包含阳离子脂质的用于带负电荷的药物的载体及其制备方法

摘要

本发明公开了一种用于递送带负电荷的药物的载体，所述载体包含由下式1表示的阳离子脂质，及其制备方法。还公开了一种药物组合物，其包含带负电荷的药物和式1表示的阳离子脂质，其中所述带负电荷的药物与所述阳离子脂质形成复合物。所述组合物可以在局部或全身性施用后增加所述带负电荷的药物的体内稳定性并且允许所述带负电荷的药物的胞内递送。因此，所述组合物对于改善所述带负电荷的药物的治疗作用将是有用的。

说明书

技术领域

本发明总体上涉及包含阳离子脂质的用于递送带负电荷的药物的载体及 其制备方法，并且更具体地涉及用于递送带负电荷的药物的组合物及其制备方 法，其中所述带负电荷的药物与本发明的式1的阳离子脂质形成复合物。

背景技术

安全和高效的药物递送技术已经研究了很长时间，并且在使用带负电荷的 药物、尤其核酸物质的治疗领域已经开发了各种递送系统和技术。尤其，已经 开发了使用基于腺病毒或逆转录病毒的病毒递送系统的递送技术和基于阳离 子脂质或阳离子聚合物的非病毒递送系统。

然而，已知使用病毒递送系统的技术暴露于多种风险，包括非特异性免疫 反应，并且它们的商业使用存在因生产工艺复杂所致的众多问题。出于这种原 因，最近研究趋势意在使用基于阳离子脂质或阳离子聚合物的非病毒递送系统 克服病毒递送系统的缺点。这类非病毒递送系统比病毒递送系统效率低，但是 具有伴随更少的体内副作用和具有低生产成本的优点。

在非病毒递送系统制剂当中，已经使用与核酸物质静电结合以形成核酸- 聚合物复合物的聚阳离子聚合物，但是因为聚阳离子电荷的细胞毒性，所以在 实际使用时存在众多问题。

也可以使用阳离子脂质，但是它们难以在体内使用，因为核酸-脂质复合 物在血液中的稳定性低。另外，已经试图使用离子脂质体(包括阳离子脂质、 中性脂质和致融合脂质)作为全身性递送系统，但是阳离子脂质合成复杂并且 仍具有细胞毒性，并且其胞内核酸递送效率低。

此外，已知形成阳离子脂质与siRNA的复合物并且所述复合物包埋于两 性嵌段共聚物的胶束中的技术。然而，在这些技术中使用的阳离子胆固醇脂质 的合成和纯化方法是复杂的。

同时，许多疾病由因各种因素而发生的疾病相关基因表达增加引起，或者 由因突变引发的异常活性引起。siRNA(小干扰性RNA)在转录后阶段以序列特 异性方式抑制特定基因的表达，并且作为基因治疗剂，受到众多关注。尤其， 因其高度活性和精确的遗传选择性，预期siRNA为能替代现存反义核苷酸或 核酶的核酸治疗剂。siRNA是由15-30个核苷酸组成的短双链RNA分子并且 切割与之具有核苷酸序列互补的基因的mRNA，以抑制该基因的表达。

然而，siRNA被血液中的核酸酶快速降解并且因其带负电荷而不容易通过 细胞膜。出于这种原因，为了使用siRNA作为治疗剂，需要使用组合物，所 述组合物允许siRNA高效递送至靶向的细胞或器官，同时siRNA在血液中长 时间循环。

发明内容

技术问题

因此，本发明的一个实施方案提供一种用于递送带负电荷的药物的载体， 所述载体包含由式1表示的阳离子脂质。

本发明的另一个实施方案提供一种制备所述载体的方法，所述方法包括使 低聚亚烷基胺与脂肪酸酰卤反应步骤，以制备式1的阳离子脂质。

本发明的再另一个实施方案提供一种药物组合物，其包含带负电荷的药物 和式1表示的阳离子脂质，其中所述带负电荷的药物与所述阳离子脂质形成复 合物。

本发明的再另一个实施方案提供一种胶束组合物及其制备方法，所述胶束 组合物包含带负电荷的药物、式1的阳离子脂质和两性嵌段共聚物，其中所述 带负电荷的药物与所述阳离子脂质形成复合物，并且所述复合物包埋于所述两 性嵌段共聚物的胶束结构中。

本发明的再另一个实施方案提供一种脂质体组合物，其包含带负电荷的药 物、式1的阳离子脂质和致细胞融合磷脂（cellfusogenic phospholipid），其中 所述带负电荷的药物与所述阳离子脂质形成复合物，并且所述复合物与由致细 胞融合磷脂组成的脂质体结合。

本发明的又一个实施方案提供一种胶束组合物，其包含带负电荷的药物、 式1的阳离子脂质和表面活性剂，其中所述带负电荷的药物与所述阳离子脂质 形成复合物，并且所述复合物包埋于所述表面活性剂的胶束结构中。

本发明的再另一个目的是提供一种乳液组合物，其包含带负电荷的药物、 式1的阳离子脂质和表面活性剂，其中所述带负电荷的药物与所述阳离子脂质 形成复合物，并且所述复合物包埋于乳液中。

技术方案

本发明提供一种用于递送带负电荷的药物的载体，所述载体包含由式1 表示的阳离子脂质：

[式1]

其中，n和m独立地是0至12，前提条件是2≤n+m≤12，a和b独立地是 1至6，R₁和R₂独立地是具有11至25个碳原子的饱和或不饱和烃基。

式1表示的阳离子脂质由通过酰胺键连接的带正电荷的低聚亚烷基胺和 具有12至26个碳原子的疏水性饱和或不饱和脂肪酸组成。在本发明中，阳离 子脂质可以通过静电相互作用与带负电荷的药物结合以形成复合物，所述复合 物增加带负电荷的药物的体内稳定性并且允许所述带负电荷的药物递送至细 胞中。

