唾液腺组织特异性表达外源蛋白的转基因载体和转基因猪及其构建方法

摘要

本发明公开了一种唾液腺组织特异性表达外源蛋白的转基因载体及其构建方法，所述表达载体是通过将葡聚糖酶基因、木聚糖酶基因、以及植酸酶基因构建重组的融合基因插入到腮腺组织特异性的转基因载体中构建得到的；将该载体导入猪的基因组，并采用体细胞核移植技术生产出转基因猪。本发明针对大麦原料葡聚糖酶，小麦、玉米中木聚糖酶，和植物性饲料中的植酸酶都有水解作用，利用猪唾液腺做为反应器，终生分泌，达到永久代替饲料中这些酶制剂的添加，更好的发挥这些酶的作用；本发明的表达载体具有piggyBac转座子，极大地提高了转基因效率，且将普通质粒串联重组的转基因整合模式变成了单位点单拷贝整合，更好的模拟生物基因的内环境。

说明书

技术领域

本发明技术属于基因工程领域，更具体地，本发明涉及一种唾液腺组织特异性表达外源蛋白的转基因载体和转基因猪及其构建方法。 

背景技术

β-葡聚糖属于植物细胞壁中的结构性非淀粉多糖，是由β-1,3和β-1,4糖苷键连接而成的D型葡萄糖聚合体，分子量大约在6500KDa以上，分水溶性和非水溶性两种，其溶解性受结构中糖苷键含量和聚合度的影响，广泛存在于高等植物细胞壁中，在大麦、小麦、黑麦等禾谷类农作物胚乳细胞壁中含量高，大麦中β-葡聚糖含量约4%-10%。β-葡聚糖酶(β-glucanase)可以水解大麦、小麦和黑麦等谷物中的β-葡聚糖，催化裂解β-葡聚糖分子中β-1,3和β-1,4糖苷键，降解生成小分子寡糖和葡萄糖。 

木聚糖在植物细胞壁中的含量仅次于纤维素，是半纤维素中含量最丰富的一种，在各种饲料原料特别是麦类、谷物副产品及杂粕中含量较多。木聚糖是由D－木糖主链（以β-1,4键相连）和L－阿拉伯糖分枝（a-1,2和a-1,3相连）所组成的聚合物，由于它是由阿拉伯糖和木糖两种单糖聚合而成，因此也称阿拉伯木聚糖。聚糖本身难以被单胃动物消化吸收，而且阿拉伯木聚糖形成一种胞衣剂，阻碍植物细 胞壁内蛋白质、碳水化合物、脂肪等底物与消化酶结合，同时使消化物的黏稠度提高，阻碍营养物质尤其是脂肪、蛋白质的消化、吸收和利用，降低饲料的转化效率。聚糖能直接结合消化道中胰蛋白酶、脂肪酶等消化酶，使其活性降低，同时和胆汁盐、脂类、胆固醇结合，影响脂类在小肠的吸收。阿拉伯木聚糖提高了动物肠道中食穈的黏度，降低了食穈在消化道中的移动速度，促进细菌的大量增殖，使畜禽腹泻率增加，包括氮和磷在内的排泄物也增加，造成对环境的污染。木聚糖酶是专一降解木聚糖的酶，属于水解酶类，可将木聚糖分解为木寡糖。木聚糖酶主要由β-1,4-D-内切木聚糖酶、β-1,4-D-外切木糖苷酶和α-L-阿拉伯糖苷酶、α-D-氨基酸醛酸酶等脱支链酶构成。 

植酸是植物性饲料中普遍存在的一种抗营养因子，所有植物性饲料都含有1%－5%的植酸盐，这些盐的含磷量占饲料总含磷量的60%－80%。由于单胃动物消化道内不含植酸酶，导致其无法或不能很好利用植物性饲料中的磷，植酸磷大部分难以被猪和禽所利用而随粪便排出体外，污染环境。另外植酸具有很强的络合能力，可与许多矿质元素和蛋白质络合形成稳定的复合物，从而降低了这些营养物质的利用率。植酸酶可使植酸磷降解成肌醇和磷酸，从而减少饲料中磷酸氢钙等无机磷的添加量，另外，研究结果还发现了植酸酶的潜在营养价值：能够提高饲料中蛋白质和能量的消化率。植酸酶的应用在一定的程度上能缓解我国磷资源的匮乏、减少磷资源的浪费、降低磷排放所带来的污染。 

葡聚糖酶、木聚糖酶、植酸酶是动物饲料添加剂最常用外源酶 制剂。在禽畜产品养殖中应用饲用酶制剂既能提高饲料的消化率和利用率，提高畜禽的生产性能，又能减少畜禽排泄物中的氮、磷的排泄量，保护水体和土壤免受污染，是一类高效、无毒副作用和环保型的“绿色”饲料添加剂。饲料酶制剂添加对提高动物营养利用，降低成本有一定的积极作用，同时也存在不少问题。目前绝大多开发饲料用酶的性质不够优良，极少酶能在pH、热稳定性、抗胃蛋白酶，胰蛋白酶等能力方面聚各优点于一身；饲料酶制剂的添加成本限制酶制剂使用，为了不增加养殖成本，每吨饲料酶制剂成本都不超过100元（杨培龙等，2009）。此外，这些外源消化酶动物自身不能分泌，一直以来都是先利用微生物发酵获得相应的酶，在人工添加饲料中，添加到饲料中的添加剂容易受饲料制粒、膨化、贮存等因素影响，其活力及其稳定性方面常受各种因素影响，导致酶制剂添加在实际生产中效果不明显，且需要不断添加，效果不理想，成本高。 

