骨骼肌特异性表达猪FSⅠ-Ⅰ转基因猪胚胎成纤维细胞克隆的构建与鉴定

摘要

目的:构建骨骼肌特异性表达猪FS Ⅰ-Ⅰ真核表达载体,转染猪胚胎成纤维细胞并筛选整合有FSⅠ -Ⅰ基因的细胞克隆,为研究FSⅠ-Ⅰ对猪骨骼肌的影响奠定基础.方法:通过RT-PCR方法从猪骨骼肌中扩增FS A(包含FS N端和结构域FS Ⅰ)和结构域FSⅠ；利用PCR方法分别从鼠基因组、人血液基因组和pcDNA3.1(+)载体上扩增出MCK增强子、ACTA 1启动子和BGHpolyA.将上述4个片段分别连接到真核表达载体pGKneotpAlox2上,构建骨骼肌特异性表达FS Ⅰ-Ⅰ(包含FS N端和2个连续FS Ⅰ结构域)的载体pGK-MCK-ACTA 1-FS Ⅰ -Ⅰ -BGHpolyA；用FuGENE(R) HD转染猪胚胎成纤维细胞,经药物G418筛选和PCR鉴定阳性克隆.结果:成功构建骨骼肌特异性表达猪FSⅠ-Ⅰ的表达载体pGK-MCK-ACTA1 promoter-FS Ⅰ -Ⅰ -BGHpolyA,并成功整合到猪胚胎成纤维细胞的基因组中,获得了整合有目的基因FSⅠ-Ⅰ的猪胚胎成纤维细胞克隆.结论:获得了骨骼肌特异性表达猪FS Ⅰ-Ⅰ的猪胚胎成纤维细胞克隆,为通过核移植方法获得表达FSⅠ -Ⅰ转基因猪提供了供体细胞.