在本发明的一个优选的实施方案中，n和m独立地是1至9，前提条件是 2≤n+m≤10。更优选地，n和m独立地是1至3，前提条件是3≤n+m≤6。所述 低聚亚烷基胺优选地具有以上指定范围内的n和m值，以便维持脂肪酸的密 度处于高水平并且使阳离子的细胞毒性最小化。

在式1中，a和b各自优选地是2至4，并且更优选地是2。如果a和b 小于1，则这些胺之间的距离将如此之短，以致于阳离子脂质和带负电荷的药 物之间的静电相互作用将下降。在另一方面，如果a和b大于6，则这些胺之 间的距离将太长并且阳离子的密度将下降，以致于阳离子脂质和带负电荷的药 物之间的静电相互作用将下降，并因此无法形成它们之间的稳定复合物。

特别地，在本发明中使用的低聚亚烷基胺可以是低聚亚乙基胺，并且更具 体地是选自由二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、五亚乙基六胺、 六亚乙基七胺、七亚乙基八胺、八亚乙基九胺、九亚乙基十胺、十亚乙基十一 胺、十一亚乙基十二胺、十二亚乙基十三胺和十三亚乙基十四胺组成的组中的 一种或多种。优选地，它是三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、五亚乙基六胺或六 亚乙基七胺。

R₁和R₂可以优选地各自是具有11至25个碳原子的饱和或不饱和烃基， 并且更优选地是具有13至21个碳原子的不饱和烃基。如果R₁和R₂的每一者 中的碳原子数目小于11，则烃链之间的疏水相互作用可能下降，并且因此不 能形成稳定制剂。在另一方面，如果碳原子数目大于25，则烃之间的疏水相 互作用将增加，并且因此制剂将过度稳定，因而药物的体内解离将减少，导致 药物的功效下降。此外，烃链的曲率将因顺式双键的增加而增加，因此所得到 的制剂将具有低密度并且因而具有低稳定性。

饱和烃基可以具体包括月桂基、肉豆蔻基、棕榈基、十八烷基、二十烷基 (arachidyl)、山萮基、二十四烷基、蜡基等。不饱和烃基优选地具有顺式键并 且可以具体地包括十四碳烯基、9-十六碳烯基（palmitoleyl）、6-十六碳烯基 （sapienyl）、油基、亚油基（linoleyl）、花生四烯基、二十碳五烯基、瓢儿菜 基、二十二碳六烯基等。

本发明也提供一种用于制备药物载体的方法，所述方法包括使下式2表示 的低聚亚烷基胺与下式3表示的脂肪酸酰卤和下式4表示的脂肪酸酰卤反应的 步骤，以便制备式1的阳离子脂质：

[式1]

[式2]

[式3]

[式4]

其中，n和m独立地是0至12，前提条件是2≤n+m≤12，a和b独立地是 1至6，R₁和R₂独立地是具有11至25个碳原子的饱和或不饱和烃基，X是 卤素。

在本发明的一个实施方案中，可以通过低聚亚烷基胺与对应于式1产物的 脂肪酸酰卤反应，制备式1的阳离子脂质。具体地，它可以通过反应方案1 中所显示的反应制备：

[反应方案1]

其中，R₁和R₂，a、b、n和m如上文对式1那样定义，X是卤素，包括 氟、氯、溴或碘。

具体而言，本发明的阳离子脂质是由通过酰胺键连接的亲水性低聚亚烷基 胺和疏水性脂肪酸组成的两性化合物，其中所述酰胺键可以在所述低聚亚烷基 胺的末端处的伯胺基团(-NH₂)和脂肪酸之间形成。

在以上制备方法中，脂肪酸酰卤是源自具有12至26个碳原子脂肪酸的酰 卤。可以在本发明中用作脂肪酸酰卤的饱和脂肪酸的酰卤的优选例子包括月桂 酰氯、肉豆蔻酰氯、棕榈酰氯、硬脂酰氯、二十烷酸酰氯、山萮酰氯、二十四 烷酸酰氯、蜡酸酰氯等，其中更优选是棕榈酰氯、硬脂酰氯、二十烷酸酰氯和 山萮酰氯。

另外，可以在本发明中用作脂肪酸酰卤的不饱和脂肪酸酰卤优选地具有顺 式双键，并且其优选例子包括肉豆蔻油酰氯、棕榈油酰氯、杉皮酸酰氯 （sapienoyl chloride）、油酰氯、亚油酰氯、花生四烯酰氯、二十碳五烯酰氯、 二十二碳烯酰氯，二十二碳六烯酰氯等，其中更优选是肉豆蔻油酰氯、棕榈油 酰氯、杉皮酸酰氯、油酰氯、亚油酰氯、花生四烯酰氯和二十碳五烯酰氯。

本发明的一个实施方案提供一种药物组合物，其包含带负电荷的药物和式 1表示的阳离子脂质，其中所述带负电荷的药物与所述阳离子脂质形成复合 物。在本发明中，带负电荷的药物和式1表示的阳离子脂质彼此发生静电相互 作用以形成复合物，所述复合物增加带负电荷的药物的体内稳定性并介导所述 带负电荷的药物的胞内递送。

根据本发明的一个实施方案，带负电荷的药物意在包括在水溶液中在分子 内携带负电荷的任何药理活性物质。在一个实施方案中，阴离子性质可以由选 自由羧基、磷酸酯基和硫酸酯基组成的组中的一个或多个官能团赋予。在本发 明的一个实施方案中，带负电荷的药物可以是聚阴离子药物或核酸。聚阴离子 药物的例子可以包括肝素、降钙素等。

核酸可以是核酸药物，如脱氧核糖核酸，核糖核酸，或其中主链、糖或碱 基经化学修饰或核酸末端经修饰的多核苷酸衍生物。更优选地，它可以是选自 由RNA、DNA、siRNA(小干扰性RNA)、适配体、反义寡脱氧核苷酸(ODN)、 反义RNA、核酶和脱氧核酶组成的组中的一种或多种核酸。另外，为了增加 核酸在血液中的稳定性或削弱免疫反应，可以将主链、糖或碱基化学修饰或可 以将核酸的末端化学修饰。具体而言，核酸的磷酸二酯键的一部分可以由硫代 磷酸酯或硼烷磷酸酯键替换，或核酸可以包含在一些核糖的2'-OH位置内引入 各种官能团如甲基、甲氧基乙基或氟的至少一个核苷酸。