转基因技术为该问题的解决提供了技术支持。转基因动物技术一般是利用基因工程手段构建转基因载体，借助大肠杆菌等微生物在其体内大量复制，进而获取大量目的DNA片段，然后通过原核注射、胞浆内精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）或者筛选转基因细胞结合体细胞克隆等技术获得转基因动物。转基因载体借助电穿孔、脂质体或者病毒导入动物细胞，然后经过药物筛选即可获得转基因细胞，进行体细胞克隆的技术也是目前获得转基因猪最常用方法。但是这些方法都存在各种缺点和不足。如转基因动物制备效率低；转入的外源基因在动物体内遗传、表达不稳定等。传统的转基因载体 片段往往以多拷贝串联方式（concatamer）、被动地、随机整合到基因组一个或多个位点，不但效率低下，还导致转入基因遗传和表达不稳定（Garrick et al，1998；Scrable et al，1999）。转基因环保猪的研究还涉及到多基因共表达、载体过大（>15kbp）等问题，传统转基因载体更难获得稳定遗传的转基因细胞系。病毒载体虽整合效率高，但其承载能力有限和可能存在的安全问题限制其进一步应用。 

随着我国养猪业的快速发展，养猪生产正面临饲料成本不断攀升压力和养殖环保的挑战。提高猪对饲料营养元素吸收和沉积、降低养猪场废物中氮磷等主要污染物排放刻不容缓。 

环保型转基因动物生产原理是利用现有转基因技术和方法通过组织特异表达转基因载体，把外源消化酶基因及其组织特异表达的调控元件转运并整合到动物基因组中，这些外源消化酶基因在其组织特异启动子调控下，实现在特定动物器官组织中持续表达和分泌外源消化酶，这些分泌的消化酶在动物特定分泌器官中与动物自身消化酶一起直接分泌到动物消化道，去消化动物自身消化酶不能消化的抗营养因子。目前比较成功的案例是通过原核注射获得转大肠杆菌植酸酶基因猪Serguei P.Golovan(2001)，中国农大转植酸酶猪（2006），然而由于饲料抗营养因子成分复杂，种类多，如非淀粉多糖中：玉米木聚糖、麦类植物中的葡聚糖，木聚糖、大豆中的甘露聚糖，这些环境友好型猪仅能满足植酸磷的分解，吸收，对其他影响动物营养消化吸收非淀粉多糖（葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖等）抗营养因子无效，还达不到节粮减排的目的。且这些转基因猪都是采用传统随机整合技术制 备，转入基因片段常以串联多拷贝重复，转基因稳定性降低；随机整合，转基因位点不易鉴定。 

腮腺蛋白是腮腺中表达丰度最高的蛋白。腮腺蛋白基因定位在小鼠2号染色体上，在基因组中该基因以单拷贝形式存在，且主要在腮腺特异表达，还有研究显示其在唾液腺的颌下腺和舌下腺也有低表达。研究显示该基因主要是由腮腺蛋白基因的上游调控区（11.5Kb）和下游序列(约2.5～3kb)(即腮腺蛋白启动子PSP)调控的，但其调控基因仅在唾液腺中调控表达，在全身其他组织器官不表达。唾液腺表达外源蛋白的转基因动物原理就是借助腮腺蛋白启动子可以把目的蛋白（酶或者药物）在腮腺、舍下腺以及下颌下腺等唾液腺体经表达后直接分泌到动物唾液中，经口腔进入动物消化道，来发挥其功能。 

发明内容

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种唾液腺组织特异性表达外源蛋白(自身分泌葡聚糖酶-木聚糖酶-植酸酶等多种酶)的转基因载体和转基因猪及其构建方法,从而提高动物对饲料营养利用率，达到减磷，氮排放目的，实现节粮减排环保型转基因动物的研究和生产。 

为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案： 

一种唾液腺组织特异性表达外源蛋白的转基因载体的构建方法，包括以下步骤： 

(1)、利用E2A、P2A和T2A的2A多肽序列将SEQ ID NO:1所 示的葡聚糖酶基因Bg17、SEQ ID NO:2所示的葡聚糖酶基因Eg1314、SEQ ID NO:3所示的木聚糖酶基因XynB、以及SEQ ID NO:4所示的植酸酶基因APPA构建重组β-葡聚糖酶基因-木聚糖酶基因-植酸酶基因融合基因Bg17-E2A-Eg1314-flag-P2A-XynB-T2A-APPA-HA； 

(2)、分别以质粒pcDNA3.1(+)和pT2AL200R175-CAGGS-EGFP为模板，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、及SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8为引物进行第一次PCR扩增，获得带有若干重叠序列的neo基因和EGFP基因；各取0.5-3μL混合后作为模板进行第二次PCR扩增，纯化得到neo-EGFP融合基因；用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切pcDNA3.1(+)和neo-EGFP融合基因，纯化回收酶切产物，连接，构建得到pcDNA-Neo-T2A-EGFP载体； 

(3)、以质粒pPB-UbC-EGFP-neo为模板，分别以SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、及SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12作为引物，进行PCR扩增得到NotⅠ-5-PB-NotⅠ，XhoⅠ-3-PB-XhoⅠ，分别采用NotⅠ和XhoⅠ酶切后，连接在载体pPSPBGPneo-XynB上，得到载体pPSPBGPneo-PB-XynB； 

(4)、以步骤(2)得到的pcDNA-neo-T2A-EGFP载体为模板，用长片段PCR体系，SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14作为引物进行PCR扩增得到infusion-CMV-neo-T2A-EGFP片段，切胶纯化；用ClaⅠ和BglⅡ双酶切步骤(2)得到的载体pPSPBGPneo-PB-XynB，对目的片段切胶纯化；将infusion-CMV-neo-T2A-EGFP片段重组到 pPSPBGPNeo-PB-XynB载体的两个loxp位点中间，得到pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB-XynB载体； 

(5)、以步骤(4)得到的pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB-XynB载体为模板，SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16作为引物，进行PCR扩增，得到载体中的pPB-lox-neoEGFP-loxp片段，并添加AgeI限制性内切酶位点，纯化，得到新载体骨架； 

(6)、以小鼠腮腺蛋白基因上游调控区的PCR扩增片段为模板，SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18为引物，扩增得到小鼠腮腺蛋白上游调控区的下游4009bp片段，将4009bp片段与新载体骨架pPB-lox-neoEGFP-loxp中的重组序列进行重组，得到中间载体1； 

