用于检测新布尼亚病毒的核酸和实时荧光定量检测试剂盒

摘要

本发明涉及用于PCR检测新布尼亚病毒的核酸和实时荧光RT-PCR试剂盒，其核酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；其用于检测新布尼亚病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，包括2×RT-PCR缓冲液，25×RT-PCRenzymeMix，上下游引物，探针，阴性对照，阳性对照。提供的实时荧光定量PCR检测试剂盒使用方便，试剂盒所用的试剂少，大大简化了操作过程，减少了在操作过程的污染，检测特异性强，灵敏度高，适用于快速检测新型蜱传新布尼亚病毒。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体设计一种用于检测新布尼亚病毒的核酸和实时荧光RT-PCR检测试剂盒。

背景技术

新布尼亚病毒（SFTSV）属于布尼亚病毒科白蛉病毒属，是一种有包膜分阶段的负链RNA病毒。病毒基因组包括L、M、S三个片段，分别编码RNA依赖的RNA聚合酶和包膜糖蛋白G1、G2以及核蛋白。

中国疾控中心病毒病所通过大量的调查研究，明确了新布尼亚病毒致病的临床表现和流行病学特征。比如患者的主要症状是发热、消化道症状、血小板减少、白细胞减少、肝肾功能损害，部分患者有出血表现。该病主要发生在丘陵、山区，患者以成年农民为主，部分患者被蜱叮咬过。发病的流行期为4-10月，流行高峰为5-7月，这也是蜱虫活跃的时间段。同时经过实验室检测，在200多位病人的血清标本中，发现70%左右病人有新布尼亚病毒感染的证据，就是分离到病毒、检出了病毒的基因和/或抗体。这些患者来自湖北、河南、山东、江苏、安徽和辽宁，一共6个省，分布很广，中东部和东北部都有，这也提示新布尼亚病毒的传播范围可能很广泛。

目前认为急性期病人血液可能有传染性，已有部分证据表明该病可能人传人。

作为自然疫源性疾病病原体以及该病的广泛分布和传染性，提示了境外也存在该病原体的可能性。发热板血小板减少综合征病毒作为我国自主发现的新发传染病病原体，世界卫生组织也对此高度关注，并在国内启动了《发热伴血小板减少综合征危险因素调查》等多个研究项目，并鼓励开展中国周边地区该病的监测调查工作，口岸地区作为传染病防控的重要节点和关口，开展蜱传新布尼亚病毒检测、监测等相关研究工作，可以提供未来该病国际传播事件重要的科学依据。同时，也可能通过口岸截获蜱媒、发热人员等发现该病原体境外存在的证据。

SFTSV为我国最新发现并分离的病毒，国外未见相关病毒的报道，但不能排除国外输入病原的危险因素存在，国内相关检测试剂盒相对缺乏，常规的病毒分离技术和免疫学检测技术，检测分离鉴定又费时费力，可快速、灵敏、特异性检测SFTSV的试剂盒还未见有商品化产品。

发明内容

本发明的主要目的是提供一组用于检测新布尼亚病毒的核酸序列。

本发明还提供一种用于检测新布尼亚病毒的实时荧光定量RT-PCR试剂盒及其检测方法。

本发明采用以下技术方案：

一种用于RT-PCR检测新布尼亚病毒的引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

一组用于检测新布尼亚病毒的实时荧光定量RT-PCR核酸，该组核酸包括引物对、探针和作为阳性对照的扩增产物，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述作为阳性对照的扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

一种用于检测新布尼亚病毒的实时荧光RT-PCR的试剂盒，该试剂盒包括：

2×RT-PCR缓冲液；

25×RT-PCRenzymeMix；

上游引物：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

下游引物：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

探针：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述探针5＇端连接荧光基团，3＇端连接荧光淬灭基团；

阴性对照：无核酸酶灭菌超纯水；

阳性对照：携带有扩增产物的质粒DNA，所述扩增产物的核苷酸序列如SEQID No.4所示。

如上所述的试剂盒，优选地，所述2×RT-PCR缓冲液为2×One-step RT-PCRbuffer。

如上所述的试剂盒，优选地，所述探针与荧光基团相连，所述荧光基团为FAM、CY3中任一一种，所述淬灭基团为BHQ1、TAMARA、BHQ2中任一一种。

如上所述的试剂盒，优选地，在应用该试剂盒时，按照以下终浓度配置实时荧光定量PCR反应液：

1×RT-PCR buffer；

1×RT-PCRenzymeMix；

0.8μmol/L上游引物；

0.8μmol/L下游引物；

0.12μmol/L探针。

利用上述实时荧光定量RT-PCR试剂盒检测新布尼亚病毒扩增条件可采用：反应条件为逆转录45℃，25min，95℃，10min，然后95℃，15sec和45℃，45sec反应40个循环。

本发明的有益效果在于：

本发明建立了比较高效、灵敏的新布尼亚病毒的快速检测方法，提供实时荧光RT-PCR检测试剂盒。提供的检测试剂盒使用方便，操作简便，自动化程度高，有效替代传统PCR利用电泳观察结果，且试剂盒所用的试剂少，大大简化了操作过程，减少了在操作过程的污染，检测效果好，特异性强，灵敏度高。

本发明的试剂盒和方法适用于蜱传新布尼亚病毒检测、监测等相关研究工作和对蜱媒、发热人员等的新布尼亚病毒筛查与检测。针对出入境检验检疫的特点研究各口岸蜱传新布尼亚病毒的分布及输入输出情况。开展蜱传新布尼亚病毒检测、监测等相关研究工作，可以提供未来该病国际传播事件重要的科学依据。同时，也可能通过口岸截获蜱媒、发热人员等发现该病原体境外存在的证据。