在另一个实施方案中，可以用选自由胆固醇、生育酚和具有10-24个碳原 子的脂肪酸组成的组中的一种或多种修饰核酸的一个或多个末端。例如， siRNA可以在有义和/或反义链的5'末端或3'末端或两个末端受到修饰，并且 优选地在有义链的末端受到修饰。

上述胆固醇、生育酚和脂肪酸可以包括它们的类似物、衍生物和代谢物。

在本发明中，优选地基于组合物的总重量以0.001wt%至10wt%、尤其 0.01wt%至5wt%的量含有带负电荷的药物。如果带负电荷的药物的含量小于 0.001wt%，与该药物的量相比，递送系统的量将过度增加，并且这可能造成副 作用；同样地，如果该含量大于10wt%，该递送系统可能较不稳定或其尺寸可 能过度增加，并且因此其在过滤灭菌期间损失率可能增加。

阳离子脂质和带负电荷的药物通过静电相互作用彼此结合以形成复合物。 在一个实施方案中，阳离子脂质(N)的电荷对带负电荷的药物(P)的电荷的比率 (N/P)是0.1至128，优选地是0.5至32，并且更优选地是1-16。如果该比率(N/P) 小于0.1，则将难以形成含有足够量的带负电荷的药物的复合物。出于这个原 因，该比率(N/P)应当是0.1或更大，从而可以形成含有足够量的带负电荷的药 物的复合物。在另一方面，如果该比率(N/P)大于128，则所得到的复合物可能 有细胞毒性。

在本发明的一个实施方案中，包含阳离子脂质的药物递送组合物介导核酸 的胞内递送并且增加带负电荷的药物的体内稳定性。

本发明的药物组合物可以是选自由脂质体、胶束、乳液和纳米粒子制剂组 成的组中的制剂。具体而言，它可以是如下的制剂：该制剂中，带负电荷的药 物和阳离子脂质彼此形成复合物并且所述复合物包埋于胶束、脂质体、乳液或 纳米粒子中或与表面结合。

在以上制剂中，优选地基于组合物的总重量以0.001wt%至10wt%、优选 0.01wt%至5wt%的量含有本发明的带负电荷的药物。如果带负电荷的药物的 含量小于0.001wt%，与该药物的量相比，所用的递送系统的量将过度增加， 并且这可能造成副作用；同样地，如果该含量大于10wt%，该递送系统可能更 不稳定或其尺寸可能过度增加，并且因此其在过滤灭菌期间损失率可能增加。

在以上制剂中，优选地基于组合物的总重量以0.01wt%至50wt%、优选 0.1wt%至10wt%的量含有阳离子脂质。如果阳离子脂质的含量小于0.01%，则 它将不足以与带负电荷的药物形成复合物。如该含量小于50wt%，则递送系统 的尺寸将过度增加，因此其体内稳定性可能下降并且其在过滤灭菌期间的损失 率可能增加。另外，过多阳离子能引起细胞毒性。

在本发明的另一个实施方案中，胶束制剂包含阴离子药物、阳离子脂质和 两性嵌段共聚物。具体而言，本发明提供一种脂质体组合物及其制备方法，所 述脂质体组合物包含带负电荷的药物、式1的阳离子脂质和致细胞融合磷脂， 其中所述带负电荷的药物与所述阳离子脂质形成复合物，并且所述复合物与由 致细胞融合磷脂组成的脂质体结合。

两性嵌段共聚物可以是包含亲水性A嵌段和疏水性B嵌段的A-B型嵌段 共聚物。在水溶液中，两性A-B型嵌段共聚物形成芯-壳型聚合物胶束，其中 疏水性B嵌段形成芯部，其具有包埋于其中的带负电荷的药物/阳离子脂质复 合物，并且亲水性A嵌段形成暴露于芯外部的壳。

在一个实施方案中，亲水性A嵌段可以是选自以下的至少一种：聚亚烷 基二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺及它们的衍生物。更优选地， 亲水性A嵌段可以是选自以下的至少一种：单甲氧基聚乙二醇、单乙酰氧基 聚乙二醇、聚乙二醇、聚乙烯和丙二醇的共聚物、以及聚乙烯吡咯烷酮。在另 一个实施方案中，亲水性A嵌段的数均分子量可以是200至50,000道尔顿、 优选地1,000至20,000道尔顿并且更优选地1,000至5,000道尔顿。

如果需要，可以在亲水性A嵌段的末端化学地缀合能抵达特定组织或细 胞的官能团或配体、或能够促进胞内递送的官能团，从而控制聚合物胶束递送 系统的体内分布或增加其胞内递送效率。所述官能团或配体可以是选自以下的 至少一种：单糖、多糖、维生素、肽、蛋白质和针对细胞表面受体的抗体。更 优选地，它可以是选自以下的至少一种：茴香酰胺、维生素B9(叶酸)、维生素 B12、维生素A、半乳糖、乳糖、甘露糖、透明质酸、RGD肽、NGR肽、转 铁蛋白、针对转铁蛋白受体的抗体等。

疏水性B嵌段是具有优异生物相容性和生物可降解性的聚合物。在一个 实施方案中，它可以是选自以下的至少一种：聚酯、聚酐、聚氨基酸、聚原酸 酯和聚膦嗪。更优选地，疏水性B嵌段可以是选自以下的至少一种：聚乳酸、 聚乙交酯、聚己内酯、聚二烷-2-酮、聚乳酸和乙交酯的共聚物、聚乳酸和 聚二烷-2-酮的共聚物、聚乳酸和聚己内酯的共聚物以及聚乙交酯和聚己内 酯的共聚物。在另一个实施方案中，疏水性B嵌段的数均分子量可以是50至 50,000道尔顿，优选是200至20,000道尔顿，更优选是1,000至5,000道尔顿。 另外，为了增加疏水性嵌段的疏水性以改善胶束的稳定性，生育酚、胆固醇或 具有10-26个碳原子的脂肪酸可以化学地与疏水性嵌段末端处的羟基结合。