(7)、以小鼠腮腺蛋白基因上游调控区的PCR扩增片段为模板，以SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20为引物，扩增得到小鼠腮腺蛋白上游调控区的下游4706bp片段；将其重组到步骤(6)的中间载体1的StuI位点，即为中间载体2； 

(8)、以小鼠腮腺蛋白基因上游调控区的PCR扩增片段为模板，以SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22为引物，利用AgeI位点，扩增得到小鼠腮腺蛋白上游调控区的下游3956bp片段；将其重组到步骤(7)的中间载体2上，得到载体pPB-MusPSP-neo-EGFP； 

(9)、将步骤(1)得到的β-葡聚糖酶基因-木聚糖酶基因-植酸酶基因融合基因Bg17-E2A-Eg1314-flag-P2A-XynB-T2A-APPA-HA用in-fusion重组酶（Clontech公司）重组步骤(8)得到的载体pPB-MusPSP-neo-EGFP的ASCI位点，唾液腺组织特异性表达外源蛋 白的转基因载体 

pPB-MusPSP-neo-EGFP-BgEgXyAp，序列号为SEQ ID NO:35。 

在其中一个实施例中，步骤(1)中所述融合基因BgEgXyAp的构建方法包括以下步骤： 

(1)、以SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28为引物，SEQ ID NO:36为模板扩增Bg17-E2A； 

(2)、以SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30为引物，SEQ ID NO:36为模板扩增E2A-Eg1314； 

(3)、利用重叠延伸PCR，以SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30为引物，以摩尔比为1:1混合的Bg17-E2A和E2A-Eg1314为模板，获得Bg17-E2A-Eg1314-flag； 

(1)-(3)中PCR扩增的反应程序为：98℃1min；98℃10s；60℃5s；72℃1min;35个循环；72℃2min。 

(4)、以SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32为引物，以插入XYNB基因片段的pcDNA3.1载体为模板，扩增得到P2A-XynB-T2A； 

(5)、以SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34为引物，以插入APPA基因片段到pcDNA3.1载体为模板，扩增得到T2A-APPA-HA； 

(6)、以SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:34为引物，以摩尔比为1:1:1的Bg17-E2A-Eg1314-flag、P2A-XynB-T2A、T2A-APPA-HA混合作为模板，扩增获得融合基因BgEgXyAp； 

(4)-(6)中PCR扩增的反应程序为：98℃1min；98℃10s；60℃5s；72℃2min;35个循环；72℃2min。 

在其中一个实施例中，所述步骤(6)-(8)中的小鼠腮腺蛋白基因上游调控区的PCR扩增片段的克隆方法为：以FVB小鼠基因组DNA为模板，SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24为引物，KOD-FX聚合酶进行第一次PCR扩增；以第一次扩增的产物为模板，SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26为引物，进行第二次PCR扩增，即得。 

在其中一个实施例中，所述步骤(6)-(8)中第一次PCR扩增的反应程序为：94℃2min；98℃10s，74℃13min，5cycles；98℃10s，72℃13min,5cycles；98℃10s，70℃13min，5cycles；98℃10s,68℃13min,30cycles；68℃7min；所述第二次PCR扩增的反应程序为：94℃2min；98℃10s,68℃13min,30cycles；68℃7min。 

在其中一个实施例中，步骤(2)中所述第一次PCR的反应程序为：98℃2min；98℃10s，68℃50s，35个循环；72℃10min；第二次PCR反应程序：98℃2min；98℃10s，68℃1min40s，35个循环；72℃10min。 

在其中一个实施例中，步骤(3)中所述PCR的反应程序为：94℃30s；55℃30s，35个循环；72℃30s，72℃3min，30个循环；步骤(4)中所述PCR的反应程序为：98℃2min；98℃10s，68℃4min，35个循环；72℃10min；步骤(5)-(8)中所述PCR的反应程序为：98℃1min；98℃10s；60℃5s；72℃2min;35个循环；72℃2min。 

本发明还提供了上述构建方法构建得到的唾液腺组织特异性表达外源蛋白的转基因载体pPB-MusPSP-neo-EGFP-BgEgXyAp，序列号为SEQ ID NO:35，可以自身表达葡聚糖酶-木聚糖酶-植酸酶等多 种酶。 

本发明还提供了一种唾液腺组织特异性表达外源蛋白的转基因猪的构建方法，包括以下步骤： 

(1)、将上述的转基因载体pPB-MusPSP-neo-EGFP-BgEgXyAp与转座酶质粒PCMV-mpb混合转染猪胎儿成纤维细胞系，筛选可稳定表达载体的单克隆转基因细胞系； 

(2)、将获得的单克隆转基因细胞系作为核供体细胞，注射到卵母细胞中，构建重构胚胎，采用常规育种技术进行培育，即可得到多基因共表达的转基因猪。 

在其中一个实施例中，所述转基因载体pPB-MusPSP-neo-EGFP-BgEgXyAp与转座酶质粒PCMV-mpb的摩尔数比为1:1。 

在其中一个实施例中，所述可稳定表达载体的单克隆转基因细胞系的筛选步骤为：将转染后的细胞铺板36小时后，按照1:6传代，首先在细胞筛选培养基中添加G418300ug/ml，对转染后的细胞筛选5天后，再改用200ug/ml浓度继续筛选10天，接着改为80ug/ml维持筛选，同时在15%FBS肽牛血清培养基中添加2.5-5ng/mL BFGF，得到带绿色荧光的细胞团，待细胞团长成片后，小心刮去周围没荧光细胞，用0.05%胰酶消化传代，传至2-3代后，再检测绿色荧光表达。挑选绿色荧光表达亮，细胞形态正常的细胞，即单克隆转基因细胞系；所述细胞筛选培养基的配方为：42.5%GlutaMAX^TM、42.5%高糖DMEM、15%FBS。 

