一种基于抗EGFR单链抗体及精氨酸九聚体的融合蛋白与应用

摘要

本发明公开了一种基于抗EGFR单链抗体及精氨酸九聚体的融合蛋白与应用，包括通过连接肽相连接的重链可变区和轻链可变区，轻链可变区的末端连接有精氨酸九聚体；其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。本发明采用经过筛选的连接肽连接单链的EGFR抗体的重链可变区和轻链可变区，既保留了抗体与EGFR结合的特异性和亲和力，保证了所构建的融合蛋白对EGFR的靶向性；而且降低了融合蛋白的大小，一方面既方便其构建、表达和纯化，实现了其低成本的获取，另一方面保证了其对EGFR结合、尤其是内化入细胞对分子大小、抗体活性的要求，确保了其对EGFR结合、靶向肿瘤细胞内化的可行性和准确性。

说明书

技术领域

本发明属于抗肿瘤技术领域，涉及一种基于抗EGFR单链抗体及精氨酸 九聚体的融合蛋白与应用。

背景技术

表皮生长因子受体（EGFR）家族是一类跨膜蛋白受体，具有酪氨酸激 酶活性，通过调节下游信号转导，在肿瘤细胞的发生、发展和转移中发挥重 要作用。胶质细胞、肾癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等组织中都有 EGFR的过表达。EGFR的高表达对一些恶性肿瘤细胞的增殖、细胞周期、侵 袭及新生血管形成等方面起关键作用（Mendelsohn J,J Clin Oncol,2003, 21(14):2787-2799），EGFR成为抗肿瘤药物或者疫苗的重要靶点。

EGFR在肿瘤中高表达以及其在肿瘤生长分化中起的重要作用，使其成 为肿瘤诊断、抗肿瘤治疗的重要靶点。目前，研发抑制恶性肿瘤中EGFR高 表达的药物已成为治疗恶性肿瘤生长和转移的重要手段之一。然而，在EGFR 抑制剂研发中，虽有吉非替尼、西妥昔单抗等已被应用于临床，但疗效并非 理想，其它一些生物抑制剂仍处于基础研究和临床研究阶段。同时，以EGFR 作为靶点，寻找抑制恶性肿瘤中EGFR高表达的药物是研发抗肿瘤新药或类 似化合物的重要途径之一。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种基于抗EGFR单链抗体及精氨酸九聚体 的融合蛋白与应用，达到对肿瘤细胞起到特异性的杀伤作用，且毒副作用小。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种基于抗EGFR单链抗体及精氨酸九聚体的融合蛋白，包括通过连接 肽相连接的重链可变区和轻链可变区，轻链可变区的末端连接有精氨酸九聚 体；其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。

一种编码基于抗EGFR单链抗体及精氨酸九聚体的融合蛋白的核苷酸， 其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。

一种基于抗EGFR单链抗体及精氨酸九聚体的融合蛋白的制备方法，包 括以下操作：

1）将如SEQ.ID.NO.4所示的核苷酸克隆入pGEX4T-1表达载体，构建 重组质粒；

2）将所构建的重组质粒转染大肠杆菌，并在含氨苄青霉素的YTA培养 基中培养，培养至OD600为0.4～0.6时，添加IPTG诱导表达，收集诱导后 的菌液离心，收集细菌后破菌、离心，收集上清；

3）使用GST亲和层析柱纯化分离上清中的融合蛋白，得到基于抗EGFR 单链抗体及精氨酸九聚体的融合蛋白。

一种抗EGFR单链抗体，包括通过连接肽相连接的重链可变区和轻链可 变区，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