可以基于组合物的总干重以40-99.98wt%、优选85-99.8wt%、更优选 90-99.8wt%的量含有包含亲水性嵌段(A)和疏水性嵌段(B)的两性嵌段共聚物。 如果两性嵌段共聚物的含量小于40wt%，则胶束的尺寸可能变得如此大，以致 于胶束的稳定性可能下降并且其在过滤灭菌期间的损失可能增加；同样地，如 果该含量大于99.98wt%，则可掺入的带负电荷的药物的含量可能变得太少。

在另一个实施方案中，就亲水性嵌段(A)的含量和疏水性嵌段(B)之间的比 率而言，基于共聚物的重量，两性嵌段共聚物可以包含40wt%至70wt%的亲 水性嵌段(A)，优选包含50wt%至60wt%的亲水性嵌段(A)。如果亲水性嵌段(A) 在共聚物中的含量小于40wt%，则共聚物在水中的溶解度将低，使其难以从共 聚物中形成胶束。出于这个原因，亲水性嵌段(A)在共聚物中的含量优选是 40wt%或更大，以便共聚物具有足以形成胶束的水溶解度。在另一方面，如果 该含量大于70wt%，则共聚物的亲水性将太高并且因此聚合物胶束的稳定性将 低，因此将难以使带负电荷的药物和阳离子脂质的复合物增溶。出于这个原因， 就胶束的稳定性而言，亲水性嵌段(A)在共聚物中的含量优选是70wt%或更小。

在一个实施方案中，胶束结构中带负电荷的药物和阳离子脂质的复合物包 埋于水溶液中的两性嵌段共聚物的胶束结构内，其中带负电荷的药物/阳离子 脂质的重量(a)对两性嵌段共聚物的重量(b)的比率，[a/b×100；(带负电荷的药 物的重量+阳离子脂质的重量)/两性嵌段共聚物×100]，可以是0.001-100wt%， 优选是0.01-50wt%，更优选是0.1-10wt%。如果这个重量比小于0.001wt%， 带负电荷的药物和阳离子脂质的复合物的含量可能下降，并且因此可能难以满 足带负电荷的药物的有效含量，如果该比率大于100wt%，则考虑到两性嵌段 共聚物的分子量和带负电荷的药物/阳离子脂质复合物的量后，不能形成适宜 尺寸的胶束结构。

同时，提供一种用于制备本发明胶束组合物的方法，包括以下步骤：

(a)在水混溶性有机溶剂中或在水溶液和有机溶剂的混合溶剂中溶解带负 电荷的药物和式1的阳离子脂质，并且使该溶液经历相分离；

(b)分离步骤(a)中形成的有机溶剂层；

(c)向步骤(b)产生的有机溶剂层添加两性嵌段共聚物，并且除去所述有机 溶剂；和

(d)向除去了有机溶剂的混合物中添加水溶液，以形成胶束。

在步骤(a)中，在水混溶性有机溶剂或水溶液和有机溶剂的混合溶剂中混合 带负电荷的药物和式1的阳离子脂质以形成复合物。具体地，水混溶性有机溶 剂可以是选自以下的至少一种：丙酮、乙醇、甲醇和乙酸，并且混合溶剂中的 有机溶剂可以是选自以下的至少一种：乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷、氯仿和二 烷。水溶液可以是蒸馏水、注射用水或缓冲溶液。基于使用的溶剂的量， 溶解于溶剂中的带负电荷的药物和阳离子脂质的复合物的量可以是 0.1-100wt%，优选是0.1-10wt%，更优选是0.1-1wt%。如果复合物的量是100wt% 或更多，则用步骤(b)中的有机溶剂提取带负电荷的药物和阳离子脂质的复合 物时，产率可能快速下降。

在步骤b)中，通过相分离回收带负电荷的药物和阳离子脂质的复合物。可 以将水溶剂和有机溶剂添加至步骤(a)的溶剂以引起相分离。另外，为缩短相分 离时间，可以进行离心过程。

在步骤c)中，将两性嵌段共聚物添加至提取的有机溶剂层并且与之混合， 随后通过蒸发除去有机溶剂。

在步骤d)中，将蒸发有机溶剂后剩下的混合物溶解于水溶液中，因而带负 电荷的药物和阳离子脂质的复合物包埋于两性嵌段共聚物的胶束结构中。水溶 液可以是蒸馏水、注射用水或缓冲溶液，并且使用的水溶液的量可以是使得两 性嵌段共聚物的浓度可以是约10-300mg/ml的量。如果两性嵌段共聚物的浓 度小于10mg/ml，则水溶液的体积将增加，因此致使在配制过程期间难以操作 水溶液；同样，如果该浓度大于300mg/ml，则水溶液的粘度将增加，因此致 使难以按顺畅方式制备胶束。

在本发明的又一个实施方案中，提供一种制备包含带负电荷的药物、式1 的阳离子脂质和两性嵌段共聚物的药物组合物的方法，包括以下步骤：

(a')在水混溶性有机溶剂中或在水溶液和有机溶剂的混合溶剂中溶解带负 电荷的药物、式1的阳离子脂质和两性嵌段共聚物；

(b')除去步骤(a')中形成的有机溶剂层；并且

(c')向已经除去了有机溶剂的(b')混合物中添加水溶液，以形成胶束。

在步骤(a')中，在水混溶性有机溶剂或水溶液和有机溶剂的混合溶剂中混 合带负电荷的药物、阳离子脂质和两性嵌段共聚物以形成复合物。具体而言， 水混溶性有机溶剂可以是选自以下的至少一种：丙酮、乙醇、甲醇和乙酸，并 且混合溶剂的有机溶剂可以是选自以下的至少一种：乙酸乙酯、乙腈、二氯甲 烷、氯仿和二烷。水溶液可以是蒸馏水、注射用水或缓冲溶液。