本发明还提供了上述构建方法构建得到的唾液腺组织特异性表达外源蛋白的转基因猪，可以自身表达葡聚糖酶-木聚糖酶-植酸酶等多种酶。 

本发明通过将猪密码子优化的重组双葡聚糖酶基因（Bg17/eg1314，来源Bispora sp.MEY-1/Bacillus licheniformis EGW039），猪密码子优化的酸性木聚糖酶基因（XYNB，来源黑曲霉），猪密码子优化的植酸酶基因（APPA,来源大肠杆菌）。分别去除其自身信号肽序列，人工添加猪腮腺蛋白信号肽序列(PSP signal piptide)，构建具有在腮腺组织分泌功能的重组酶。然后借助T2A、P2A、E2A等2A序列短肽，将4个基因融合到一起，得到融合基因BgEgXyAp。将其置于FVB小鼠调控上游区下游（即载体pPB-MusPSP-neo-EGFP的ASCI位点），构建成pPB-MusPSP-neo-EGFP-BgEgXyAp转基因载体。 

通过将pPB-MusPSP-neo-EGFP-BgEgXyAp转基因载体和转座酶混合，共转染猪胎儿成纤维细胞，经药物筛选，获得转基因细胞系。将获得的体细胞作为核供体细胞，注射到卵母细胞中，构建重构胚胎，经体外过夜培养，将其移至到同期发情处理的受体母猪输卵管内。受体母猪经妊娠和分娩，并进行转基因猪荧光检测，反向PCR，southern bloting，转基因猪唾液酶活检测。 

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： 

1、本发明从育种手段着手，一次性转移按照猪密码子优化的葡聚糖酶基因（Bg17/Eg1314），木聚糖酶（XynB），植酸酶（AppA）4 个耐酸基因。针对麦类原料葡聚糖酶，玉米木聚糖酶，和植物性饲料中的植酸酶都有水解作用，文献显示Bg17对羧甲基纤维素钠（CMC-Na）也有一定降解能力。利用猪唾液腺做为反应器，终生分泌，达到永久代替饲料中这些酶制剂的添加，更好的发挥这些酶的作用； 

2、在转基因技术上，本发明采用piggybac系统，解决转基因效率问题，转基因整合模式上由头尾串联多拷贝重组，变成了单位点单拷贝整合，更好的模拟生物基因的内环境，实现转基因动物快速鉴定和整合位点检测。本发明转基因猪，在其唾液腺中可以共表达重组葡聚糖酶、木聚糖酶、植酸酶3种酶，转入基因既可以水解植酸酶，又可以水解。目前主要饲料原料中非淀粉多糖等抗营养因子，比文献中提到转植酸酶转基因猪，更有优势，实现了多基因共表达技术，提高大片段基因转移效率问题。 

3、本发明构建得到的转基因猪还携带EGFP绿色荧光标记，便于检测，其loxp重组位点，也可以方便后期删除。 

附图说明

图1为本发明实施例1中Bg17，Eg1314，XYNB，APPA及融合基因BgEgXyAp在哺乳动物细胞的酶活测定结果图； 

图2为本发明实施例1中融合基因 

Bg17-E2A-Eg1314-flag-P2A-XynB- 

T2A-APPA-HA(BgEgXyAp)的重组构建示意图； 

图3为实施例1中克隆得到的MusPSP的PCR图谱，其中A为MusPSP上游调控区克隆(-11503bp～+1390bp)；B为MusPSP上游调控区克隆(-11325bp～+980bp)； 

图4为实施例1中Neo-T2A-EGFP的酶切鉴定电泳图，其中1、2、3分别代表T2A-EGFP（765bp），neo-T2A（835bp），neo-T2A-EGFP（1600bp）； 

图5为实施例1中pcDNA-Neo-T2A-EGFP的酶切鉴定电泳图，其中1、2代表pcDNA-Neo-T2A-EGFP的目的条带1590bp，3代表1和2的质粒对照； 

图6为实施例1中pPSPBGPneo-PB-XynB载体的酶切鉴定电泳图，其中M代表Marker2000；1、2为pPSPBGPneo-PB-XynB质粒对照，3、4分别代表该质粒XhoⅠ和NotⅠ的酶切结果； 

图7为实施例1中pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB-XynB载体的酶切鉴定电泳图，其中M代表DL DNA15000Marker；泳带1代表pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB-XynB载体质粒对照，2、3代表1的酶切结果，箭头所指为目的条带2935bp； 

图8为实施例1中小鼠腮腺蛋白上游调控区(MusPSP)克隆的构建示意图； 

图9为实施例1中MusPSP调控区片段1（-3143bp～+865bp）克隆质粒AscI,NotI酶切鉴定图谱；其中带1，2，3，4，5为不同克隆酶切鉴定，箭头指示目的带； 

图10为实施例1中MusPSP调控区片段2（-7849bp～-3143)AgeI、stuI酶切鉴定图谱；其中带1，2，3为不同克隆株酶切鉴定； 

图11为实施例1中MusPSP调控区片段3（-11805pb～-7849bp)AgeI酶切鉴定图谱；其中带1，2，3，4为不同克隆酶切鉴定； 

图12为实施例1中构建得到的PPB-MusPSP-neoEGFP-BgEgXyAp转基因载体的ASCI酶切鉴定图谱；其中M代表DL marker15000，带1，2，3，4不同克隆的酶切鉴定； 

图13为实施例1中构建得到的PPB-MusPSP-neoEGFP-BgEgXyAp转基因表达载体的结构图谱； 

图14为实施例2中构建得到的转基因猪的荧光检测图； 

图15为本发明实施例2的转基因猪的PCR检测图谱，其中Lane1-12号依次为M：DL2000Marker；P:质粒阳性对照（positive）；W:水；N:野生型猪（nagative）DNA；lane5-12:转基因猪DNA样品； 

图16为本发明实施例2的转基因猪F0代的Southern Bloting检测图谱，其中，M：地高辛标记的Marker；6C、10C4C分别为6、10、4个拷贝的阳性对照；607为阴性猪对照；605和707为转基因 阳性猪； 