一种编码抗EGFR单链抗体的核苷酸，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2 所示。

所述的融合蛋白在制备抗肿瘤药物、抗肿瘤辅助药物或肿瘤诊断试剂中 的应用。

所述的融合蛋白在制备靶向EGFR的药用载体、携带载体中的应用。

所述的应用，包括所述的融合蛋白在携带siRNA、microRNA、脂质体中 的一种或几种进入肿瘤细胞内部并释放的应用。

所述的核苷酸在构建表达载体，以及制备抗肿瘤药物、抗肿瘤辅助药物 或肿瘤诊断试剂中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的基于抗EGFR单链抗体及精氨酸九聚体的融合蛋白，采用 经过筛选的连接肽连接单链的EGFR抗体的重链可变区和轻链可变区，既保 留了抗体与EGFR结合的特异性和亲和力，保证了所构建的融合蛋白对EGFR 的靶向性；而且降低了融合蛋白的大小，一方面既方便其构建、表达和纯化， 实现了其低成本的获取，另一方面保证了其对EGFR结合、尤其是内化入细 胞对分子大小、抗体活性的要求，确保了其对EGFR结合、靶向肿瘤细胞内 化的可行性和准确性。

进一步的，精氨酸九聚体是一种连续的由9个精氨酸构成的短肽，作为 内化工具可以使多肽、多聚核苷酸、脂质体等极小微粒进入细胞。通过与单 链抗体融合表达，可以将抗肿瘤的物质靶向输送到肿瘤所在部位，并内化入 肿瘤细胞，发挥抗肿瘤的治疗作用。实验结果表明其具有免疫原性和靶向性， 而且内化性效果良好。

本发明提供的在大肠杆菌中表达的基于抗EGFR单链抗体及精氨酸九聚 体的融合蛋白，可以利用单链抗体对肿瘤细胞的靶向性和精氨酸九聚体的内 化作用，协同其他抗肿瘤分子，实现对肿瘤细胞起到特异性的杀伤作用，效 果明显，且毒副作用小，制备简单方便，有良好的应用前景，为肿瘤的治疗 提供了一种新的选择。

本发明提供的基于抗EGFR单链抗体及精氨酸九聚体的融合蛋白，可应 用于制备抗肿瘤药物、抗肿瘤辅助药物或肿瘤诊断试剂；可应用于靶向EGFR 的药用载体、携带载体，包括所述的融合蛋白在携带siRNA、microRNA、脂 质体中的一种或几种进入肿瘤细胞内部并释放；而其相对应的编码核苷酸， 则可以参与载体的构建，或者进行表达。

附图说明

图1为表达载体酶切鉴定结果。

图2为scFv（anti-EGFR）、scFv-9R进行表达鉴定。

图3为ELISA实验检测scFv（anti-EGFR）、scFv-9R的抗原结合活性。

图4a～图4c为免疫荧光检测scFv（anti-EGFR）、scFv-9R靶向结合能 力。

图5a～图5c为流式细胞术检测scFv（anti-EGFR）、scFv-9R靶向结合 能力。

图6为凝胶阻滞实验检测scFv（anti-EGFR）、scFv-9R携带核酸能力。

图7a～图7c为scFv（anti-EGFR）、scFv-9R的靶向性携带核酸内化能 力。

图8a～图8c为scFv（anti-EGFR）、scFv-9R的体内靶向性结合能力。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明 的解释而不是限定。

1、抗EGFR单链抗体、融合蛋白的构建和制备

（1）序列的构建

为了提高抗EGFR抗体所能够发挥的作用，本发明利用重组抗体单链来 降低抗体蛋白的大小，在发挥其特异性结合的基础上便于重组蛋白的表达、 内化。所构建的EGFR单链抗体由连接肽连接重链可变区和轻链可变区而构 成，所述的重链可变区、轻链可变区和连接肽均经过大量的筛选，尤其是以 融合表达之后的活性作为重要依据。

本发明所构建的抗EGFR单链抗体的氨基酸序列如下（SEQ.ID.NO.1） 所示：

LQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYYIYWVRQAPGQGLEWIG GINPTSGGSNFNEKFKTRVTITADESSTTAYMELSSLRSEDTAFYFCTRQG LWFDSDGRGFDFWGQGTTVTVSGGGGSGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSA SVGDRVTITCRSSQNIVHSNGNTYLDWYQQTPGKAPKLLIYKVSNRFSGV PSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCFQYSHVPWTFGQGTKLQI

该单链抗体具有244个氨基酸残基，其中第1到第119aa为重链可变区， 第120到第135aa为连接肽，第136到第244aa为轻链可变区。

从抑制抗肿瘤抗体氨基酸序列反向设计核酸表达序列，合成单链抗体及 其与精氨酸九聚体融合蛋白的融合基因，之后进行大肠杆菌表达。

在单链抗体的基础上，反向设计基因表达序列并进行密码子优化，所得 的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

将SEQ.ID.NO.2所示的核苷酸序列克隆入pGEX4T-1表达载体的BamH  Ⅰ和Xho Ⅰ位点之间，构建重组质粒。

为使抗EGFR单链抗体具有携带siRNA、microRNA、脂质体、示踪剂 等的作用，本发明采用精氨酸九聚体对其进行修饰，修饰后的氨基酸序列如 下（SEQ.ID.NO.3）所示：

LQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYYIYWVRQAPGQGLEWIG GINPTSGGSNFNEKFKTRVTITADESSTTAYMELSSLRSEDTAFYFCTRQG LWFDSDGRGFDFWGQGTTVTVSGGGGSGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSA SVGDRVTITCRSSQNIVHSNGNTYLDWYQQTPGKAPKLLIYKVSNRFSGV PSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCFQYSHVPWTFGQGTKLQIRRRR RRRRR；

该融合蛋白具有253个氨基酸残基，其中第1到第244aa单链抗体段scFv （anti-EGFR），第245到第253aa为精氨酸九聚体段。

精氨酸九聚体是一种连续的由9个精氨酸构成的短肽，作为内化工具可 以使多肽、多聚核苷酸、脂质体等极小微粒进入细胞。

本发明通过精氨酸九聚体与单链抗体融合表达，可以将上述物质靶向输 送到肿瘤所在部位，并内化入肿瘤细胞，发挥抗肿瘤的治疗作用。

同样将反向设计基因表达序列并进行密码子优化，所得的核苷酸序列如 SEQ.ID.NO.2，SEQ.ID.NO.4所示。并分别在核苷酸序列C端加入6×His.tag 序列后克隆入pEGX4T-1表达载体的BamHⅠ和XhoⅠ位点之间，构建重组 质粒。

（2）重组大肠杆菌的构建

为了便于融合蛋白的表达，本发明采用原核表达载体进行表达，并进行 提取。

将所构建的重组质粒分别转化DH5α大肠杆菌，大肠杆菌扩增后提取质 粒，酶切鉴定并测序；酶切鉴定结果见图1，其中泳道1为maker，泳道2、 3分别为scFv（anti-EGFR）、scFv-9R的重组载体，可以清晰的看到两条泳 带，表明表达序列已连接入pGEX4T-1载体。

将测序正确的scFv（anti-EGFR）、scFv-9R的表达质粒分别转化BL21 （DE3）感受态细胞，从而获得重组基因scFv（anti-EGFR）、scFv-9R的表 达工程菌。

（3）scFv（anti-EGFR）、scFv-9R的表达及表达产物鉴定。

挑选scFv（anti-EGFR）、scFv-9R的单克隆工程菌接种于2×YTA培养 基（含氨苄青霉素,Amp），37℃培养至OD600约为0.4-0.6时，添加异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.1mM诱导表达，收集诱导后的菌液 离心，沉淀重悬于破菌缓冲液（PBS PH7.4），超声破菌、离心，分别收集 上清和沉淀，SDS-PAGE检测出重组蛋白的表达形式为可溶性蛋白。