在步骤(b')中，通过蒸发除去有机溶剂。

在步骤(c')中，将蒸发有机溶剂后剩下的混合物溶解于水溶液中，因而带 负电荷的药物和阳离子脂质的复合物包埋于两性嵌段共聚物的胶束结构中。水 溶液及其使用量如上文所述。

在又一个实施方案中，本发明的制备方法可以在步骤(d)或(c')后进一步包 括步骤(e)：添加冷冻干燥用添加剂至胶束，以便冷冻干燥该胶束。

在一个实施方案中，本发明的制备方法可以在冷冻干燥步骤(e)之前进一步 包括以下步骤：用灭菌滤器将步骤(d)或(c')中获得的聚合物胶束水溶液灭菌。

在一个实施方案中，冷冻干燥用添加剂可以是选自以下的至少一种：乳糖、 甘露醇、山梨醇和蔗糖。添加冷冻干燥用添加剂以允许冻干的组合物维持为滤 饼形式。在另一个实施方案中，基于冻干组合物的总干重，添加冷冻干燥用添 加剂的含量可以是1至90wt%，优选是10至60wt%。

在本发明的另一个实施方案中，该组合物可以是含有带负电荷的药物、阳 离子脂质和表面活性剂的胶束形式。具体而言，本发明提供一种胶束组合物， 其包含带负电荷的药物、式1的阳离子脂质和表面活性剂，其中所述带负电荷 的药物与所述阳离子脂质形成复合物，并且所述复合物包埋于所述表面活性剂 的胶束结构中。

这种表面活性剂例如可以是选自以下的至少一种：Tween-20、聚乙二醇单 油基醚、乙二醇单十二烷基醚、二甘醇单己基醚、三甲基十六烷基氯化铵、十 二烷基三甲基溴化铵、环己基甲基β-D-麦芽糖苷、季戊四醇棕榈酸酯、月桂 基二甲胺氧化物和N-月桂酰肌氨酸钠盐。

在本发明的一个实施方案中，脂质体制剂可以包含带负电荷的药物和阳离 子脂质的复合物、以及致细胞融合磷脂。优选地，为了增加带负电荷的药物的 胞内递送效率，本发明的组合物还可以基于组合物的总重量，以0.01wt%至 50wt%，尤其0.1wt%至10w t%的量包含致细胞融合磷脂。这种复合物可以与 脂质体的内部或表面结合。

具体而言，本发明提供一种脂质体组合物，其包含带负电荷的药物、式1 的阳离子脂质和致细胞融合磷脂，其中所述带负电荷的药物与所述阳离子脂质 形成复合物，并且所述复合物与由致细胞融合磷脂组成的脂质体结合。

致细胞融合磷脂的例子可以包括二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕 榈油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)，1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、 1,2-二棕榈油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)等。为了增加脂质体的体内稳定 性，致细胞融合磷脂可以用选自以下的至少一种修饰：聚亚烷基二醇、聚乙烯 醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖及它们的衍生物。具体而言，致细胞融合磷脂可以 用选自以下的至少一种修饰：单甲氧基聚乙二醇、单乙酰氧基聚乙二醇、聚乙 二醇、聚乙烯和丙二醇的共聚物、聚乙烯吡咯烷酮和葡聚糖。

在本发明的另一个实施方案中，以上制剂可以是包含带负电荷的药物和阳 离子脂质的复合物、及表面活性剂的乳液形式。具体而言，本发明提供一种乳 液组合物，其包含带负电荷的药物、式1的阳离子脂质和表面活性剂，其中所 述带负电荷的药物与所述阳离子脂质形成复合物，并且所述复合物包埋于乳液 中。

乳液制剂中含有的表面活性剂的例子可以包括阳离子表面活性剂、两性离 子表面活性剂和非离子表面活性剂。可以在本发明中使用的阳离子表面活性剂 的例子包括鲸蜡基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵等，可以在本发明中 使用的两性离子表面活性剂的例子包括十二烷基甜菜碱、十二烷基二甲胺氧化 物、3-(N,N-二甲基棕榈基氨基)丙烷磺酸酯等。另外，可以在本发明中使用的 非离子表面活性剂的例子包括Tween-20、Tween-80、Triton-X-100、聚乙二醇 单油基醚、三甘醇单十二烷基醚、辛基葡糖苷、N-壬酰-N-甲基葡糖胺等。

用于递送带负电荷的药物的由制剂如阳离子脂质体、胶束或乳液制剂组成 的本发明的药物递送组合物可以显著地增强所需的带负电荷的药物进入动物 细胞中的递送效率并且还减少所述带负电荷的药物的细胞毒性。

在一个实施方案中，本发的药物组合物可以按水溶液剂、散剂或片剂的形 式配制。在另一个实施方案中，这种组合物可以配制用于注射。另外，散剂制 剂可以用注射用蒸馏水、0.9%盐水溶液、5%右旋葡萄糖水溶液等重构。

根据本发明制备方法形成的药物组合物是在血液中稳定，并且具有 10-200nm、优选10-150nm的粒度。

本发明的含有带负电荷的药物的药物组合物可以以静脉内、肌内、皮下、 口服、骨内、透皮、局部等方式施用，并且药物组合物可以按多种形式如溶液 剂、注射混悬剂、片剂、胶囊剂等配制。

有益效果

本发明的阳离子脂质与带负电荷的药物如核酸或阴离子活性物质形成复 合物，以允许带负电荷的药物的胞内递送。另外，离子脂质与额外组分一起可 以形成脂质体、胶束、乳液或纳米粒子制剂以增加带负电荷的药物的血液或体 内稳定性。另外，该递送系统减少阳离子脂质的正电荷的细胞毒性并且也显著 地提高胞内递送核酸的效率。因此，这种阳离子脂质将可用作能够增加核酸或 阴离子活性物质的治疗作用的药物递送载体。

