一种寡核苷酸和可消除质粒共转化用于大肠杆菌必需基因点突变的方法

摘要

本发明涉及一种利用寡核苷酸和可消除的质粒共转化对大肠杆菌基因组上的必需基因进行点突变的方法。具体为将前面四个碱基以硫磷酰基连接的、长度为91个碱基、中间为突变位点的寡核苷酸和可消除的质粒共转化表达重组酶的大肠杆菌。可消除的质粒含50bp与lacZ基因的同源序列、氨苄青霉素抗性基因、I-SceI基因、两个I-SceI酶切位点和R6K复制子。在由重组酶催化而与基因组50bp lacZ同源片段整合而表现氨苄青霉素抗性的菌株中，筛选点突变的菌株。整合型菌株可通过热失活的氯四环素作用，诱导表达I-SceI，I-SceI作用于其酶切位点，通过两个50bp lacZ片段之间的同源重组而去除可消除的质粒。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一种利用寡核苷酸和可消除的质粒共转化来实现 大肠杆菌必需基因点突变的方法。

背景技术

大肠杆菌是研究的最为透彻，也是具有重要生物学用途和工业实践用途的微生物菌株。 必需基因指对生物体生存所必需的一类基因。大肠杆菌基因组上的必需基因的点突变是研究 基因功能、改变基因所表达的酶的催化特征以及构建新的基因工程菌株的重要手段。

经典的必需基因点突变的方法是首先在构建一个含点突变片段的重组克隆，突变位点两 侧含有用于同源重组的同源片段。所采用的载体常常为需要Pir蛋白进行复制的R6K复制子 或者温度敏感型复制子，利用前者不能再大肠杆菌中复制以及后者在高温下不能复制的特点， 通过突变位点一侧的同源片段整合至大肠杆菌染色体中。载体仍需含有负筛选标记，如编码 蔗糖6-果糖转移酶的sacB基因。利用在培养基中添加10%蔗糖的方法，SacB将蔗糖转化为 有毒性的聚蔗糖，这样促使菌体通过突变位点另外一侧的同源片段进行第二次的同源重组而 去除质粒骨架。此后，PCR扩增目的区域，通过序列测定来确认获得点突变的菌株。此方法 步骤繁琐耗时，涉及多个基因克隆的步骤，且最后一步筛选时，可能恢复至原株的基因型， 获得突变菌株的几率相差较大。而在必需基因突变时，获得原株的几率远远大于突变菌株的 几率，可能需要筛选大量的克隆才能获得目的的突变菌株。

上世纪末发展并逐渐得到广泛应用的重组工程为大肠杆菌必需基因的点突变提供了新颖 的思路。重组工程利用重组酶催化的DNA片段之间的同源重组而进行DNA的修饰和克隆。 目前使用广泛的重组酶来自于lambda噬菌体，分别为编码DNA5'→3外切酶的redα基因， Redα作用于双链DNA得到3'端突出的DNA分子；编码DNA单链结合蛋白的redβ基因， Redβ其结合在3'端突出的DNA分子上，Redβ也是关键的重组酶，即催化同源片段之间同源 重组；redγ基因编码抑制内源性核酸酶的Gam蛋白，Gam保护外源的DNA片段免受内源性 DNA酶的降解。与较传统的DNA克隆和修饰相比，重组工程最为显著的优点表现在：可催 化短至36个碱基的同源片段之间的同源重组，而短的碱基可通过化学合成的PCR引物来获 得，无需多个基因克隆的步骤，这就大大简化了操作流程；可同时针对多个基因、多个位点 修饰进行操作。

对单链寡核苷酸而言，单独的redβ基因即可行使重组功能。利用寡核苷酸对大肠杆菌基 因组进行修饰而实现必需基因的点突变是近年来发展的手段。但由于没有筛选标记，突变效 率一般极低（常在0.1%以下），难以通过常规的方法筛选得到，需要昂贵的高通量仪器和大 量筛选才能运用此手段。有研究人员利用两个寡核苷酸共转化的方法来实现突变，一个为突 变寡核苷酸，另外一个为与基因组上位点重组后可行使正筛选（如抗生素抗性）的寡核苷酸。 但这个突变位点需预先引入，且不能重复使用，这就制约了多重突变。

本专利申请的研究人员曾提出利用重组工程手段，首先通过PCR引入抗性基因盒，再通 过巨型核酸酶I-SceI介导的双链断裂修复的方法实现基因组的点突变（专利公开号： CN102703424A）。虽然有着较高的突变效率，但此方法对必需基因的修饰则方法难以实行， 因为引入抗性基因将破坏必需基因的开放阅读框而使基因失活，菌株不能生存。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种通过寡核苷酸和可消除的质粒共转化对大肠杆菌必需 基因点突变的方法。