对于上清使用GST亲和层析柱纯化:(1)用10倍介质体积缓冲液 A(10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，140mM NaCl，2.7mM KCl，调节pH 值至8.0)过柱，平衡介质；(2)上样；(3)用10倍介质体积缓冲液A过柱， 洗去层析柱中残余上样液并重新平衡介质；(4)用10倍介质体积缓冲液 B(10mM Glutathione，50mM Tris-HCl，调节pH值至8.0)洗脱，收集洗脱液。 （5）经Millipore超滤管超滤浓缩后，使用Bradford绘制标准曲线并测定蛋 白质浓度。（6）使用Novagen Thrombin kit去除融合蛋白标签，每1mg融 合蛋白加入4U凝血酶，20℃酶切8小时，之后再次经GST亲和层析柱纯化 收集穿透液，得到C端具有6×His.tag的scFv（anti-EGFR）、scFv-9R单链 抗体融合蛋白。

2、对scFv（anti-EGFR）、scFv-9R单链抗体融合蛋白进行鉴定及功能 验证

（1）对制备的scFv（anti-EGFR）、scFv-9R进行鉴定：

将纯化之后的scFv（anti-EGFR）、scFv-9R利用western blot的方法进 行鉴定，一抗为抗6×His.tag抗体，二抗为Dylight488标记抗小鼠二抗：样 品进行SDS-PAGE凝胶电泳后，100V80分钟转膜。转膜完成后封闭1小时。 之后与一抗孵育2小时、二抗孵育1小时。扫膜仪扫膜之后，结果如图2所 示，样品呈阳性结果，表明单链抗体融合蛋白表达成功。

（2）scFv（anti-EGFR）、scFv-9R的EGFR抗原特异性结合活性及细胞 内靶向性内化能力：

通过ELISA实验及针对A549细胞进行免疫荧光、流式细胞术，检测scFv （anti-EGFR）、scFv-9R的靶向性及内化能力。

ELISA检测单链抗体融合蛋白抗原结合活性：

（1）ELISA板中每孔加入100μL用pH9.6碳酸盐包被缓冲液稀释的 重组人EGFR蛋白(10mg/L)4℃过夜；（2）每孔加入羊血清封闭液200μL， 37℃封闭1h；（3）每孔加入不同浓度的蛋白稀释样品，37℃孵育2h同时 设3个复孔及阴性对照孔；（4）每孔加入按照1:1000比例稀释的抗6×His 一抗37℃孵育1h，每孔加入按照1:5000稀释的HRP标记羊抗小鼠的二 抗37℃孵育1h；（5）每孔加入100μLTMB显色液，避光20min 明显显色后，加入终止液50μL终止反应；（6）酶标仪测定各孔波长为450 nm的吸光值。

如图3所示，结果表明：随着蛋白稀释度的增加，scFv、scFv-9R融合 蛋白与EGFR抗原的结合也相应减少，与阴性对照BSA及阳性对照scFv相 比较，融合蛋白scFv-9R也能与细胞表面HER2抗原特异性结合，因此9R 片段的融合对scFv与EGFR抗原的结合无明显影响。

免疫荧光检测靶向结合能力：

将胰酶消化的A549细胞接种于6孔板内盖玻片之上。37℃，5%CO₂培 养箱中过夜；将scFv（anti-EGFR）、scFv-9R、BSA用PBS（PH7.4）稀释 至10μg/ml，取出6孔板，将上述试剂分别与A549细胞共孵育4小时；PBS 洗涤细胞3次；将稀释好的抗6×His一抗（1：2000）加入6孔板中与细胞 共孵育2小时；PBS洗涤细胞后，用稀释好的cy3标记的抗小鼠二抗（1：200） 与细胞共孵育1小时；PBS洗涤细胞3次，加入1：10000比例稀释的DAPI 染液复染细胞核；PBS洗涤后激光共聚焦显微镜观察。

结果表明：相对于BSA（图4a所示，几乎没有结合）孵育的细胞之后， scFv（anti-EGFR）（图4b所示，与细胞EGFR结合并内化入细胞内）、scFv-9R （图4c所示，与细胞EGFR进行结合并内化入细胞内）能够特异性的结合于 EGFR高表达的A549细胞株，并内化入细胞浆及细胞核内，因此后两者具 有明显的肿瘤细胞靶向性。