图17为本发明实施例2的转基因猪605和707整合位点测序分析图； 

图18为实施例3中对转基因猪的唾液中葡聚糖酶，木聚糖酶，植酸酶酶活力的测定图。 

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。 

如无特殊说明，以下实施例中所使用的试剂均来源于市售，操作方法均为现有常规操作方法。 

实施例1转基因表达载体pPB-MusPSP-neo-EGFP-BgEgXyAp的构建 

包括以下步骤： 

1、目的基因的获得 

根据文献报道，筛选一系列在原核或者低等真核生物（酵母系统）高酶活的耐酸的葡聚糖酶基因（cel4T(脂环酸芽孢杆菌)、beta-1，3(4)-glucanase(拟青霉属)、Bispora sp.MEY-1源Bgl7A、地衣芽孢杆菌源eg1314、Citrobacter freundii来源的C-APPA、以及大肠杆菌来源的AppA、黑曲霉源的XYNB，将这些基因去除相应的自身信号肽序列，加上猪腮腺蛋白信号肽成熟肽序列，并根据猪密码子优化后经行人工合成。然后在哺乳动物表达系统猪肾PK15细胞表达，筛选能够在猪细胞分泌出具有高酶活力的基因，本发明筛选出适合在哺乳动物 系统分泌表达猪密码子优化后的葡聚糖酶基因Bg17(SEQ ID NO:1)和Eg1314(SEQ ID NO:2)，木聚糖酶基因(XynB、SEQ ID NO:3)，植酸酶基因(APPA、SEQ ID NO:4)。 

2、融合基因的构建 

利用E2A\P2A\T2A等2A多肽序列将这些基因构建重组β-葡聚糖酶基因-木聚糖酶基因-植酸酶基因融合基因(Bg17-E2A-Eg1314-flag-P2A-XynB-T2A-APPA-HA)，并在其Eg1314基因后添加flag-标签、在APPA基因后添加HA-标签便于后期对表达蛋白检测，构建的融合基因缩写为BgEgXyAp。Bg17，Eg1314，XYNB，APPA及融合基因BgEgXyAp在哺乳动物细胞的酶活测定结果如图1所示。图1显示经猪密码子优化和哺乳动物细胞表达筛选获得4种可在哺乳动物系统表达具有生物学功能的酶基因Bg17，Eg1314，XYNB，APPA，将4个基因经添加检测标签和融合重组后得到BgEgXyAp，具有4个酶的生物功能。 

请参阅图2，为β-葡聚糖酶基因-木聚糖酶基因-植酸酶基因融合基因Bg17-E2A-Eg1314-flag-P2A-XynB-T2A-APPA-HA(BgEgXyAp)的重组构建示意图，包括以下步骤： 

(1)、以N-3G-1F(SEQ ID NO:27)，Bg17-E2A-R(SEQ ID NO:28)作为引物，pUC-Bg17-a3-eg1314-flag（SEQ ID NO:36，委托南京金斯瑞人工合成）为模板扩增Bg17-E2A(片段1)； 

(2)、以E2A-Eg-1F(SEQ ID NO:29)，E2A-2R(SEQ ID NO:30)作为引物，pUC-Bg17-a3-eg1314-flag（SEQ ID NO:36，委托南京金斯瑞 人工合成）为模板扩增E2A-Eg1314(片段2)； 

(3)、利用重叠延伸PCR，以N-3G-1F(SEQ ID NO:27)，E2A-2R(SEQ ID NO:30)为引物，以混合Bg17-E2A(片段1)和E2A-Eg1314(片段2)为扩增模板（片段1：片段2=1:1），获得Bg17-E2A-Eg1314-flag； 

以上(1)-(3)中PCR扩增的反应程序为：98℃1min；98℃10s；60℃5s；72℃1min;35个循环；72℃2min。 

(4)、以N-XYB3-3F(SEQ ID NO:31)，N-XYB3-4R(SEQ ID NO:32)为引物，以pCD-XYNB(基本方法:将XYNB基因片段插入到pcDNA3.1（invtrogen）载体的EcoRI和XhoI位点）为模板，扩增得到P2A-XynB-T2A； 

(5)、以N-APPA-5F(SEQ ID NO:33)，N-APPA-6R(SEQ ID NO:34)，以pCD-APPA(基本方法:将APPA基因片段插入到pcDNA3.1（invtrogen）载体的EcoRI和XhoI位点）为模板，扩增得到T2A-APPA-HA； 

(6)、以N-3G-1F(SEQ ID NO:27)，N-APPA-6R(SEQ ID NO:34)，以PCR扩增产物：Bg17-E2A-Eg1314-flag（步骤3）、P2A-XynB-T2A（步骤4）、T2A-APPA-HA（步骤5）按摩尔比1:1:1混合后取1～5ul进行扩增。获得β-葡聚糖酶基因-木聚糖酶基因-植酸酶基因融合基因Bg17-E2A-Eg1314-flag-P2A-XynB-T2A-APPA-HA(BgEgXyAp)。 

以上(4)-(6)中PCR扩增的反应程序为：98℃1min；98℃10s；60℃5s；72℃2min;35个循环；72℃2min。 

3、表达载体pPB-MusPSP-neo-EGFP的构建 

(1)、小鼠腮腺蛋白上游调控区（PSP）的克隆（包括腮腺蛋白转录起始位点及第一内含子）

取FVB品系小鼠尾组织样品，抽提其基因组DNA，接着以FVB小鼠基因组DNA为模板，采用KOD-FX聚合酶(TOYOBO,日本)进行PCR扩增。首先采用引物mpsp3497-F1(SEQ ID NO:23)，mpsp16390-R1(SEQ ID NO:24)进行第一次PCR扩增，得到小鼠腮腺蛋白上游调控区(-11503bp～+1390bp)，结果如图3A所示；然后采用嵌套引物mPSP-3675-F2(SEQ ID NO:25)和mPSP-15980-R2(SEQ ID NO:26)，以第一次扩增的产物为模板，进行第二次PCR扩增，扩增小鼠腮腺蛋白区域（-11325bp～+980bp），结果如图3B所示，得到克隆 FVB品系腮腺蛋白上游调控区MusPSP，其中引物序列如表1所示，MusPSP与文献报道的序列对比的分析结果见表2。经与NCBI中提交的鼠PSP腮腺蛋白上游调控区增强子区（U73190.1,X68699.1）序列比对分析，两个增强子区相识性达99%，核心启动子区（转录起始位点上游300bp）与小鼠数据库（UCSC）比对结果完全一致，分析结果显示本研究获得MusPSP调控区与Golovan,S.P等（2001）制备转基因猪和小鼠采用的腮腺蛋白上游调控区并不是同一来源的。 