另外，使用廉价的低聚亚烷基胺以及脂肪酸衍生物就可以容易地以高产率 合成式1的阳离子脂质，并且不同于现存的合成脂质，式1的阳离子脂质以非 常简单的方式纯化。

尤其，当本发明组合物的带负电荷的药物是核酸时，可以将它导入细胞中 以治疗由致病蛋白的异常表达或过量表达引起的多种疾病，如肿瘤、关节炎、 心血管系统或内分泌系统的疾病。

附图说明

图1显示¹H NMR测量实施例1中合成的1,6-二油酰三亚乙基四酰胺的结 果。

图2显示¹H NMR测量实施例2中合成的1,8-二亚油酰四亚乙基五酰胺的 结果。

图3显示¹H NMR测量实施例3中合成的1,4-二肉豆蔻油酰基二亚乙基三 酰胺的结果。

图4显示¹H NMR测量实施例4中合成的1,10-二硬脂酰五亚乙基六酰胺 的结果。

图5显示¹H NMR测量实施例5中合成的1,10-二油酰五亚乙基六酰胺的 结果。

图6显示¹H NMR测量制备实施例1中合成的mPEG-PLA嵌段共聚物的 结果。

图7显示¹H NMR测量制备实施例2中合成的mPEG-PLA生育酚嵌段共 聚物的结果。

图8显示¹H NMR测量制备实施例3中合成的AC-胆固醇的结果。

实施方式

下文，将参考实施例进一步详细描述本发明。然而，应当理解，这些实施 例仅用于说明目的并不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1：1,6-二油酰三亚乙基四酰胺的合成

按以下方式通过三亚乙基四胺和油酰氯之间的亲核性加成反应合成1,6- 二油酰三亚乙基四酰胺。

将1.12g(7.5mmol)三亚乙基四胺添加至25mL二氯甲烷中并在搅拌下在 冰水浴中在5°C溶解30分钟。在独立反应器中向该溶液中逐滴缓慢添加2.00 g(6.0mmol)油酰氯在20mL二氯甲烷中的溶液，同时使其在5°C反应3小时。 由于反应期间产生的氯化氢，未反应的三亚乙基四胺HCl（三亚乙基四胺盐酸 盐）沉淀。在反应结束之前，取出上层溶液并且通过采用流动相乙醇:氯仿(2:1) 的薄层层析(TLC)分析，以确定反应是否完成。在确定该反应已经完成后，使 用滤纸除去沉淀物。

随后，将过滤后的上层溶液在旋转蒸发器中蒸发以除去溶剂，并且用配备 冷阱的真空泵干燥。将所得到的物质溶解于35mL乙醚中并且随后在分液漏 斗中用10mL的0.5M NaOH提取2次。

随后，将上层的有机溶剂层在减压下于旋转蒸发器中加热并蒸馏以便完全 除去溶剂，此后通过薄层层析分析残余物以确定其是否被纯化。通过¹H NMR 波谱仪测量所得产物的结构和在产物中引入油酰基的程度，并且在图1中显示 测量结果。产物的产率是89.1%，并且将2.1当量的油酰基引入三亚乙基四胺。

实施例2：1,8-二亚油酰四亚乙基五酰胺的合成

按照与实施例1相同的方式合成和纯化1,8-二亚油酰四亚乙基五酰胺，不 同在于使用6.2mmol亚油酰氯和4.1mmol四亚乙基五胺代替油酰氯和三亚乙 基四胺。通过¹H NMR波谱仪测量所得产物的结构和在产物中引入亚油酰基的 程度，并且在图2中显示测量结果。产物的产率是78.9%，并且将1.9当量的 亚油酰基引入四亚乙基五胺。

实施例3：1,4-二肉豆蔻油酰基二亚乙基三酰胺的合成

按照与实施例1相同的方式合成和纯化1,4-二肉豆蔻油酰基二亚乙基三酰 胺，不同在于使用8.1mmol肉豆蔻油酰亚油酰氯和13.5mmol二亚乙基三酰 胺代替油酰氯和三亚乙基四胺。通过¹H NMR波谱仪测量所得产物的结构和在 产物中引入肉豆蔻油酰亚油酰基的程度，并且在图3中显示测量结果。产物的 产率是80.4%，并且将2.1当量的肉豆蔻油酰亚油酰基引入二亚乙基三酰胺。

实施例4：1,10-二硬脂酰五亚乙基六酰胺的合成

按照与实施例1相同的方式合成和纯化1,10-二硬脂酰五亚乙基六酰胺， 不同在于使用4.2mmol硬脂酰氯和6.9mmol五亚乙基六胺代替油酰氯和三亚 乙基四胺。通过¹H NMR波谱仪测量所得产物的结构和在产物中引入硬脂酰基 的程度，并且在图4中显示测量结果。产物的产率是87.1%，并且将2.0当量 的硬脂酰基引入五亚乙基六胺。

实施例5：1,10-二油酰五亚乙基六酰胺的合成

按照与实施例1相同的方式合成和纯化1,10-二油酰五亚乙基六酰胺，不 同在于使用10.0mmol五亚乙基六胺代替三亚乙基四胺。通过¹H NMR波谱仪 测量所得产物的结构和在产物中引入油酰基的程度，并且在图5中显示测量结 果。产物的产率是88.2%，并且将2.1当量的油酰基引入五亚乙基六胺。