具体的实验原理如下。将前面四个碱基以硫磷酰基连接的、长度为91个碱基、中间为突 变位点的寡核苷酸和可消除的质粒pLS1755共转化至表达重组酶的大肠杆菌。磷硫酰键连接 的核苷酸可避免菌体内部核酸酶的降解。pLS1755含50bp与lacZ基因的同源序列、氨苄青 霉素抗性基因，诱导表达的I-SceI基因以及两个I-SceI酶切位点，复制子为R6K。寡核苷酸 和共转化至表达重组酶的大肠杆菌时，由于pLS1755不能自主复制，在氨苄青霉素筛选之下， 重组酶催化的pLS1755所含的50bp和基因组上同源片段发生同源重组，得到pLS1755整合 型菌株。寡核苷酸也同时为重组酶的底物，因此在氨苄青霉素抗性、pLS1755整合的菌株中， 含有一定比例的突变菌株。如此可筛选得到由寡核苷酸突变而引起的必需基因点突变的菌株。

一种利用寡核苷酸和可消除的质粒共转化对大肠杆菌基因组上的必需基因进行点突变的 方法，包括以下步骤：将寡核苷酸和可消除的质粒pLS1755共转化至表达重组酶的大肠杆菌; 筛选氨苄青霉素抗性菌株，再从氨苄青霉素抗性菌株中筛选寡核苷酸发生重组而实现的点突 变菌株；然后将再消除点突变菌株中的质粒pLS1755；所述寡核苷酸长度为91个碱基，第 46个碱基为突变位点，寡核苷酸的前面四个碱基以硫磷酰基连接；所述质粒pLS1755通过以 下构建得到：以pST98-AS为模板，正向引物含酶切位点、50bp LacZ片段和18个碱基的I-SceI 酶切位点，反向引物含酶切位点和18个碱基的I-SceI酶切位点，PCR扩增得到tetR-ptetA-I-SceI 的片段，酶切后克隆至R6K复制子和氨苄青霉素抗性基因的载体。

可消除的质粒pLS1755含50bp与lacZ基因的同源序列、氨苄青霉素抗性基因、可诱导 表达的I-SceI基因以及两个I-SceI酶切位点，复制子为R6K。

所述在氨苄青霉素抗性的菌株中筛选寡核苷酸发生重组而实现的点突变菌株的方法是： 随机挑选氨苄青霉素抗性克隆，分别以之为模板，以根据目的位点两侧的序列所设计的引物 进行菌落PCR，对获得的PCR产物，以一端PCR引物进行测序，通过序列分析筛选得到目 的位点发生突变的克隆。

所述消除点突变菌株中质粒pLS1755的方法是：培养液中加入热失活（加热使之失去抗 菌活性，但保留与调节蛋白TetR的结合活性）的氯四环素诱导I-SceI基因的表达，I-SceI作 用于由于pLS755整合至大肠杆菌基因组而获得的两个I-SceI酶切位点，造成大肠杆菌基因组 的双链断裂，此时菌株利用自身的重组系统，催化两个50bp LacZ片段之间的同源重组而去 除pLS755部分。pLS1755也因此可以重复使用。

pLS1755中的tetR为抑制基因，TetR抑制ptetA启动子的表达。当环境中含有四环素或 其衍生物时，这些诱导剂和TetR相结合而解除TetR的抑制作用，ptetA因此发挥启动子的作 用，驱动下游I-SceI基因的表达。这个诱导表达系统有着很好的严谨性，即I-SceI只有诱导 剂存在时才能表达。

巨型核酸酶I-SceI的设别序列为18个碱基对的5'-TAGGGATAA↓CAGGGTAAT，↓表示 切割位置。这个设别序列只在发现I-SceI基因的酿酒酵母中存在，其他所用已经测序的生物 体基因组（包含大肠杆菌）均无此位点。因此诱导表达的I-SceI只切割由pLS1755整合而引 入的两个I-SceI酶切位点而不会破坏大肠杆菌的基因组结构。

优选实施例中的两个必需基因rpsL和rpoB位点的点突变表明了本方法的适用性。通过 PCR一次筛选20～30个菌株即可获得突变菌株。本方法的优点是：突变寡核苷酸可通过合成 而来；质粒pLS1755可通过培养菌体而大量提取；耗费极少；整合型菌株可简单地通过诱导 培养而消除质粒，如此反复修饰；大肠杆菌原株即可进行操作，无需任何改造。本方法有着 对大肠杆菌基因组上的必需基因以至任何基因进行修饰的潜力。

