抗HER2单链抗体/精氨酸九聚体融合蛋白的表达及活性研究

摘要

骨骼是乳腺癌最常见的转移部位，骨转移约占乳腺癌远处转移的65％～75％。一旦乳腺癌转移到骨，通常被认为是不可治愈的，同时能够导致大量骨骼相关事件包括慢性骨痛、病理性骨折、脊髓压迫和高钙血症等严重并发症，严重影响了癌症患者的生存时间及生活质量。目前在临床上较为常用的治疗乳腺癌骨转移的方法，如外科手术治疗、放射治疗、抗肿瘤药物治疗、镇痛药物治疗以及激素治疗等，均难以取得令人满意的效果。
　　近年来，由于肿瘤靶向治疗的特异性抗肿瘤作用，治疗毒副作用明显减少，使肿瘤的靶向治疗技术得以推广，疗效也不断得到提高，开创了肿瘤治疗的新前景。将靶向治疗技术应用于乳腺癌骨转移的治疗，可以显著提高肿瘤治疗效果，同时为其他HER2阳性肿瘤的基因治疗提供新的候选分子。
　　由于发现RNA干扰(RNAi)可以特异性降低内源性蛋白的表达，研究者希望利用RNAi治疗许多遗传性疾病和肿瘤等难治性疾病。小干扰RNA(siRNA)是RNAi发挥效应所必需的因子，具有广阔的治疗应用前景，但由于体内siRNA细胞内吸收差、血浆内稳定性弱和非特异性转运，体内递送siRNA仍然是RNAi广泛应用于临床治疗的最大障碍。
　　单链抗体(scFv)由于保留了抗原结合活性同时分子量更小，免疫原性更低，是具有靶向性的优良药物递送载体。scFv可与其他效应分子融合构成具有多重功能的分子，例如鱼精蛋白、免疫毒素等。精氨酸九聚体(9R)是含有大量正电荷的碱性氨基酸，是一种细胞渗透性多肽，能依赖正负电荷相互作用而结合带有负电荷的核酸物质。
　　近年来，研究发现CXCL12/CXCR4生物学轴在乳腺癌骨转移中起着重要作用。在多数乳腺癌骨转移组织中HER2和CXCR4的表达呈正相关，且CXCR4的高水平表达往往预示着癌症患者的预后不良，这些使HER2与CXCR4成为肿瘤靶向治疗中的重要靶点。在上述研究基础上，本课题利用基因工程和蛋白质技术，尝试获得人源性抗HER2单链抗体(scFv)/精氨酸九聚体(9R)融合蛋白scFv-9R，以期得到siRNA体内递送的良好载体，使针对CXCR4的特异性siRNA可以在scFv-9R引导下，到达并内化入HER2阳性肿瘤细胞，靶向抑制CXCR4表达，这种策略有望为临床治疗乳腺癌骨转移提供一种新方法。
　　目的：
　　构建人源性抗HER2单链抗体(scFv)/精氨酸九聚体(9R)融合蛋白基因，在大肠杆菌里表达纯化并检测该融合蛋白的活性。
　　方法：
　　采用PCR方法，扩增融合基因scFv-9R，将获得的基因克隆入原核表达载体pQE30，在大肠杆菌M15中表达，表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定，通过Ni-NTA螯合层析纯化，透析复性，超滤浓缩。ELISA实验分析scFv-9R抗原结合活性，间接免疫荧光实验观察scFv-9R抗原结合及内化能力，凝胶迁移阻滞实验检测融合蛋白siRNA结合活性，siRNA结合实验计算scFv-9R与siRNA结合比率。
　　结果：
　　成功构建了人源性抗HER2scFv-9R融合基因，经IPTG诱导后在M15中以包涵体形式表达，经SDS-PAGE和Western blot鉴定为目的蛋白。Ni柱亲和层析获得纯度约为87％的目的蛋白。ELISA实验验证scFv-9R具有抗原亲和活性，间接免疫荧光实验证明融合蛋白可以结合并内化入HER2阳性的肿瘤细胞，凝胶迁移阻滞实验证明scFv-9R具有siRNA结合活性,siRNA结合实验表明1分子融合蛋白大约可结合3分子siRNA。
　　结论：
　　scFv-9R具有结合HER2抗原并内化入HER2阳性肿瘤细胞和结合siRNA的活性，为靶向递送siRNA的研究奠定了基础。

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缩略语表

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前言

文 献 回 顾

1 以 HER2 为靶点的肿瘤治疗研究进展

2 单链抗体融合蛋白的研究进展

3 siRNA 及靶向递送的研究与应用

正文

实验一 重组人抗 HER2 scFv-9R 融合蛋白的基因构建

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 抗 HER2 scFv-9R 融合蛋白的表达及鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 抗 HER2 scFv-9R 融合蛋白的活性研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