制备实施例1：单甲氧基聚(乙二醇)-丙交酯(mPEG-PLA)嵌段共聚物(A-B)(数均分子量：5,000-4,000Da)的合成

将10g单甲氧基聚(乙二醇)(分子量：5,000Da)置于100-mL双颈圆底烧瓶 中并在真空(1mmHg)中在120°C干燥5小时。向反应烧瓶充入干燥氮气，并且 用注射器将辛酸锡(Sn(Oct)₂)在甲苯中的50%溶液连同0.3wt%(30mg)DL丙交 酯注入该烧瓶中。将反应混合物搅拌30分钟并且在120°C泄压至1mmHg持 续1小时以除去甲苯。向其添加8.46g纯化的丙交酯，并且将混合物在130°C 加热6小时。通过以上过程获得的mPEG-PLA具有数均分子量5,000-4,000Da 并且从图6中的¹H-NMR结果确定是A-B型。

制备实施例2：mPEG-PLA-生育酚(分子量：5,000-4,000-530Da)的合成

将制备实施例1中合成的5g mPEG-PLA置于100-ml双颈圆底烧瓶中并 在真空中在120°C干燥3小时。向其中添加3mL35.5mg(645μmol)生育酚琥 珀酰氯的溶液并使其在真空于100°C反应8小时。所得到的聚合物溶解于二氯 甲烷中并且在庚烷中析出，因而将它纯化。在真空中将纯化后的聚合物干燥， 以产生粉末粒子。产物的产率是94.2%，并且如可以从图7中的¹H-NMR分析 的结果看出，纯度是97.0%或更大，并且导入生育酚的比率是99.9%。

制备实施例3：AC-胆固醇(3-β[N-(氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇)的合成

为了与本发明的阳离子脂质比较胞内递送效率，按以下方式合成已知的 AC-胆固醇阳离子脂质。

将1g(2.23mmol)胆固醇甲酰氯溶解于20ml氯仿中。将胆固醇甲酰氯溶液 在4°C缓慢添加至20倍当量乙二胺在30ml氯仿中的溶液中，并随后使其在 室温反应3小时。在反应完成后，使用旋转蒸发器除去溶剂，并且将残余物再 次溶解在少量氯仿中，随后用饱和NaCl溶液和NaCO₃提取，以回收氯仿层。

随后，使用旋转蒸发器除去溶剂，并且将残余物再次溶解在氯仿中并通过 硅胶层析分离。向氯仿:甲醇=9:1(v/v)中所洗脱的级分，以相对于胆固醇甲酰氯 为50当量的量添加氢氯酸溶液，并且向其中添加少量甲醇直至形成单一相， 从而形成AC-胆固醇盐酸盐。

随后，使用旋转蒸发器完全除去溶剂，并且将留下的AC-胆固醇HCl（AC- 胆固醇盐酸盐）在60°C溶解于甲醇中并且随后冷却至4°C，因而使其重结晶。 产物的产率是51%。通过¹H NMRNMR波谱仪分析AC-胆固醇是否被合成， 并且在图8中显示这项分析的结果。

实施例6：含有1,6-二油酰三亚乙基四酰胺的阳离子脂质体的制备

6-1：含有阳离子脂质的阳离子脂质体的制备

将实施例1中合成的1.3mg阳离子脂质1,6-二油酰三亚乙基四酰胺和1.7 mg致细胞融合磷脂DOPE(Avanti Polar Lipids公司)各自溶解于1mL氯仿中， 并且随后将两个溶液在单颈圆底烧瓶中混合。随后，在旋转蒸发器中从混合物 中缓慢除去氯仿，因而制备脂质薄膜。将1mL磷酸盐缓冲盐水添加至该脂质 薄膜，接着在37°C搅拌3分钟，从而制备脂质体。使脂质体溶液经过挤出机 几次，所述挤出机配备具有0.2μm孔径的聚碳酸酯膜，从而制备具有均匀粒度 的脂质体。在使用之前在4°C贮存如此制备的阳离子脂质体。

6-2:GFP siRNA的掺入

将0.5μl实施例6-1中制备的脂质体溶液添加至Opti-MEM血清培养基 (Invitrogen公司)并与之混合。将购自ST Pharm Co.,Ltd.公司(韩国)的2 μl(34ng/μl)GFP siRNA(包含SEQ ID Nos:1和2的链)添加至脂质体溶液并用搅 拌器混合。将脂质体制剂在室温贮存20分钟并且随后添加至细胞系培养物。

GFP siRNA(ST Pharm Co.,Ltd.,韩国)

有义链：5'-GCAAGCUGACCCUGAAGUUdTdT-3'(SEQ ID NO:1-dTdT)

反义链：5'-AACUUCAGGGUCAGCUUGCdTdT-3'(SEQ ID NO:2-dTdT)

实施例7：含有1,6-二油酰三亚乙基四酰胺的mPEG-PLA胶束的制备

将siRNA的负离子电荷对阳离子脂质的正离子电荷的比率(N/P比率)设定 为6，并且按相同方式制备具有N/P比率6的siRNA-阳离子脂质复合物。

在单颈圆底烧瓶中，将33μg实施例1中制备的1,6-二油酰三亚乙基四酰 胺与100μl氯仿和100μl乙醇混合并在室温完全溶解，并且将这种溶液添加至 在实施例6-2中制备的含有5μg siRNA的100μl溶液中。向对象溶液添加100 μl蒸馏水和100μl氯仿以便相分离。在相分离后，仅收集氯仿层，因此获得 siRNA-阳离子脂质复合物。

将9mg制备实施例1的mPEG-PLA和34μg DOPE添加至该复合物并且在 60°C搅拌5分钟。这里，将siRNA/1,6-二油酰三亚乙基四酰胺复合物对 mPEG-PLA的比率设定在0.42wt%。在减压下在旋转蒸发器中蒸馏混合物以除 去溶剂。将300μl蒸馏水添加至烧瓶，随后温和振摇所述烧瓶，从而制备聚合 物胶束递送系统。