表1小鼠腮腺蛋白上游调控区（PSP）的克隆引物 

PCR的反应体系如下： 

反应程序:第一次PCR扩增的反应程序为94℃2min；98℃10s，74℃13min，5cycles；98℃10s，72℃13min,5cycles；98℃10s，70℃13min,5cycles;98℃10sec,68℃13min,30cycles;68℃7min。所述第二次PCR扩增的反应程序为94℃2min；98℃10sec,68℃13min,30cycles；68℃7min。 

表2克隆MusPSP序列与文献报道的序列的对比结果 

(2)、构建融合pcDNA-Neo-T2A-EGFP双标记载体，可用于后期删除的可视绿色荧光蛋白(EGFP)与新霉素抗性基因（neo）融合基因

a、扩增neo 

以质粒pcDNA3.1（+）(invitrogen公司)为模板，设计引物EcoRⅠ-neo-1(SEQ ID NO:5)，neo-T2A-2(SEQ ID NO:6)扩增neo基因。PCR反应程序：98℃2min；98℃10s，68℃50s；35个循环；72℃10min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。接着用EasyPure PCRPurification Kit(北京全式金生物技术有限公司)对PCR产物纯化（简称―过柱纯化），去除引物和其他杂质； 

b、扩增EGFP 

以质粒pT2AL200R175-CAGGS-EGFP(日本，The National Institute of Genetics中心，Koichi Kawakami教授馈赠)模板，设计引物T2A-EGFP-3(SEQ ID NO:7)，EGFP-4(SEQ ID NO:8)扩增EGFP。其中，上游引物T2A-EGFP-3(SEQ ID NO:7)中有15bp左右与neo-T2A-2(SEQ ID NO:6)重叠序列，去掉neo的终止密码子加入GCC三个碱基，下游引物有限制性内切酶XbaⅠ酶切位点和保护碱基。PCR反应程序和产物纯化条件与步骤a相同。 

c、neo-EGFP融合基因 

经纯化回收neo和EGFP的PCR产物进行浓度测定，调整浓度后，各取1μL混合后作为模板进行PCR扩增。PCR反应程序：98℃，2min；98℃，10s；68℃，1min40s；35个循环；72℃，10min。得到neo-EGFP融合基因。酶切鉴定，鉴定结果如图4所示，酶切电泳图 目的条带大小与预期一致。 

d、pcDNA-Neo-T2A-EGFP载体构建 

把上述通过重叠PCR得到的neo-EGFP融合基因过纯化柱，去除引物和PCR反应废液。用EcoRⅠ(Fermentas公司)和 XbaⅠ(Fermentas公司)双酶切pcDNA3.1（+）质粒和PCR产物neo-EGFP融合基因。酶切产物过柱纯化回收。用Ligation Kit Ver.2.0连接试剂盒(Takara公司)于16℃连接仪中恒温过夜连接。最后构建成pcDNA-Neo-T2A-EGFP载体，并进行酶切鉴定，鉴定结果如图5所示，经电泳检测酶切图谱条带大小与预期完全一致。 

在步骤(2)中，合成的引物序列如表3。 

表3构建融合neo-EGFP双标记载体所采用的引物 

(3)、piggyBac转座系统元件克隆与载体构建

以pPB-UbC-EGFP-neo(Wellcome Trust Sanger中心赠送)为模板，分别用引物NotⅠ-5-PB-F(SEQ ID NO:9)和NotⅠ-5-PB-R(SEQ ID NO:10)，XhoⅠ-3-PB-F(SEQ ID NO:11)和XhoⅠ-3-PB-R(SEQ ID NO:12)，用TaKaRa LA Taq酶PCR扩增NotⅠ-5-PB--NotⅠ，XhoⅠ-3-PB-XhoⅠ，分别用相应的限制性内切酶酶切后，连在载体pPSPBGPneo-XynB，对其完成piggyBac转座载体改造，改造后，命名为pPSPBGPneo-PB-XynB，其酶切鉴定结果见图6所示，分别用XhoⅠ和NotⅠ酶切pPSPBGPneo-PB-XynB酶切结果显示，得到285bp和349bp目的条带，电泳两条带大小与预期相符。 

PCR的反应体系：按下列组份配制PCR反应液。 

PCR反应程序为：94℃30S；55℃30S，35个循环；72℃30S；72℃3min，30循环。 

以pcDNA-neo-T2A-EGFP载体为模板，以引物infu-CMV-neo-EGFP-R(SEQ ID NO:13),infu-CMV-neo-EGFP-F(SEQID NO:14)扩增，得到infusion-CMV-neo-T2A-EGFP片段,切胶纯化回收备用。 

用ClaⅠ和BglⅡ限制酶双酶切pPSPBGPNeo-PB-XynB片段，酶切产物做琼脂糖凝胶电泳，对目的片段切胶纯化。最好应用Advantage PCR Cloning Ki试剂盒(Clontech公司)将infusion-CMV-neo-T2A-EGFP片段重组到pPSPBGPNeo-PB-XynB载体的两个loxp位点中间中，得到pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB-XynB载体，其酶切鉴定结果见图7所示，质粒用AscⅠ和BglⅡ双酶切鉴定的电泳结果，电泳条带大小与预期相符，成功获得带有neo-EGFP双标记和木聚糖酶基因（XynB）的pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB-XynB转座子载体。 

