分钟。

(3)去掉固定液，1X PBST洗板。

(4)1％BSA封闭细胞板，150ul／孔，室温下放置于摇床上孵育60分钟。

(5)去掉封闭液。立即加入提前倍比稀释好的样品Erbitux，100ul／孔。2-8℃ 反应过夜。样品是1000ng/ml Erbitux，然后连续三倍稀释，1000ng／ml，333.33 ng／ml，111.11ng／ml，37.04ng／ml，12.35ng/ml，4.12ng／ml，1.37ng／ml，0.46ng／ml， 0.15ng/ml，0.05ng／ml，0.02ng/ml，0.005ng／ml。

(6)取出96孔板，用1X PBST洗板。

(7)将酶标二抗1-4-26-HRP加入96孔板，37℃孵育1小时。

(8)1X PBST洗板。

(9)加入显色液TMB，37℃孵育6分钟。

(10)加入2M H2SO4终止反应。

(11)酶标仪读数，波长450nm。

(12)结果：用GraphPad Prism5软件进行数据处理。采用4-参数方程。 结果见图2。

图2为Erbitux的标准曲线。标准曲线达到平台期时，Erbitux的浓度是 50ng／ml。

3.2细胞ELISA评价15-B2-4-1中和性能，具体步骤如下：

本段内容包括一个实验组，一个对照组。对照组完全重复2.1。实验组的 步骤如下：

(1)接种A431细胞到96孔细胞培养板，1E5／ml，每孔0.1ml。A431细 胞膜上能表达受体EGFR，可以跟西妥昔单抗特异性结合。

(2)培养24小时后，取出细胞培养板，用4％福尔马林固定细胞15分钟。

(3)去掉固定液，1×PBST洗板。

(4)1％BSA封闭细胞板，150ul/孔，室温下放置于摇床上孵育60分钟。

(5)去掉封闭液。立即加入提前倍比稀释好的样品Erbitux及15-B2-4-1 混合物，100ul/孔。4℃反应过夜。混合物中Erbitux的浓度是固定的，50ng／ml。 15-B2-4-1有一系列浓度梯度，1500ng／ml，500ng／ml，166.67ng／ml，55.56ng／ml， 18.52ng／ml，6.17ng／ml，2.06ng/ml，0.68ng／ml，0.23ng/ml，0.07ng／ml，0.025ng／ml， 0.008ng／ml。

(6)取出96孔板，用1×PBST洗板。

(7)将酶标抗体1-4-26-HRP加入96孔板，37℃孵育1小时。

(8)1×PBST洗板。

(9)加入显色液TMB，37℃孵育6分钟。

(10)加入2M H2SO4终止反应。

(11)酶标仪读数，波长450nm。

(12)结果：用GraphPad Prism5软件进行数据处理。采用4-参数方程。 结果见图3。

参见图3，对照组为图1试验的重复。在实验组中，曲线随着15-B2-4-1 浓度的升高呈下降趋势，说明15-B2-4-1可以阻断Erbitux与EGFR的结合，具 有一定的中和能力。

4.15-B2-4-1的氨基酸序列

以下为单克隆抗体15-B2-4-1轻链与重链可变区的序列。其轻链可变区的 序列与已知序列如下。重链可变区的序列，序列比对结果显示如下，跟已有序 列都有不同，具有新颖性。

4.1轻链cDNA：SEQ NO.1339个碱基

·GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTACAATCATGTCTGCATCTCCAGG GGAGAAGGTCACCATAACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTTC ATGCACTGGTTCCAGCAGAAGCCAGGCACTTCTCCCAAACTCTGGA TTTATAGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGT GGCAGTGGATCTAAGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCCGAATGGA GGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAAAGGAGTGGTTGG ACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCT GCACCAACTGTATCC

轻链氨基酸序列：SEQ NO.：2，113个氨基酸

DIVLTQSPTIMSASPGEKVTITCSASSSVSFMHWFQQKPGTSPKLWIYST SNLASGVPARFSGSGSKTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSGWTFGGGTKLE IKRADAAPTVS

4.2重链cDNA：SEQ NO.：3393个碱基

·

CAGGTTAAGCTGGAGGAGTCTGGAGGGGGCTTGGTGCAACCTGGAGG ATCCATGAAACTCTCCTGTGTTGCCTCTGGATTCAGTTTCAGTAACTACTG GATGAATTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGCTG AAATTAAATTGAAATCTAATAATTATGCAACACATTATGCGGAGTCTGTGA AAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTG CAAATGAACAACTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACCAG GTGGGATACTCCGACTCTCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTC AGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTAT

重链氨基酸序列：SEQ NO.：4131个氨基酸

·

QVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGMNWVRQSPEKGLEW VAVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGYAMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVY

·粗体加下划线所示的序列为高可变区序列CDR1(SEQ NO.：5)，CDR2 (SEQ NO.：6)，CDR3(SEQ NO.：7)。

上述实验结果表明，本发明所述的单抗能够特异性结合西妥昔单抗，并 能阻断西妥昔单抗与EGFR的结合。因此，可以在检测评估免疫原性的相关 检测方法中，用作阳性对照，以监测该检测方法的敏感性和特异性。