实施例8：含有1,6-二油酰三亚乙基四酰胺的mPEG-PLA-生育酚的制备

按照与实施例7相同的方式制备siRNA/1,6-二油酰三亚乙基四酰胺胶束递 送系统，不同在于使用制备实施例2的mPEG-PLA-生育酚代替mPEG-PLA。 这里，将siRNA/1,6-二油酰三亚乙基四酰胺复合物对mPEG-PLA-生育酚的比 率设定在0.42wt%。在减压下在旋转蒸发器中蒸馏混合物以除去溶剂。将300μl 蒸馏水添加至烧瓶，随后温和振摇所述烧瓶，从而制备聚合物胶束递送系统。

对比实施例1：含有AC-胆固醇的mPEG-PLA-生育酚的制备

为了与本发明的阳离子脂质制剂比较胞内递送效率，使用46μg AC-胆固 醇(在制备实施例3中合成)，按照与实施例6相同的方式制备mPEG-PLA-生 育酚胶束，使得5μg实施例6-2的siRNA的负离子电荷对复合物的正电荷的 比率(N/P比率)是6。这里，将siRNA/AC-胆固醇复合物对mPEG-PLA-生育酚 的比率设定在0.57wt%。

实施例7：含有1,6-二油酰三亚乙基四酰胺的阳离子乳液的制备

向5.5mg实施例1中制备的阳离子脂质1,6-二油酰三亚乙基四酰胺中添 加0.1倍摩尔比的1.0mg Tween-80。向其中添加10mL磷酸盐缓冲盐水，并 且使用均化器在室温将混合物均质化约2分钟，从而制备水包油(O/W)型阳离 子乳液。将2.5μl该阳离子乳液添加至15.5μl Opti-MEM血清培养基(Invitrogen  公司)并与之混合。向其中添加实施例6-2的2μl(34ng/μl)GFP siRNA并且搅 拌混合物，从而获得乳液。将乳液制剂在室温贮存20分钟并且随后添加至细 胞系培养物。

实验例1：通过分析蛋白质表达来评价含阳离子脂质的递送制剂的siRNA递送效率

对于稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的A549GFP细胞系，分别用实施例6 至9和对比实施例1中制备的每种制剂进行处理，并且检查细胞中GFP蛋白 质的表达。

具体而言，将1ⅹ10⁴个细胞分配至96孔细胞培养平板的每个孔中，并且 在24小时后，确定每个孔中的细胞生长至约60-70%汇合度。随后，移除每个 孔中的培养基并且将80μl10%含血清的新鲜培养基添加至每个孔。随后，将 20μl的实施例6至9和对比实施例1的含有15nMsiRNA的每种组合物添加至 每个孔，并且将细胞在5%CO₂培养箱中于37°C培养24小时，随后更换新鲜 培养基。同时，对照组仅用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理。

在24小时后，移除每个孔中的培养基，此后用PBS洗涤每个孔3次。为 了评价由每种GFP siRNA递送系统引起的GFP蛋白表达的抑制作用，用微量 平板读数仪(BioTek,Synergy HT多模式微量平板读数仪)(激发波长：485/20nm， 发射波长：528/20nm)测量细胞中GFP的荧光。另外，评价仅用PBS处理的对 照组。在测量GFP荧光后，使用磺酰罗丹明B试剂，对细胞进行SRB存活率 测定，并且随后在540nm测量UV吸光度，从而确定细胞存活率。通过GFP 荧光除以细胞存活率进行校正，表1中显示校正结果。另外，与市售的递送系 统lipofectamine(LipofectAMINE2000，Invitrogen公司，USA)进行比较。

[表1]

如上述表1所示，在本发明实施例中制备的组合物高效地递送siRNA至 细胞中，甚至在非常低的siRNA浓度下也是如此，并且抑制靶蛋白GFP的表 达约35至50%。另外，这些组合物抑制GFP蛋白的表达至类似于或高于由 Lipofectamine所实现的水平，同时它们显示较高的细胞存活率。这表明，本发 明的组合物具有低于Lipofectamine的细胞毒性，同时显示优异活性。此外， 可以观察到本发明的组合物的siRNA递送效率高于对比实施例1约30%。

实验例2：通过分析mRNA表达来评价含阳离子脂质的递送制剂的siRNA递送效率

对于实施例6至9和对比实施例1的组合物，在mRNA水平评价递送 siRNA进入细胞的效率。对每种递送制剂所用的处理条件与实验例1中所用的 那些处理条件相同，但是siRNA以不同浓度即5nM和15nM使用，并且使用 qRT-PCR(定量性逆转录-聚合酶链反应)按以下方式测量细胞中GFP mRNA的 表达。

具体而言，将细胞在96孔板中用每种递送制剂处理，并且在48小时后， 移除每个孔中的细胞培养基，并随后用PBS洗涤每个孔3次。使用Trizol试 剂(Invitrogen公司)从细胞分离总RNA，并且使用高性能RNA-至-cDNA主混 合物(Invitrogen公司)，将分离的RNA逆转录(RT)成cDNA。通过PCR扩增逆 转录的cDNA。以这种方式，从以上分离的RNA扩增甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH)mRNA，并且将GFP mRNA的表达定量。同时，对照组仅用PBS处 理。下表2中显示定量的结果。

[表2]

如上述表2所示，在本发明实施例中制备的组合物显示出GFP mRNA表 达与siRNA浓度成比例地下降。在低至5nM的siRNA浓度，这些组合物抑 制GFP mRNA的表达约50%，在15nM的siRNA浓度，这些组合物抑制GFP mRNA的表达95%或更多。从表2中的结果可见，本发明组合物抑制基因表 达的能力与Lipofectamine相似，并且尤其在约5nM的低siRNA浓度时，比 Lipofectamine高约2倍。这表明实施例的组合物比Lipofectamine更高效地抑 制靶mRNA的表达。另外，与对比实施例1的结果相比，作为使用本发明阳 离子脂质的结果，本发明组合物的siRNA递送效率在约5nM的低siRNA浓度 时增加约10倍或更多。因此，可以观察到，本发明的阳离子脂质可以实现比 现存阳离子脂质更高的siRNA递送效率，甚至当使用更少量的siRNA时也是 如此。