PCR反应体系如下： 

PCR反应程序为：98℃2min；98℃10s；68℃4min；35个循环；72℃10min。 

在该步骤中，piggyBac转座子主要元件克隆和正反鉴定的引物如表4所示，pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB-XynB载体构建引物如表5所示。 

表4piggyBac转座子主要元件克隆和正反鉴定的引物 

表5pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB-XynB载体构建引物 

(4)、腮腺蛋白上游调控区与loxP-CMV-neoEGFP-loxp和PiggyBac系统融合

首先利用引物P11160-ASCIF(SEQ ID NO:15)，P407-AgeIR(SEQ ID NO:16)，以pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB-XynB载体为模板，用 Max DNA Polymerase酶（Takara公司）扩增载体中的pPB-lox-neoEGFP-loxp片段，并人工添加AgeI限制性内切酶位点，纯化后备用，即为新载体骨架。PCR反应程序为：98℃1min；98℃10s；60℃5s；72℃2min;35个循环；72℃2min。由于小鼠腮腺蛋白启动子太大，很难在与其它组件构建在一起，本发明尝试一种新的方法，来完成载体构建，构建方法请参阅图8。 

第一步：首先利用引物inf-AgeI-8700F(SEQ ID NO:17)，inf-AscI-12540R(SEQ ID NO:18)，以步骤(1)得到的小鼠腮腺蛋白上游调控区的PCR扩增片段为模板，用Max DNA Polymerase酶（Takara公司）扩增MusPSP下游4009bp片段（片段1），加上与新载体骨架pPB-lox-neoEGFP-loxp中的重组序列，将其先重组到载体上，其酶切鉴定结果见图10所示，电泳条带大小与预期 （4009bp）相符，经测序验证，成功完成片段1与新载体骨架pPB-lox-neoEGFP-loxp连接。PCR反应程序：98℃1min；98℃10s；60℃5s；72℃2min;35个循环；72℃2min。 

第二步：然后利用MusPSP片段1中的酶切位点StuI，设计引物inf-AgeI-4090F(SEQ ID NO:19)，StuI-8763R(SEQ ID NO:20)，以步骤(1)得到的小鼠腮腺蛋白上游调控区的PCR扩增片段为模板，用 Max DNA Polymerase酶（Takara公司）扩增4706bp的片段2。将其重组到第一步获得的中间载体片段1的StuI位点，其酶切鉴定结果见图11所示，酶切电泳条带大小与预期4706bp相符，经测序验证，成功完成片段2的克隆。PCR反应程序：98℃1min；98℃10s；60℃5s；72℃2min;35个循环；72℃2min。 

第三步：设计引物inf-AgeI-440F(SEQ ID NO:21)，inf-AgeI-4000R(SEQ ID NO:22)，以步骤(1)得到的小鼠腮腺蛋白上游调控区的PCR扩增片段为模板，用Max DNA Polymerase酶（Takara公司）扩增3956bp的片段3，利用人工添加的AgeI位点，将最后3956bp的片段重组到第二步获得中间载体上，完成整个载体构建pPB-MusPSP-neo-EGFP，即为本实施例的腮腺组织特异性的转基因载体，其酶切鉴定结果见图12所示酶切电泳条带大小与预期相符，经测序验证，成功完成片段3的克隆。预留的ASCI位点可供任何基因片段插入。PCR反应程序：98℃1min；98℃10s；60℃5s；72℃2min;35个循环；72℃2min。 

在该步骤中，采用的引物如表6所示。 

表6pPB-MusPSP-neo-EGFP载体构建中所采用的引物 

4、转基因表达载体PPB-MusPSP-neo-EGFP-BgEgXyAp的构建 

将融合基因BgEgXyAp用in-fusion重组酶（Clontech公司）重组到PPB-MusPSP-neo-EGFP的ASCI位点，成功构建4基因共表达腮腺特异表达的多基因转移载体PPB-MusPSP-neoEGFP-BgEgXyAp，序列号为SEQ ID NO:35。PPB-MusPSP-neoEGFP-BgEgXyAp转基因载体的ASCI酶切鉴定图谱如图12所示，从图12可知，酶切得到的融合基因的大小约为4171bp，与预期一致。转基因表达载体的结构图谱如图13所示。 

实施例2利用实施例1构建得到的转基因载体构建转基因猪 

1、转基因细胞的筛选 

利用BXT电转仪，将构建好的pPB-MusPSP-neo-EGFP-BgEgXyAp载体与转座酶质粒PCMV-mPB（Wellcome Trust Sanger Institute馈赠，申请人已经去除其中neo基因）按照摩尔比1:1比例转染猪胎儿成纤维细胞（公猪），转染条件：310V，脉冲时间1ms，脉冲次数3次。电转染后的细胞铺板，36小时后，按照1:6传代。细胞筛选培养基配制方法42.5%GlutaMAX^TM(life公司)+42.5%高糖DMEM（life公司）+15%FBS，首先在细胞筛选培养基中添加G418300ug/ml，对电转染后的细胞筛选5天后，改用200ug/ml浓度继续筛选10天，接着改为80ug/ml维持筛选，同时在 15%FBS肽牛血清培养基中添加2.5-5ng/mL BFGF(basic fibroblast growth factor)，得到带绿色荧光的细胞团，等这些细胞团长成片后，用枪头小心刮去周围没荧光细胞，最好用0.05%胰酶消化传代，传至2-3代后，在检测绿色荧光表达。挑选绿色荧光表达亮，细胞形态正常的细胞作为核移植供体细胞备用。利用该方法可以快速获得转基因细胞系，且细胞边沿平滑，细胞结构正常和质量好。而一般方法获得筛选细胞，细胞较大，细胞内有空泡，呈现老化状态。 