附图说明

图1是3027个碱基对的用于和寡核苷酸共转化进行必需基因点突变的可消除质粒 pLS1755限制性酶切图谱。其中：

25-74是50bp lacZ是50bp与大肠杆菌lacZ基因上序列一致的同源片段；

两个S是18个碱基对的I-SceI酶切位点，分别为质粒上的75-92和1500-1717；

93-716是抑制基因tetR的开放阅读框序列；

760-766是受tetR调节的启动子ptetA序列；

798-1499是核酸酶I-SceI的开放阅读框序列；

1579-1965是R6K复制子序列；

2035-2895是氨苄青霉素抗性基因Ap的开放阅读框序列；

各基因的箭头方向为阅读框的方向；ClaI，EcoRI，KpnI，SpeI和NdeI等为 常规标识的限制性酶切位点，括号内的数字表示限制性酶切位点在质粒上的位置。

图2.pLS1755整合和消除菌株的基因型分析的凝胶电泳

1.DL2000DNA分子量标准：2.0,1.0,0.75,0.5,0.25,0.1kb；

2.大肠杆菌MG1655原株NI3-NI6PCR扩增的262bp；

3.ApR抗性菌株上游NI3-NI4PCR扩增的567bp；

4.ApR抗性菌株下游NI5-NI6PCR扩增的302bp；

5.pLS1755消除菌株NI3--NI6PCR扩增的262bp。

图3.寡核苷酸和可消除质粒pLS1755共转化实现点突变的示意图

突变寡核苷酸（黑点表示突变的碱基位点）和可消除质粒pLS1755共转化大肠杆菌，同 源重组指重组酶同时催化两个50bp LacZ片段之间以及寡核苷酸和基因组同源片段之间的同 源重组。在氨苄青霉素（Ap）筛选之下得到氨苄青霉素抗性（Ap^R）的突变菌株。此后热失 活的氯四环素诱导I-SceI酶切其作用位点，

发生基因组双链断裂，随后菌株的同源重组功能催化两个50bp LacZ片段之间同源重组去除 载体部分，修复基因组而生存。

图4.rpsL基因点突变测序图

上部分为MG1655原株rpsL区域测序图，原位点为A；下部分为MG1655rpsL基因点突 变菌株的rpsL区域测序图，突变位点为G，密码子（以下划线表示）由AAA突变为AGA。 突变位点为G，密码子（以下划线表示）由AAA突变为AGA。

图5.rpoB基因点突变测序图

上部分为MG1655原株rpoB区域测序图，原位点为C；下部分为MG1655rpoB基因点突 变菌株的rpoB区域测序图，突变位点为T，密码子（以下划线表示）由CCT突变为CTT。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的 含义。

下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只 是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试 剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂 如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例中所用到的菌株和质粒，均为已公开的菌株和质粒：

1.Escherichia coli MG1655。基因型F^-LAM-rph-1，来自美国大肠杆菌保藏中心。

2.Escherichia coli DH10B。基因型F^-mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80dlacZΔM15ΔlacX74 deoRrecA1araD139Δ(ara,leu)7697galUgalKrpsLendA1nupG。文献：Life Technologies,Inc. Focus,1990,12:19。购自美国Invitrogen公司。

3.Escherichia coli BW25141。含Pir基因的大肠杆菌菌株，为含R6K复制子的质粒的宿主菌。

文献：Datsenko KA,Wanner BL.One-step inactivation of  chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products.ProcNatlAcadSci U S A.2000, 97(12):6640-5。来自美国Purdue大学Barry Wanner教授。

4.pKD4。文献：Datsenko KA,Wanner BL.One-step inactivation of chromosomal genes in  Escherichia coli K-12using PCR products.ProcNatlAcadSci U S A.2000,97(12):6640-5。来自 美国Purdue大学Barry Wanner的教授。

5.pST98-AS。文献：Posfai G.,Kolisnychenko V.,Bereczki Z,Blattner FR.Markerless gene  replacement in Escherichia coli stimulated by a double-strand break in the chromosome. Nucleic Acids Res.1999,27(22):4409-15。来自美国Wisconsin大学Madison分校Frederick  Blattner教授。