流式细胞术检测靶向性结果：

收集对数生长期A549细胞，接种于6孔板，37℃，5%CO₂培养箱中过 夜；将用PBS（PH7.4）稀释至10μg/ml的scFv（anti-EGFR）、scFv-9R、 BSA加入细胞培养液中，与细胞共孵育4小时后收取细胞至EP管，预冷的 PBS洗涤。将稀释好的抗6×His一抗（1：2000）加入管中混匀，冰上放置 2小时。预冷的PBS洗涤后，用稀释好的FITC标记的抗小鼠二抗（1：200） 与细胞冰上共孵育1小时，PBS洗涤之后重悬送检。

检测结果表明：与BSA（图5a所示，基本都落在了M1区）孵育细胞 相比，scFv（anti-EGFR）（图5b所示，基本都落在了M2区）、scFv-9R（图 5c所示，大部分都落在了M2区）均能够与A549细胞特异性结合，表现出 对肿瘤细胞的靶向性、高亲和力。

3、scFv（anti-EGFR）、scFv-9R靶向携带核酸及内化能力

通过对凝胶阻滞实验、免疫荧光、流式细胞术检测scFv（anti-EGFR）、 scFv-9R携带核酸及内化能力。

（1）凝胶阻滞实验检测scFv（anti-EGFR）、scFv-9R携带核酸能力：

各取1μg非特异性的PCR产物，分别与1μg，4μg，10μg纯化的单链 抗体、融合蛋白于0.2mol/L NaCl溶液中室温孵育30min后，进行1%琼脂 糖凝胶电泳分析。

结果详见图6：与BSA、scFv（anti-EGFR）相比，scFv-9R组随蛋白浓 度增大核酸电泳速度逐渐减慢，表明其具有携带核酸能力。

（2）scFv（anti-EGFR）、scFv-9R的靶向性携带核酸内化能力：

BSA、scFv（anti-EGFR）、scFv-9R各10μg分别与20nM FAM-siRNA （siRNA为非特异性）混合室温下放置30分钟后，加入预先接种于盖玻片 之上的A549细胞中，4小时后取出盖玻片经多聚甲醛固定20分钟、DAPI 复染细胞核。

激光共聚焦拍摄结果如图所示：与BSA（图7a所示，未见绿色荧光）、 scFv（anti-EGFR）（图7b所示，未见绿色荧光）相比，scFv-9R（图7c所 示，绿色荧光可见于胞膜表面、胞质内及细胞核）可携带绿色荧光的 FAM-siRNA内化入A549细胞浆及细胞核。

4、scFv（anti-EGFR）、scFv-9R体内靶向结合能力

将scFv（anti-EGFR）及scFv-9R融合蛋白及BSA透析至硼酸钠溶液（PH 值8.5），与Dylight800染料室温下结合1小时，再次透析至PBS溶液（PH 值7.4）。经鼠尾静脉注射入已荷瘤一周的裸鼠体内。经48小时后使用IVIS  Lumina Ⅱ系统拍照。

结果表明：与注射了BSA的裸鼠（如图8a所示，未见红色荧光）相比， scFv（anti-EGFR）（如图8b所示，可见红色荧光）及scFv-9R（如图8c所 示，可见红色荧光且亮度较高）均可靶向结合于裸鼠背部荷瘤。证明两种单 链抗体融合蛋白具有良好的体内靶向亲和能力。

鉴于EGFR单链抗体scFv（anti-EGFR）、单链抗体与精氨酸九聚体融 合蛋白scFv-9R对EGFR的靶向性、高亲和力，并可内化入目标细胞；因此 scFv（anti-EGFR）、scFv-9R可以进行以下应用：

在制备抗肿瘤药物或抗肿瘤辅助药物、肿瘤诊断试剂中的应用。

具体的，抗EGFR单链抗体可与示踪剂交联，发挥肿瘤示踪诊断功能。

EGFR与精氨酸九聚体融合蛋白可携带正电荷小分子物质，如siRNA、 microRNA、脂质体等进入肿瘤细胞内部并释放，发挥抑制、杀伤肿瘤细胞作 用。