2、猪卵母细胞－颗粒细胞复合体（COCs）的采集及体外成熟培养 

从猪屠宰场（广东省天河肉联厂）收集猪卵巢，放入含有1%双抗（双抗为life technology的产品：Penicillin-Streptomycin-Glutamine）的28～37℃生理盐水中并于4h内送回实验室。用37℃的生理盐水清洗后拿带有18号针头的10mL注射器抽取直径为2～6mm卵泡中的卵母细胞。在显微镜下挑选出细胞质均匀、卵丘致密且包裹3层以上的卵丘细胞-卵母细胞复合体（Cumulus oocyte complexes，COCs），用M199成熟培养液洗涤后，转入提前置于CO₂培养箱中孵育4h以上的加有500μLM199培养液的四孔板内，在39℃、5%CO₂、饱和湿度的培养箱中培养42～44h。 

3、成熟培养后COCs上颗粒细胞去除和成熟卵的挑选 

卵母细胞成熟后，将COCs转移到含透明质酸酶的离心管中用移液器吹打后将液体转移到30mm培养皿中，用口吸管将脱去卵丘的卵母细胞拣出。洗涤后于实体显微镜下挑选排出第一极体的卵母细胞。 

4、供核细胞的准备 

用胰酶消化后离心洗涤，用HN操作液(无钙H-NCSU-23显微操作液)将细胞沉淀重悬并吹打均匀后用作核供体。 

HN操作液的配方如下(所有试剂均为分析纯级别，购自广州康龙生物科技有限公司)： 

5、卵母细胞的去核与注核 

挑选已排出第一极体且形态良好的卵母细胞，用外径为100～120μm的固定针，内径为15～20μm的去核针采用盲吸法去核：在65mm无菌培养盘中加入约50μL的操作液滴，并用石蜡油覆盖，然 后将30个左右的卵母细胞和适量的体细胞移入其中。用固定针固定住卵母细胞，用去核针拨动卵母细胞使极体在大约5点钟的位置。用去核针沿3点钟位置刺进去，去除极体及附近的胞质，之后把针撤出并将极体和胞质吐出，挑选一个体细胞注入卵周隙中即完成胚胎重构过程。重构胚胎放入胚胎培养液中恢复培养1h。 

6、卵母细胞和体细胞的融合及激活 

将重构卵分批转移到融合液中平衡2min后用融合/激活液洗涤3遍，按每批5～8个放入已铺满融合液的融合槽内，用实心玻璃针拨动重构卵使供核细胞-受体卵的细胞膜接触面与电极平行，施加120v/mm,100μs,2DC的直流电脉冲诱导融合同时激活重构胚，接着用胚胎培养液洗涤3遍后立即转入矿物油覆盖的胚胎培养液中，置于39℃，5%CO₂饱和湿度的培养箱中，4h后在体视显微镜下判定融合情况。将已融合的重构胚用胚胎培养液洗涤5遍后，转入预平衡好的胚胎培养液，置于39℃，饱和湿度，低氧（5%O₂+5%CO₂+90%N₂）的条件下培养。 

7、手术移植克隆胚生产转基因猪 

受体母猪为广东省华农温氏畜牧股份有限公司的优质母猪。本实施例采用输卵管移植法，胚胎发育处于为2细胞或4细胞期时进行移植。手术当天对母猪禁食，手术前保定母猪并对它进行全身静脉麻醉。手术部位选择在倒数第二对乳头中间部位，先用清水清洗手术部位及四周，擦干后先用碘酒大范围消毒，再用75%酒精脱碘。盖上手术布同时暴露手术部位，沿腹中线切开皮肤和皮下肌肉，然后分离皮下脂 肪和腹膜，手探入腹腔，慢慢牵引出子宫和输卵管，检查排卵情况。将装有胚胎的吸胚管从输卵管伞口插入，小心将胚胎吹入。然后恢复子宫和输卵管到腹腔内。常规手术缝合，术后连续4天注射抗生素消炎。即能得到自身分泌葡聚糖酶-木聚糖酶-植酸酶转基因的转基因猪。 

8、转基因猪出生与检测 

转基因小猪阳性鉴定，用蓝色光灯直接照射检测，转基因阳性猪可发绿色荧光，如图14所示，然后对其进行PCR，Southern bloting进行进一步分析，利用反向PCR技术，检测其整合到基因组内位点。转基因猪PCR检测图谱如图15所示，经PCR检测，本实施例的克隆猪获得2头转基因原代(F0)，即950605（简称605，出生后一周内死亡）,950707（简称707），且该转基因个体不携带AmP^r抗性基因和转座酶(PCMV-mPB)基因序列。经PCR检测，印证荧光检测结果，只有707和605猪为阳性，且质粒骨架部分Amp^r和辅助质粒PBase检测都为阴性。转基因猪F0代Southern Bloting检测图谱如图16所示，Southern bloting结果确认转基因单拷贝整合；反向PCR检测转基因猪605和707的整合位点，如图17所示，找到该位点位于猪基因组7号染色体Legumain基因上游。 

实施例3实施例2构建得到的转基因猪的转基因表达效果检测 

两个月龄后，对实施例2构建得到的转基因猪的转基因表达效果进行了检测，主要是检测了转基因猪（其中707号猪）的唾液中葡 聚糖酶（β-glucannase），木聚糖酶(Xylanase)，植酸酶(phytase)酶活力。检测方法为：用海绵或者橡胶棒让小猪啃咬，采集小猪唾液50ul，在39.5℃，乙酸-乙酸钠缓冲液（HAC-NaAC）中测定，每种酶按照3个生物学重复，3个技术重复测定，取3头同舍相同日龄非转基因猪唾液混合后做对照(野生型)。检测其中重组β-葡聚糖酶，木聚糖酶，植酸酶酶活性。采用mean±S.D.作统计分析。酶活测定结果如图18所示，从图18可知，转基因707号猪唾液中的葡聚糖酶（β-glucannase），木聚糖酶(Xylanase)，植酸酶(phytase)酶活力均远远高于非转基因猪的唾液中的含量，表明本发明构建得到的转基因猪的转基因表达效果很好。 

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。