6.pBluescript II(KS-)。文献：Alting-Mees,M.A.and Short,J.M.(1989)pBluescript II:gene  mapping vectors.Nucleic Acids Res,17,9494。基因克隆载体，购自美国Stratagene公司。

7.pSC101-BAD-gbaA。文献：Wang,J.,Sarov,M.,Rientjes,J.,Fu,J.,Hollak,H.,Kranz,H.,Xie, W.,Stewart,A.F.and Zhang,Y.(2006)An improved recombineering approach by adding RecA  to lambda Red recombination.Mol Biotechnol,32,43-53。来自德国Dresden大学的Youming  Zhang博士。

实施例

实施例1.整合型质粒pLS1755的构建，整合至大肠杆菌基因和消除

1.1pLS1755的构建

设计引物LSKD7：5'-GGGATCGATGAATTCGGTACCACTAGTTATGG ACAGCAAGCGAACCGG-3'，（SEQ ID NO.1），下划线为ClaI，EcoRI，KpnI和SpeI酶切位 点；LSKD8：5'-GGGGCTCATGCGAGACCCCATGGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTTCAGAAGAACTCGTCAAGAAG-3'，（SEQ ID  NO.2），下划线为XhoI，BsaI，NcoI，SacI，SacII，NotI，BamHI和SpeI酶切位点。以pKD4 为模板，LSKD7和LSKD8PCR扩增得到1.5kb的卡那霉抗性基因neo片段，neo片段以 ClaI-BsaI酶切后与pKD4以ClaI-NcoI酶切段并分离得到的1.4kb载体部分相连，转化 BW25141的感受态细胞，筛选得到重组克隆pLSKD2。

设计引物NI1：5'-GGGACTAGTttaccctgttatccctaTTATTTCAGGAAAGTTTC GGAG-3'，（SEQ ID NO.3），NI2：5'-GGGACTAGTGACCGTAATGGGATAGGT CACGTTGGTGTAGATGGGCGCATCGTAACCGTtagggataacagggtaatTTAAGAC CCACTTTCAC-3'，（SEQ ID NO.4），下划线为SpeI酶切位点，小写为I-SceI酶切位点（NI2 中为反向互补序列），斜体为50bp lacZ序列。以pST98-AS为模板，NI1和NI2扩增得到1.5kb  tetR-ptetA-I-SceI片段，以SpeI酶切后，克隆至pBluecript II KS(-)的SpeI位点，测序正确后， 重组克隆命名为pLS1754。pLS1754以SpeI酶切，回收目的片段，与1.6kb pLSKD2以SpeI 酶切回收的载体相连，转化BW25141的感受态细胞，筛选得到重组克隆pLS1755。pLS1755 即为目的整合型、可消除质粒，其限制性酶切图谱如附图1所示。

1.2大肠杆菌MG1655/pSC101-BAD-gbaA电转化感受态的制备以及寡核苷酸和质粒的共转化

首先将pSC101-BAD-gbaA转化至大肠杆菌MG1655，在10μg/ml四环素的LB固体培养 上，于30℃筛选得到菌株MG1655/pSC101-BAD-gbaA。将菌株单菌落接种3ml含10μg/ml 四环素的LB液体培养基，30℃培养约20小时，按1:50的体积转接100ml相同培养基，30℃ 振荡培养至OD₆₀₀约为0.2时，加入终浓度为0.15%的L-阿拉伯糖诱导重组酶的表达，37℃ 振荡培养约1小时至OD₆₀₀约为0.4。冰浴10分钟后，4℃，7000rpm离心5分钟，弃上清。 菌体以10%的冰冷的甘油轻轻地洗涤沉淀两次，最后悬浮于200μl冰冷的10%甘油中，每管 50μl分装使用。

1.3pLS1755的整合和消除

将100ng pLS1755电转化至表达重组酶的大肠杆菌感受态细胞，在含50μg/ml固体平板上 筛选。设计引物NI3：5'-CATCAACATTAAATGTGAGCG-3'，（SEQ ID NO.5），NI4： 5'-CATACTCACTTTTGCCCTTTAG-3'，（SEQ ID NO.6），NI5： 5'-AGCGGATACATATTTGAATG-3'，（SEQ ID NO.7），NI6：5'-ACCGATCGCCC TTCCCAACAG-3'，（SEQ ID NO.8）。NI3位于整合位点的上游114bp，NI4位于tetR中，NI5 位于氨苄青霉素抗性基因中，NI6位于整合位点的下游148bp。随机挑取克隆进行菌落PCR 验证。NI3-NI4PCR扩增上游片段567bp，NI5-NI6PCR扩增下游片段302bp。