附图说明

图1本发明试剂盒实时荧光定量PCR灵敏度的检测结果。

图2本发明试剂盒实时荧光定量PCR的标准曲线。

图3本发明试剂盒实时荧光定量PCR的特异性检测结果。

具体实施方式

以下结合具体实例对本发明做进一步详细说明，并非对本发明的限定，本发明的实施上方式并不限于此，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

实施例1检测新布尼亚病毒引物设计

在本发明引物和探针设计中，筛选的新布尼亚病毒是NCBI公布的所有新布尼亚病毒S基因全长序列，利用DNASTAR软件进行序列的同源性比对。首先在比对的序列保守区设计上下游引物，根据引物设计原理，在保守区之间设计上游和下游引物及探针，并提交GENEBANK检测探针的特异性。引物和探针在合成时探针5＇端连接FAM荧光基团和3＇端连接BHQ1淬灭基团。设计的引物和探针的序列见表1。

表1引物和探针序列

Blast同源性分析显示，选择的引物，其序列为新布尼亚病毒的特异性序列，与其序列无同源性，引物扩增的长度为110bp，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

实施例2新布尼亚病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒制备

新布尼亚病毒实时荧光RT-PCR检测试剂和包括以下成分：

2×RT-PCR缓冲液；

25×RT-PCRenzymeMix；

上游引物：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

下游引物：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

探针：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

阴性对照：无核酸酶灭菌超纯水；

阳性对照：携带有扩增产物的质粒DNA，所述扩增产物的核苷酸序列如SEQID No.4所示。

其中，所述2×RT-PCR缓冲液和25×RT-PCRenzymeMix可选用ABI公司AgPath-IDTM One-step RT-PCR Kit；引物、探针、质粒委托上海英骏生物技术有限公司合成，探针在合成时探针5＇端连接FAM荧光基团和3＇端连接BHQ1淬灭基团。

实施例3新布尼亚病毒实时荧光RT-PCR检测的方法

本发明检测新布尼亚病毒方法包括以下步骤：

（1）核酸提取

病毒RNA提取选用QIAamp Mini kit52906病毒RNA提取试剂盒。

（2）RT-PCR扩增

采用实施例2制备的试剂盒配置反应体系，其组分及其体积见表2。

表2反应体系

扩增条件：采用以下扩增条件。

例如

本发明所述的方法中，探针与荧光和淬灭基团相连，所述荧光-淬灭基团为FAM-BHQ1，其它荧光淬灭基团组合也同样适用，比如，CY3-TAMARA、CY3-BHQ2、FAM-BHQ2、CY3-BHQ1等。

上述RT-PCR反应可使用的仪器包括ABI实时PCR系统（例如7000，7300，7500，7900等）；BioRad实时PCR检测系统、Stratagene定量多聚酶链反应仪（例如MX4000，MX3000，MX3005）。

实施例4本发明试剂盒灵敏度的检测

选择已有的新布尼亚病毒HB29株核酸的全基因组作为标准品，将新布尼亚病毒病毒培养液1×10²pfu/mL提取RNA，将提取的RNA从10^-2依次稀释到10^-6进行检测；新布尼亚病毒HB29株由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所提供。

1)阴性对照：新布尼亚病毒阴性的蜱RNA；

2)NTC：无核酸酶水；

3)反应体系按照实施例3中表2进行配制。

检测结果如图1所示。图1中1-4曲线从左往右分别为标准品用无核酸酶水浓度稀释度为10^-2-10^-5扩增的曲线。我们从图中可以得出结论引物和探针检测阳性标准品的最低检出限为10^-5。

实施例5本发明试剂盒的特异性检测

1)选择新布尼亚病毒HB29株做为阳性对照（PTC）；

2)阴性对照：无核酸酶水；

3)模板：选择新布尼亚病毒阴性的蜱RNA、汉坦病毒RNA、西尼罗病毒RNA、马脑炎病毒RNA、登革热病毒RNA、马秋波病毒RNA进行非特异性测试，上述模板均由中国检验检疫科学研究院卫生检疫研究所提供。

4)反应体系按照实施例3中表2进行配制。

检测结果如图2，结果表明，所建立的新布尼亚病毒通用型实时荧光PCR方法及其试剂盒对于新布尼亚病毒的宿主RNA及其他病毒没有特异性的扩增，表明引物及探针设计特异性强。

实施例6新布尼亚病毒实时荧光PCR标准曲线的制作

1)选择新布尼亚病毒HB29株做为标准品，将其浓度从依次稀释到10^-6，选择10^-2-10^-5作为模板；

2)阴性对照：新布尼亚病毒阴性蜱RNA；

3)反应体系按照实施例3中表2进行配制。

检测结果如图3所示，新布尼亚病毒通用型实时荧光PCR的标准曲线为：R²=0.9893；其中，X轴表示相应的校正后报告荧光强度的对数，Y轴循环次数。

实施例7：本发明试剂盒检测未知样本

1)对采集的未经检测的蜱样本样本进行检测，考察引物探针的特异性问题。

2)对采集蜱样本进行检测，考察方法的可靠性；同时选择中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所提供的RT-PCR做对照。

3)阴性对照：新布尼亚病毒阴性蜱RNA；

4)反应体系按照实施例3中表2进行配制；

5)检测结果见表3。

表3未知样品检测结果

结果分析：利用实验蜱106份，进行RNA提取，后者作为模板，利用本发明试剂盒进行实时荧光RT-PCR反应，分两次进行，每次实验均设有阳性对照及阴性对照，结果显示106份蜱均没有扩增曲线，均无Ct值，由此可知本发明的试剂盒稳定性强，检测结果可靠。