所得抗性菌株但菌落转接至含25μg/ml热失活的cTc的3ml LB中培养约16小时，10^-4稀释后，铺布LB平板，随机挑取50个菌落影印至含或不含氨苄青霉素的LB平板，发现 42个克隆为氨苄青霉素敏感性，表明pLS1755得以消除，所得菌株以NI3-NI6扩增lacZ区域 为262bp，基因型和测序分析均与原株一致。pLS1755由重组酶催化的整合至基因组所得变 株以及质粒消除后所得菌株的突变位点分析的凝胶电泳结果如附图2所示。

1.4寡核苷酸和pLS1755的共转化

将5pmol寡核苷酸和100ng pLS1755共同加至电转化感受态细胞中，轻轻吹打混匀。混 合液转移至冰上预冷的1mm电转杯中，电击转化。条件：200Ω，1800V，Bio-Rad公司Gene  Pulser II^R电转化仪。电击后，立即加入1ml SOC液体培养基至电转杯，吹打混匀，悬浮液转 移至无菌1.5ml eppendorf管，37℃振荡培养70分钟后，转化液涂布于含50μg/ml的氨苄青 霉素的抗性平板上，37℃培养约20小时。挑取长出的菌落在50μg/ml的氨苄青霉素的固体 平板上抗性验证并扩大培养后，以突变位点两侧的引物进行菌落PCR扩增目的片段，并测序 分析目的位点的突变情况。获得突变菌株，按“1.3”所述方法消除pLS1755。寡核苷酸和可 消除质粒pLS1755共转化实现大肠杆菌基因组必需基因点突变的示意图如附图3所示，P1和 P2为扩增突变区域的PCR引物和测序引物，如rpsL突变位点分析的R509和R510以及rpoB 突变位点分析的R511和R512。

实施例2.必需基因rpsL基因的点突变

rpsL基因在大肠杆菌基因组上的基因编号是b3342，设计寡核苷酸R507： 5'-G*T*C*A*GACGAACACGGCATACTTTACGCAGCGCGGAGTTCGGTTTTCTAGGAGTGGTAGTATATACACGAGTACATACGCCACGTTTTTGCG-3'，（SEQ ID NO.9），* 表示为磷硫酰键连接，下划线为突变位点。将5pmol R507和100ng pLS1755如实施例1中的 方法进行电转化，100个氨苄青霉素抗性菌落扩增培养。设计引物R509： 5'-CAGGATTGTCCAAAACTCTAC-3'，（SEQ ID NO.10），R510： 5'-GGCATCGCCCTAAAATTCGG-3'，（SEQ ID NO.11）。随机挑取30个克隆，以R509和R510 为引物进行菌落PCR扩增得到540bp。以R510为引物对540bp产物进行测序，获得两个预 期点突变的克隆。rpsL基因点突变的测序图所附图4示，开放阅读框的第128位碱基由A突 变为G，密码子由AAA突变为AGA，所编码的第43位赖氨酸突变为精氨酸。单独转化寡核 苷酸R507所得克隆中，随机挑取30个克隆进行PCR分析，没有发现预期的突变，均为原株 的基因型。

实施例3.必需基因rpoB基因的点突变

rpoB在大肠杆菌基因组上的基因编号是b3987，设计寡核苷酸R508：

5'-A*C*G*T*ACACCCGACTCACTACGGTCGCGTATGTCCAATCGAAACCCTT GAAGGTCCGAACATCGGTCTGATCAACTCTCTGTCCGTGTACGC-3'，（SEQ  ID NO.12），*为磷硫酰键连接，下划线为突变位点。将5pmol R508和100ng  pLS1755如实施例1中的方法进行电转化，100个氨苄青霉素抗性菌落扩增培养。

设计引物R511：5'-GTAGAGCGTGCGGTGAAAGAG-3'，（SEQ ID NO.13），R512： 5'-GGATACGTCCATGTAGTCAAC-3'，（SEQ ID NO.14）。随机挑取20个克隆，以R511和 R512为引物进行菌落PCR扩增，得到557bp。以R511为引物对557b产物进行p测序，发 现两个克隆发生预期的点突变。rpoB基因点突变测序图所附图5示，开放阅读框的第1691 位碱基由C突变为T，密码子由CCT突变为CTT，所编码的第564位脯氨酸突变为亮氨酸。 与rpsL实验相同，单独转化寡核苷酸R508所得克隆中，随机挑取20个克隆进行PCR分析， 未发现预期的突变，均为原株的基因型。